文摘

背景。显示血管动脉外膜包含祖细胞和参与血管重塑。祖细胞被招募到小鼠静脉血栓,促进新血管形成。我们假设人类大隐静脉的外膜的祖细胞(HGSV-AdPC)提高静脉血栓形成的决议通过新生血管形成。方法。人类大隐静脉(HGSV)从那个大隐静脉曲张的患者和免疫组织化学分组,或切碎的祖细胞的主要文化,或放置在十二烷基硫酸钠去细胞的解决方案。收集人体静脉血栓从大隐静脉曲张的患者和浅表血栓性静脉炎。腹主动脉肾下的新西兰白兔替换为插入式脱细胞血管,和移植的明显证实了超声检查。动物静脉血栓在左肾下的腔静脉的老鼠用缝线缝合结扎和眼科迫使这部分的剪裁。后HGSVs被胶原酶消化,CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC孤立在流式细胞仪系统,与CM-Dil贴上标签,移植肾下的动脉外膜的裸体小鼠的腔静脉。血栓组织面积的百分比计算血栓区域组织率。血栓细胞、内皮细胞和巨噬细胞在血栓计入部分。细胞涂片和冻结部分人类的隐静脉和静脉血栓贴上Sca1, CD117、CD34, Flk1, CD31、F4/80抗体。CD34的⁺CD117⁺HGSV-AdPC在内皮生长培养基培养与血管内皮生长因子(VEGF)诱导内皮细胞分化和分析与实际time-PCR,免疫印迹,管形成化验。结果。CD34免疫组织化学染色显示⁺CD117⁺细胞位于HGSVs动脉外膜,和许多CD34⁺和CD117⁺细胞在人类出现静脉血栓。祖细胞的数量在7天的边际地区小鼠血栓是Sca1⁺≈21%,CD34⁺≈12%,CD117⁺≈9%,Flk1⁺≈5%。许多CD34⁺外膜的祖细胞迁移到脱细胞血管。流式细胞仪显示,CD34的数量⁺CD117⁺HGSV-AdPC主要培养细胞 。后CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC被移植到裸体小鼠的动脉外膜腔静脉和静脉血栓,组织率、核细胞计数、血栓的内皮细胞,巨噬细胞细胞显著增加。移植的CD34⁺CD117⁺动脉外膜的HGSV-AdPC穿过血管壁,进入静脉血栓,并分化成内皮细胞。CD34的⁺CD117⁺HGSV-AdPC培养基中存在VEGF-promoted内皮细胞标记的基因和蛋白质表达在体外和感应管形成。结论。HGSV-AdPC可以穿过静脉壁和迁移从动脉外膜进入静脉血栓。增加HGSV-AdPC动脉外膜的增强静脉血栓的决议通过分化成内皮细胞的新生血管形成。

1。介绍

静脉血栓形成是一种常见的疾病,近年来发病率增加年度变化从104年到183年每100000人年的欧洲1,2]。溶栓和抗凝治疗静脉血栓形成的主要治疗策略,但对静脉血栓的影响有限,导致严重出血的风险。目前,高效的方法结合禁忌症抗凝和溶栓,如激活胃肠溃疡或脑部出血,需要静脉血栓形成患者。研究者们越来越关注探索新的治疗方法解决静脉血栓形成早期,这有助于显著减少静脉瓣膜纤维化以及postthrombus综合症的发病率(3,4]。

治疗静脉血栓形成主要取决于其缓慢和自然的解决过程(5,6]。静脉血栓形成的自然解决机制在活的有机体内取决于血栓组织,其中中性粒细胞,巨噬细胞,和祖细胞进入血栓,血栓的主体内,新血管形成。Modarai等人发现骨骨髓来源的内皮祖细胞被征召进老鼠促进新血管形成的血栓,但细胞并没有发现在新血管通道(7]。祖细胞和粒细胞集落刺激因子动员的分辨率增强静脉血栓(5]。然而,推导的祖细胞仍然不清楚。

血管壁的外膜的祖细胞中扮演重要角色的开发和进展性血管疾病(8]。Campagnolo等人发现,成年人大隐静脉(HGSV)包含血管周的祖细胞克隆细胞和proangiogenic潜力(9]。因此,本研究旨在探索外膜是否人类大隐静脉的祖细胞(HGSV-AdPC)可以提高静脉血栓形成的决议以及调查可能的潜在机制,新生血管形成。

2。材料和方法

2.1。静脉血栓和人类的集合

人类大隐静脉(HGSV)收集从大隐静脉曲张的病人接受大隐静脉剥离第二附属医院的重庆医科大学。收集人体静脉血栓从大隐静脉曲张的患者和浅表血栓性静脉炎。本研究机构审查委员会批准重庆医科大学,并从所有患者知情同意了。

