负载超活化血小板裂解液的热敏水凝胶联合核心减压技术治疗股骨头坏死的研究

抽象的

超活性血小板裂解物（SPL）是富含血小板的血浆（PRP）的衍生物，其含有高水平的几种生长因子。在该研究中，我们合成了含有温度敏感聚（DL-丙交酯 - 乙酰乙酰乙酰酸）（PLGA）的温度敏感的水凝胶，SRCL₂、HA，并加载不同浓度的sPL。该水凝胶具有良好的包封率和缓释生长因子的能力，适合作为药物载体。在大鼠坏死的股骨头模型中植入载有spls的水凝胶，并进行核心减压，显著加速骨修复和再生。因此，水凝胶支架包埋sPL可能是治疗股骨头坏死的有效策略。

1.介绍

股骨头坏死(ONFH)的特征是由于软骨下骨血液供应不足或完全缺乏，导致骨细胞坏死和骨髓坏死。目前全球已确诊的ONFH病例3000万例，仅中国就有812万例，发病率每年都在上升[1］．最近在中国的ONFH患者进行的多中心研究发现，类固醇用途被鉴定为26.35％的男性患者的致病因数，55.75％的女性患者[2］．长期使用大剂量糖皮质激素(GC)可能会影响股骨头细胞的分化，改变骨代谢，从而降低股骨头的血管生成活性，引发缺血性缺氧。

在缺乏有效治疗方法的情况下，ONFH可在1-3年内进展为80%的软骨下骨塌陷。软骨下骨塌陷导致相当大的疼痛和损害髋关节功能，最终将需要全髋关节置换术(THA)。然而，由于THA并非年轻患者的最佳选择，需要尽早采取行动，以减缓ONFH的进展，推迟关节置换术的年龄。

核心减压术(CD)是一种保留关节的手术[3.]适用于早期的ONFH患者具有完整的关节表面[4］．可降低股骨头的髓内压力，加速髓芯减压后形成空洞的骨再生，逆转股骨头坏死[5[从而延迟疾病的进展，防止股骨头塌陷。然而，37％的经历核心减压治疗的患者将进展到股骨头崩溃[4］．

富含血小板的血浆（PRP）可以通过恢复促进血管生成和成骨的激活途径来加速骨形成[6，这是一种可用于ONFH病理进展的策略。PRP中的生长因子可促进软骨形成[7]及成骨[8因此可以减轻onfh [9］．此外，血小板裂解物(PL)生长因子还促进各种细胞的趋化迁移[10，11］．PL可以被整合到生物支架中，使其有益的效果保持更长时间[7，12]基于制备方法，活化，初始血小板浓度和供体[12，13］．以PRP为原料，采用超低温冻融法制备超活性血小板裂解液(sPL)。它富含生物活性因子，可促进组织再生和血管重建。然而，生长因子在sPL中的半衰期较短，限制了其生物学效应在活的有机体内．此外，高剂量和/或频繁施用SPL在经济上不可行，并且可能导致有毒的副作用。用亲水性大分子（如生长因子）的SPL的控制释放可以显着提高其疗效在活的有机体内．

具有高分子量的聚合物[14]，例如聚乳酸 - 共乙醇酸（PLGA），可用作有效在活的有机体内药物输送系统的生物相容性和生物降解性。该高分子材料可以保护sPL不受组织微环境的影响，实现控释。骨是一种天然的有机-无机-无机复合材料，主要由胶原蛋白和羟基磷灰石(HA, Ca₁₀(PO₄）₆(哦)₂）））。已经开发了各种可以模仿骨骼组成和结构的有机无机复合材料。锶（Sr）是人体中发现的痕量元素，促进骨形成和骨质疏松组织的愈合。因此，我们设计了一种组合水凝胶，其组合温度敏感的PLGA，骨矿物羟基磷灰石（HA）和锶[15，16］．然而，水凝胶可以流入缺陷的其他部分，并且需要改变水凝胶的性质以防止水凝胶流出。

温度敏感的PLGA / HA / SRCL₂用SPL负载的水凝胶用于与CD手术组合重建退化的骨组织。在股骨头和ONFH的核心减压后，将SPL从水凝胶中从水凝胶中释放并导致加速骨修复。因此，我们的研究为热敏水凝胶材料的临床应用奠定了基础，并且还可以在治疗ONFH患者的成本下显着降低。

2.材料和方法

２.１.材料

温敏PLGA购自济南代钢生物材料有限公司，SrCl2购自国药控股化学试剂有限公司，HA购自阿拉丁，脂多糖购自美国Sigma-Aldrich公司，甲基磺酸盐购自辉瑞制药(中国杭州)。

2.2。SPL准备

通过超级温度冻结从人血液中分离SPL，如前所述[17］．简而言之，通过离心新鲜的全血来提取PRP。PRP使用熔融制剂和专利的细胞因子培养技术进行超低沸腾，可以有效地诱导，活化和培养。

2.3。水凝胶的合成与表征

温度敏感的PLGA \ SRCL₂HA以94：5：1的比例混合，并将混合物加入0,250和500 μ.L SPL放置在磁力搅拌器中。所得到的PLS0，PLS1和PLS2水凝胶冻干并用金喷射，并在扫描电子显微镜（SEM）（日本电子有限公司）下观察它们的形态。

为了测量生物活性因子从生成的PLS水凝胶中的缓释，后者被放置在干净的小瓶中( 每组）并完