2.2。脱细胞血管和肾下的腹部主动脉移植做准备

这个过程用于脱细胞血管略与前面描述的修改(10]。简而言之,HGSV是从大隐静脉曲张的患者,用磷酸盐(PBS)解决方案6次在远端通过刺穿。静脉是减少2厘米的长度,放置在0.75%十二烷基硫酸钠(SDS)(美国圣路易斯σ)解决方案在125 r / min瓶在37°C 8个小时。PBS的船只被洗了5次一段10分钟的瓶,然后储存在4°C在PBS肝素为1%。成年雄性新西兰白兔(重量,2.0 - -2.5公斤, 每组)使用3%戊巴比妥钠麻醉(1毫升/公斤)通过耳静脉。执行一个中线剖腹手术暴露的肾下的部分腹主动脉髂总动脉的融合。血管周围组织解剖了钳,支流的结扎。肝素化后150 IU /公斤体重,近端和远端头寸cross-clamped。腹主动脉肾下的的1.5厘米段替换为插入式脱细胞血管紧随其后端到端吻合术与7缝线缝合(Ethicon、上海、中国)。移植的明显证实了超声检查(Esaote MyLab 90年,意大利)。动物有免费水和标准实验室兔粮,和没有anticougulants手术后。移植的移植术后天7和14日收获了组织学分析。

2.3。周皮细胞主要文化和CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC隔离

本研究的过程是与前面描述的相似(11]。隐静脉与PBS刷新包含streptomycin-penicillin (100 U /毫升),剁碎成碎片和II型胶原酶消化0.1%(美国σ)6 - 7小时37°C水浴,然后,细胞的解决方案是过滤、离心,暂停。暂停了血管壁细胞培养与3毫升一瓶感染性文化传媒(DMEM / F12, Lonza)含5%胎牛血清(Gibco) streptomycin-penicillin (100 U / ml, Hyclone), (0.2%, Lonza),生活(0.1%,σ)。CD34的⁺CD117⁺HGSV-AdPC孤立从通道3血管壁细胞流式细胞仪系统(美国BD生物科学)。目标细胞用于培养。测试的纯度HGSV-AdPC HGSV-AdPC ( )洗了PBS然后阻塞在PBS (10% BSA)在室温下20分钟,其次是孵化和老鼠anti-CD34-FITC anti-CD117-APC(美国Abcam)抗体在黑暗中30分钟在4°C。在PBS细胞进一步洗3次,resuspended在500年μl PBS,显微镜下观察。

2.4。CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC贴上CM-Dil

CM-Dil是活细胞分子探针标签而不影响他们的活动。CM-Dil溶解了DMSO和PBS稀释浓度为1μ克/毫升。CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC孵化第一次在37°C 5分钟然后在4°C与CM-Dil 15分钟。标签后,细胞被洗两次与PBS和新鲜培养基冲洗以去除多余的荧光染料。细胞在新的媒介和保存在冰resuspended移植或摄影在倒置荧光显微镜下观察(奥林巴斯、日本)。

2.5。静脉血栓形成模型小鼠和组织收割

所有执行程序是根据协议经伦理委员会批准使用和保健的重庆医科大学实验动物。静脉血栓在左肾下的腔静脉的雄性C57BL / 6小鼠是由稍微修改前面描述的过程(5,7]。雄性老鼠(重量、20 - 25克、6-8weeks 每组)被麻醉,进行中线剖腹手术暴露肾下的腔静脉到达髂总静脉汇合,然后孤立和分离邻腹主动脉。左肾下的腔静脉结扎与6 - 0缝线缝合,和一个眼科剪这部分为60秒2次,间隔30秒,诱导内皮损伤。肠道被取代,腹壁缝合关闭。在术后7天,14,老鼠被颈椎脱位牺牲。进行剖腹手术来切除肾下的组织学的腔静脉结扎髂总静脉的交汇处。

2.6。CD34⁺CD117⁺动脉外膜的HGSV-AdPC移植肾下的腔静脉

血栓在男性裸体小鼠诱导如上所述。流式细胞仪纯化CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC通道3代。CM-Dil-labeled或CM-Dil-nonlabeled D34⁺CD117⁺HGSV-AdPC与基底膜基质混合矩阵(目录参考:354248年,正欲贝德福德,妈,美国)在4°C,和最后一个细胞浓度的10⁶细胞/毫升。测试静脉血栓的祖细胞移植对分辨率的影响,治疗组的小鼠接受静脉血栓感应过程,和200年μl HGSV-AdPC被播种的动脉外膜肾下的腔静脉,而对照组的老鼠接受了静脉血栓感应过程和200μl人工基底膜矩阵悬挂。探索外膜的祖细胞的迁移到静脉血栓,200μl标记HGSV-AdPC被播种的动脉外膜肾下的腔静脉静脉血栓的老鼠。

2.7。组织学

使用的过程是与前面描述的相似5]。HGSV、兔腹主动脉移植肾下的人体静脉血栓,小鼠静脉血栓在一夜之间在4%多聚甲醛固定石蜡和嵌入。兔和小鼠血栓的贪污与苏木精和伊红染色(他)组织学评价。横向部分(5μ米厚的)在150年被削减μ米间隔低于结扎在样品的长度。得到了10到15节的血栓进行分析。部分被认为在×40放大。图像(×400放大)的整个截面面积和平铺的获得一个综合与图像分析软件(图像专业+ 6.0)。血栓组织区域和血栓地区各部分测量相同的软件。炎性细胞浸润和纤维症被认为是区分血栓的组织领域本身。血栓组织面积的百分比计算血栓区域组织的每个部分。的每个部分,平均价值的动物是动物的组织率计算。部分被处理为本地化的CD34免疫组织化学⁺,CD117⁺、CD31⁺,F4/80⁺使用抗体细胞。检索到的抗原是在650 W 10分钟柠檬酸缓冲(pH值,6.0)。生物素化的二次抗体被用来检测初级抗体的结合,其次是streptavidin-peroxidase复杂。血栓细胞(核数),内皮细胞(CD31⁺细胞)和巨噬细胞(F4/80⁺血栓细胞)的统计,加入五大功率领域(×400放大)径向与150年每个三个部分μ米间隔。

2.8。免疫荧光染色

用于immunofluorescent染色的过程在这个研究是类似于先前描述(10]。简单地说,人类的细胞涂片和冻结部分小鼠隐静脉和静脉血栓在4%多聚甲醛固定。老鼠的冻结部分静脉血栓与鼠抗体标记鼠标Sca1, CD117、CD34, Flk1和CD31 (Abcam,剑桥,英国)。HGSV的细胞涂片和冻结的部分是用鼠标人类CD34抗体标记(美国Abcam)和兔抗体人类CD117(美国Abcam)。分化细胞涂片和冻结部分静脉血栓的裸体小鼠用兔抗体标记人类CD31and VEGFR2(美国Abcam)。孵化了一夜之间使用主要抗体在4°C,进一步用PBS。Dylight 649(山羊anti-mouse和山羊anti-rabbit)和Alexa萤石488(山羊anti-mouse和山羊anti-rabbit)被用作二次抗体(美国Abbkine)和核沾染了4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。荧光显微镜下图片(奥林巴斯BX51,圣路易斯,密苏里州,美国)或共焦显微镜(500年奥林巴斯阵线,日本)。半定量的评价进行×400放大。积极的彩色祖细胞在小鼠静脉血栓清点,表示为核总量的百分比。

2.9。在CD34内皮细胞分化⁺CD117⁺HGSV-AdPC在体外

孤立的CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPCs被播种在胶原蛋白IV-coated盘子和内皮生长的培养基培养(Lonza) 50 ng / ml血管内皮生长因子(VEGF,σ)7天诱导内皮分化。与此同时,CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPCs在基础培养基培养(DMEM / F12 Lonza)和细胞生长因子作为控制。分化后的细胞和4%多聚甲醛固定,或提取基因或蛋白质的分析内皮标记(CD31和VEGFR2)使用实时PCR,免疫印迹或immunoflourescence染色。内皮细胞分化也分析了管形成试验后7天的刺激(12,13]。

2.10。实时聚合酶链反应

实时PCR过程与前面描述的相似(10]。从获得的总RNA诱导组和对照组的试剂盒试剂(豆类中国)。使用罗氏的RNA的互补脱氧核糖核酸合成装备。内皮细胞的RNA水平标记CD31 VEGFR2和vWF被实时PCR检测。gene-specific引物(盛锣、中国)为CD31设计如下:(5 - - - - - -CCAAGATAGCCTCAAAGTCGG-3和5 - - - - - -CTGGGAGAGCATTTCACATACG-3 ),VEGFR2 (5 - - - - - -CAGACGGACAGTGGTATGGTTCTTG-3和5 - - - - - -GTGTCTGTGTCATCGGAGTGATATCCG-3 ),vWF (5 - - - - - -AAGTGTCTGGCTGAGGGAGGTAA-3和5 - - - - - -GTCAATGGAGTACATGGCTTTGC-3 ),β肌动蛋白(5 - - - - - -CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3和5 - - - - - -CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3 )。PCR循环条件如下:30分钟42°C, 5分钟在95°C, 40周期30年代在95°C初始变性,和45秒60°C退火/扩展。

2.11。西方墨点法

从培养细胞进行免疫印迹过程稍微修改过程如前所述[10]。从诱导组和对照组中提取蛋白质是根据协议进行蛋白质提取试剂(Beyotime,中国)。蛋白质含量由BCA量化蛋白质分析工具包(Beyotime,中国)。提取的蛋白质(20μg)分离6%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide通过sds - page凝胶,然后转移到聚乙二烯二氟化物膜。这些墨迹被孵化和CD31 (1: 500), VEGFR2(1: 500),和β肌动蛋白(1:1000)抗体的过夜,然后用山羊孵化anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 6000)二级抗体。确认相同加载的提取的蛋白,膜与抗体染色β肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术有限公司)。

2.12。管形成分析

在体外内皮细胞管使用共有10的形成进行了分析⁴CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC内皮生长培养基中培养7天的50 ng / ml VEGF。96 -孔板涂有50μl人工基底膜基质为45分钟37°C。诱导CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC resuspended在内皮生长介质含有50 ng / ml VEGF和播种到基底膜基质matrix-coated井。CD34的⁺CD117⁺只有在内皮生长培养基培养HGSV-AdPC被用作控制。管形成逆显微镜下观察后6小时。

2.13。统计分析

通过独立使用SPSS 12.0进行了统计分析 - - - - - -测试。数据被表示为手段和标准偏差( )至少三个实验。统计上显著的差异是由星号描绘的, , 。

3所示。结果

3.1。HGSV-AdPC

CD34免疫组织化学染色显示⁺和CD117⁺细胞主要位于人类隐静脉动脉外膜、中很少出现在媒体上,很少在内膜(数据1(一)- - - - - -1 (d))。Immunofluorescent祖细胞的染色显示是一致的,尽管小CD34人口⁺CD117⁺动脉外膜内的细胞HGSV(图1(f))。

3.2。祖细胞在小鼠模型的血栓

识别祖细胞在小鼠的静脉血栓,血栓小鼠模型建立了使用肾下的下腔静脉。Seven-day-old血栓是收获,immunofluorescent染色。血栓的组织主要是位于边缘区域,没有有细胞核的细胞在中央区域的血栓。这些按照前面描述的(5]。大量的Sca1⁺细胞中观察到静脉壁和血栓的边缘区域。新血管形成也明显的边缘区域内血栓。一些Sca1⁺细胞是位于内膜内皮细胞,穿越到血栓(图2(一个))。的Sca1⁺细胞在血管壁进入血栓通过血管滋养管(增刊的人物花絮)。这表明静脉壁的祖细胞在动脉外膜可能穿过内膜或通过血管滋养管血栓,血栓内和新血管形成可能与祖细胞的积累来自静脉壁的动脉外膜。其他的祖细胞CD34标记⁺,CD117⁺,Flk1⁺也观察到静脉壁和血栓的边际区域(图2 (b),附加的图IA和IB)。祖细胞的数量在边缘区域内血栓Sca1⁺≈21%,CD34⁺≈12%,CD117⁺≈9%,Flk1⁺≈5%(图2 (c))。尽管组织14-day-old血栓参与整个地区的血栓,Sca1⁺祖细胞主要是观察到的边缘区域内的血栓,这是类似于7天的位置血栓(增刊的人物IIB-IIE)。

3.3。祖细胞在HGSV血栓

识别人类静脉的血栓的祖细胞,大隐静脉曲张的患者和浅表血栓性静脉炎手术的收获HGSV血栓和静脉壁。5的血栓患者血栓的历史从23日天检查症状不同。免疫组织化学染色结果显示,整个血栓已经完成了组织在所有五个病人,和许多CD34⁺和CD117⁺血栓细胞出现在整个地区(数字2 (d)和2 (e),附加的图集成电路和ID)。然而,目前尚不清楚CD34⁺和CD117⁺血栓细胞来自HGSV的动脉外膜。

3.4。由外向内的细胞迁移到脱细胞血管壁

HGSV是脱细胞治疗0.75%十二烷基硫酸钠与PBS 8小时,洗。然后,半透明的非细胞血管支架是生成的,他没有这些血管染色显示细胞核(图3(一个))。脱细胞血管被用来取代兔子腹主动脉肾下的。贪污保持开放在7 - 14天随访评估超声检查,并没有发现血栓内腔的贪污(图3 (b))。这是有争议的,由外向内的理论对细胞迁移的解决静脉血栓。目前尚不清楚这些细胞是否进入静脉的血栓墙或循环。因此,在这项研究中,我们旨在评估细胞的迁移到非细胞支架和CD34标记的表达。有趣的是,在7天更换,有少量的细胞在动脉外膜支架远离吻合(图的面积3 (c));与此同时,出现了大量的细胞在动脉外膜支架吻合(图旁边的领域3 (d))。几乎同样数量的细胞出现在内膜和一些细胞在支架中模的两个地区。此外,大多数的动脉外膜细胞支架吻合CD34是积极的,和少量的内膜细胞CD34阳性(图3 (e))。然而,细胞完全迁移到三层的支架在远离吻合和中央部分的网站14日替换(图3 (f))。这些发现表明,细胞迁移到脱细胞血管可能主要是由来自外膜兔腹主动脉的祖细胞,和由外向内的迁移是血管重构的主要机制。特别是当血栓闭塞静脉腔,然后细胞进入静脉血栓最有可能通过由外向内迁移。

3.5。CD34的隔离⁺CD117⁺HGSV-AdPC在体外

HGSV-AdPC调查功能,外膜CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC分离从主文化。HGSV剁碎,与血管壁细胞,通过胶原酶消化。收获血管壁细胞开始坚持烧瓶在48小时内文化、发展文化殖民地在72小时。7天培养后,细胞的数量大量增加,殖民地的大小以及数量增加。一些血管壁细胞出现为主轴,三角形和不规则形状(图4(一))。在第三代,大约10⁷血管壁细胞聚集,然后,CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC ( )%被孤立的流式细胞仪(图4 (b))。确认流式细胞仪获得的纯度,目标7天培养后细胞被免疫荧光染色,和双阳性细胞占91.2%(图4 (c))。

3.6。CD34的移植⁺CD117⁺HGSV-AdPC Adventitia-Enhanced决议的静脉血栓

澄清是否外膜CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC细胞发挥作用在静脉血栓形成的决议,HGSV-AdPC收获的文化在体外被移植到裸体小鼠的动脉外膜肾下的腔静脉诱导血栓形成。posttransplantation天7和14,肾下的腔静脉是收获,和组织化学染色和细胞标记(CD31 F4/80)免疫组织化学染色检测组织,新血管形成,血栓中的成核细胞,巨噬细胞浸润。的组织率治疗组( )明显不同的控制( , )posttransplantation天7, 与 ( )分别posttransplantation天14(数字5A1-4和5D1)。有核的细胞的数量控制和治疗组血栓在7天 vs。 ( )和 vs。 ( )14天(数字5A1-4和5D2)。内皮细胞的血栓治疗组与对照组相比显著加速7天( vs。 , )和14天( vs。 , )(数据5B1-4和5D3)。巨噬细胞细胞(F4/80)在治疗组显著增加7天( vs。 , )和14天( vs。 , )(数据5C1-4和5D4)。这些结果表明,外膜CD34的增加⁺CD117⁺HGSV-AdPC可以促进血栓组织,加速血栓决议,新血管形成,招募巨噬细胞内的静脉血栓。

3.7。移植CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC在动脉外膜穿过血管壁,进入血栓,分化成内皮细胞的新生血管形成

澄清血栓的机制解决外膜的祖细胞移植后,CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC,培养在体外通过流式细胞仪检测了 纯度(5图iii a),用CM-Dil标记在体外(图6(a))。动脉外膜的标记细胞被移植到肾下的裸体小鼠的腔静脉血栓形成是诱导。的肾下的腔静脉是收获7天或14标记细胞的移植。7天,许多CM-Dil-labeled细胞中观察到静脉壁,和一些CM-Dil标记细胞穿过静脉壁和聚集在静脉血栓(图的边缘区域6(b)和附加的图希望)。这些建议的标记细胞移植到动脉外膜肾下的腔静脉被由外向内的迁移过程通过静脉壁和进入了血栓。进一步探索CD34的角色⁺CD117⁺HGSV-AdPC血栓,血栓的标记细胞被immunofluorescent染色检测内皮细胞抗体的标记(CD31和VEGFR2)标记细胞移植后7天。大多数CM-Dil血栓内标记细胞CD31表达(图6(c))和VEGFR2(增刊的人物IIIC),这表明CM-Dil-labeled血栓细胞分化成内皮细胞。

3.8。CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC分化成内皮细胞在体外

外膜的祖细胞穿过静脉壁后,他们进入血栓和分化成内皮细胞在活的有机体内,所以我们试图探索CD34的分化⁺CD117⁺在内皮细胞在体外。流式细胞仪是用来隔离CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC从小学文化,受到内皮细胞分化的细胞培养基中VEGF的存在。使用实时PCR,我们发现VEGF显示重要的内皮细胞基因表达标记(CD31、VEGFR2和vWF)(图7(一))。内皮细胞分化的诱导蛋白质水平证实了免疫印迹(图7 (b))和immunofluorescent染色(图7 (c))和内皮细胞标记的蛋白表达(CD31和VEGFR2)是控制相比显著增加。管形成的显著差异也是逆显微镜下观察6小时文化之间的控制和诱导组(数字7 (d)和7 (e))。这些结果表明,tCD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC有可能分化成内皮细胞在内皮生长媒体VEGF的存在。

4所示。讨论

在过去的十年里,血管壁祖细胞已确定在啮齿动物和人类的血管壁(8- - - - - -10,14- - - - - -18]。的动脉外膜血管壁已经建立的利基祖细胞有可能分化成几种类型的成熟细胞调节和启动血管重建和疾病的发展,尤其是动脉粥样硬化和内膜的增生(10,18,19]。然而,目前没有报告的作用外膜的祖细胞在静脉血栓形成的决议。这是第一个研究表明HGSV-AdPC迁移在一个由外而内的过程通过静脉壁血栓的腔,并促进了静脉血栓的决议。HGSV-AdPC有可能分化成内皮细胞在活的有机体内和体外。外膜的祖细胞发挥重要作用在自然解决静脉血栓。这个过程涉及到新血管形成的潜在机制adventitia-derived祖细胞通过分化诱导的内皮细胞。

Non-bone骨髓祖细胞是临床开发由于其稀缺性。按照先前的结果(9,20.- - - - - -22),许多CD34⁺和CD117⁺HGSV祖细胞中观察到动脉外膜,和一些祖细胞CD34和CD117积极的两倍。剥离HGSV是一种常见的手术方法的临床实践HGSV患者静脉曲张。因此,处理隐静脉大隐静脉曲张的患者可以收集为祖细胞的来源。祖细胞是参与静脉血栓形成的决议。粒细胞集落刺激因子动员与皮下注射增强组织和血管再通的血栓,血栓的新血管形成和巨噬细胞数量增加(5]。然而,血栓的祖细胞的推导过程仍不清楚。骨骨髓来源的细胞被招募到血栓在决议,但细胞没有行血栓中的新的recanalizing渠道(7]。类似的例子还发生在其他血管疾病。胡锦涛等人了,祖细胞在动脉粥样硬化和血管移植的血管内膜损伤并不来源于骨髓祖细胞但本地宿主细胞(23]。岩田聪等人只表明,骨髓细胞导致血管的炎症但不分化成平滑肌细胞(SMC)在创伤性neointima丝(24]。外膜的祖细胞进入内膜仍然是模棱两可的。

外膜的祖细胞可能通过血管滋养管首先进入血液循环,然后进入血液循环的内膜。然而,没有对脱细胞血管滋养管船,并发现祖细胞在血管壁和出现血栓,和一些祖细胞内膜穿过内皮细胞内的血栓。脱细胞后HGSV取代兔子腹主动脉肾下的,有比这更外膜的祖细胞接近吻合吻合postreplacement天7,但有同样数量的细胞内膜的领域远和接近吻合,和一些细胞在膜媒体。脱细胞的细胞迁移到三了静脉的地区接近或远离吻合postreplacement天14。这些结果表明,外膜的脱细胞血管祖细胞可能主机腹主动脉动脉外膜的迁移和积累中模时间的方式,而内膜细胞来自循环。然而,当发生静脉血栓形成,血栓堵塞管腔的,没有观察腔内的血液流动。之后,外膜的祖细胞迁移到通过膜媒体和内膜血栓。这种由外向内的迁移过程是类似于先前公布的数据,这表明,外膜的祖细胞的动员和招聘负责内膜的修复血管重建期间如内膜的伤害(14,25- - - - - -27]。这种由外向内的外膜的祖细胞的迁移也负责脱细胞血管新生内膜形成和动脉粥样硬化。静脉移植的动脉外膜含有相当数量的祖细胞被证明迁移从外部进入脱细胞血管在回应SDF-1 [10]。黄等人的研究表明,动脉外膜的祖细胞迁移到内膜外膜Sca1,然后播种⁺脱细胞血管外的细胞迁移到内心的船在西罗莫司(19]。蔡等人探索,外膜的祖细胞导致血管内膜形成脱细胞血管移植,发现Sca1⁺,c - kit⁺,CD34⁺细胞neointima [28]。动脉外膜的外膜不仅祖细胞迁移到脱细胞血管的内膜在体外和在活的有机体内但也从动脉外膜迁移到动脉壁的内膜在活的有机体内(15,25]。的CM-Dil-labeled HGSV-AdPC被播种在肾下的外腔静脉,引起血栓,和从动脉外膜贴上祖细胞迁移到血栓并分化成内皮细胞的新血管形成血栓。所以,外膜的祖细胞进入内膜或静脉血栓不是通过循环,但通过穿越血管壁。玉等人发现,动脉外膜的外膜的祖细胞迁移的neointima诱导趋化因子(CCL2和处于受控)(27]。在我们之前的研究中,干细胞/祖细胞和粒细胞集落刺激因子动员提高静脉血栓的分辨率和血管再通通过增加CCR2表达式(5]。静脉血栓的决议包括CXCR2-mediated新血管形成,纤维蛋白溶解,营业额和胶原蛋白,这个过程可能是monocyte-dependent [29日]。目标删除CCR2在静脉血栓形成的小鼠模型显示协会血栓决议的障碍(30.]。所以,从动脉外膜外膜的祖细胞的迁移到血栓可能与CCL2 / CCR2有关。

新血管形成血栓的证明是高度相关的静脉血栓形成的决议5]。我们的研究表明,CD34⁺CD117⁺HGSV-AdPC可以区分内皮细胞在体外。的祖细胞收获文化在体外被播种在裸体小鼠下腔静脉的血栓被证明是诱导,组织,新血管形成,成核细胞,巨噬细胞浸润在血栓高度提升。这表明,外膜的祖细胞的数量的增加可以提高静脉血栓的决议。以前的研究也表明,HGSV-AdPC分化成内皮细胞,促进新血管形成。Campagnolo等人调查HGSV-AdPC和显示单独使用和multilineage分化能力,集成到网络的内皮细胞,通过旁分泌机制新血管形成(9]。Iacobazzi等人已经评估氧化应激的影响的可行性和功能HGSV-AdPC,发现压力不损害新血管形成的祖细胞的能力,和注射缺血性组织帮助灌注恢复和新血管形成20.]。Gubernator等人将HGSV-AdPC移植到缺血肢体和显示改善缺血性四肢的血管再生和强调了血管生成网络(21]。尽管endothelia祖细胞已确定在GSV内膜,并演示了vasculogenic潜力(31日),我们的研究结果表明,CD34⁺和/或CD117⁺干细胞几乎所有位于GSV动脉外膜。因此,即使有几个CD34⁺和CD117⁺double-positive内膜干细胞,对我们的研究和结论的影响是有限的。当然,一个腔的居民内皮祖细胞的潜在作用模型不能完全否决了。我们所知,我们的研究是第一个提供直接证据表明,外膜的祖细胞迁移到的静脉血栓和分化成内皮细胞新生血管形成。外膜的祖细胞的分化是由当地环境(32]。

我们发现,组织参与了整个地区14天在正常小鼠静脉血栓,但组织率 在14天的裸体小鼠和静脉血栓 与CD34裸小鼠⁺CD117⁺HGSV-AdPC移植。这可能与降低血栓的裸体小鼠炎症。心肌损伤是不太突出,轻微的单核细胞浸润在裸小鼠与正常小鼠相比33,34]。我们的研究结果表明,C34⁺和CD117⁺祖细胞出现在人类整个组织区域23日天血栓,但Sca1祖细胞只有在出现的边际组织领域的14天小鼠血栓。虽然组织被发现参与整个地区的14天在正常小鼠血栓,Sca1⁺祖细胞主要出现在边缘区域内的血栓,类似于血栓7天长假的面积。这些原因可能与血栓的差异之间的历史和种类的祖细胞在当下研究人类和老鼠。这里有各种各样的祖细胞在动脉外膜,如CD34⁺,CD117⁺,Sca1⁺,喜欢的《忍者外传2》⁺CD146⁺,CD44⁺,Sox2⁺(35),他们的命运分化可能有所不同。根据环境因素,外膜的祖细胞可能表达细胞类似于组织居民细胞的命运,包括成骨细胞,endothelial-like细胞,巨噬细胞、壁细胞,脂肪细胞。有外膜Sca1的异质性⁺细胞,主动脉动脉外膜至少包含两种类型的Sca1祖细胞,和一个表达肌原性的表型而另一个表达巨噬细胞表型。

在目前的研究中,外膜的祖细胞促进解决血栓,巨噬细胞积累,新血管形成。这是类似于以前的研究,在巨噬细胞积累的增加在血栓与血栓的决议5],注入巨噬细胞内的血栓导致五倍降低血栓的大小和四倍增加新血管形成与控制[相比36]。新血管形成的血栓主要是在巨噬细胞聚集的地区(37]。然而,目前尚不清楚如何巨噬细胞参与新生血管形成血栓。巨噬细胞是肿瘤坏死因子-的主要来源α(肿瘤坏死因子-α),在调解新血管形成中发挥作用,VEGF生产,巨噬细胞产物。的proangiogenic影响TNF -α被阻断VEGF抑制。肿瘤坏死因子-α/ VEGF-mediated血管生成途径需要巨噬细胞(38]。黄等人证明了巨噬细胞协助外膜的祖细胞的诱导分化为内皮细胞和抑制SMC分化。Macrophage-derived TNF -α介导内皮细胞分化发生绑定到核因子-κB (NF -κ淘汰赛TNF - B)α在静脉移植模型reendothelialization下降。巨噬细胞培养基含有血管生成因素包括VEGF-A和VEGF-C [39]。VEGF和基本解决血栓的纤维母细胞生长因子被发现(40]。Adenovirus-mediated转染VEGF治疗减少血栓的大小和增加血管再通和巨噬细胞招聘到血栓。这个过程可能是由于巨噬细胞的增加招聘41]。缺氧和低氧诱导因子1 (HIF-1)诱发的自然解决血栓和显示与VEGF表达增加相关。Upregulation HIF-1增强的血栓分辨率和静脉血管再通(42]。我们的研究结果表明,VEGF促进内皮细胞标记物的表达的外膜的祖细胞在基因和蛋白水平。管的形成也更明显包含VEGF的培养基。这些结果表明,血栓可能诱导的巨噬细胞外膜的祖细胞分化成内皮细胞的新血管形成,和VEGF可能参与这个过程。

在这项研究中,脱细胞HGSV被用作支架代替兔腹主动脉肾下的。没有使用抗凝血剂和其他特定的药物。贪污保持开放与超声波检查后续天7和14,而且没有观察到血栓和狭窄的腔贪污。没有观察到血漏吻合的站点和贪污。包括外膜的祖细胞,细胞迁移到脱细胞支架,促进了血管重构。脱细胞支架的HGSV展示优秀的血管功能。白等人发现透明质酸acid-conjugated heparin-coated HGSV减少新生内膜厚度当用于存和在大鼠动脉成形术(43]。Kumar等人用脱细胞HGSV,连接到一个生物反应器与内皮中、新鲜血液灌注。HE-staining显示recellularization的脱细胞HGSV在细胞腔的表面的静脉44]。脱细胞HGSV是个有前途的血管支架。

总之,HGSV的动脉外膜包含大量的祖细胞可以迁移的动脉外膜静脉壁静脉血栓,血栓的解决中发挥作用。静脉血栓中的祖细胞是来自静脉动脉外膜和分化成内皮细胞的新生血管形成。增加静脉外膜的祖细胞可以促进静脉血栓的决议。我们的结果说明自然解决静脉血栓的机制和澄清的作用在血栓决议外膜的祖细胞。这些结果是令人鼓舞的新视角目标外膜的祖细胞的细胞疗法的方法提高静脉血栓的决议。同时,处理HGSV从大隐静脉曲张的患者手术后可以收获的祖细胞和血管支架。

数据可用性

手稿可以找到的数据作为基础数据支持我们的研究结果。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Siying凌,甄Ma和永腾了同样工作。

确认

支持的工作是由中国国家自然科学基金(81470583)和重庆科技基金(没有。cstc2013jcyjA10089)。

补充材料

补充1。图我:血栓的祖细胞。A、B的干细胞标记CD117和Flk1抗体7天血栓的老鼠。C, D染色的结果与抗体CD117 HGSV二十五天的血栓。规模的酒吧:25μm (A, B);100年μm (C);50μ(D)。放大:400 x (A, B, D);100 x (C)。

补充2。图二:祖细胞在天7和14静脉血栓的老鼠。与抗体Sca1 immunofluorescent染色的结果。绿色箭头指示Sca1 +细胞,蓝色箭头表示原子核。与抗体Sca1 immunofluorescent染色的结果在7天。静脉壁内的Sca1 +细胞通过血管滋养管进入了血栓。红色箭头指示的内膜内皮细胞静脉壁。B immunofluorescent染色的结果与抗体Sca1 7天。C核的合并后的染色结果,Sca1抗体,抗体和CD31在7天。红色箭头表示在静脉内膜壁的内皮细胞。新血管形成出现静脉血栓的外围区域。 D The result of immunofluorescent staining with antibody Sca1 on day 14. E The merged staining result of nucleus and antibody Sca1 on day 14. Dotted lines indicate the border between intima and thrombi. There were seldom cells in the central area on day 7 venous thrombi, while many cells in the central area on day 14. However, Sca1+ progenitor cells mainly appear in the venous wall and peripheral area of venous thrombi on days 7 and 14. T: area of thrombi; W: area of vein wall. Scale bars: 25 μ(一);100年μ米(中)。放大:400 x (A);100 x(中)。

补充3。图3:标签的迁移和分化CD34 + CD117 + HGSV-AdPC血栓的老鼠。一个纯粹的CD34 + CD117 + HGSV-AdPC被流式细胞仪( )%移植前。B CM-Dil-labeled CD34 + CD117 + HGSV-AdPC进入posttransplantation血栓的第七天。C与抗体VEGFR2 immunofluorescent染色的结果。绿色箭头表示VEGFR2 +细胞。红色箭头表示CM-Dil-labeled CD34 + CD117 + HGSV-AdPC。黄色箭头表示移植CD34 + CD117 + HGSV-AdPC分化成内皮细胞。酒吧规模:200μm (B);100年μm (C);25μ米(合并)。放大:100 x (B, C);400 x(合并)。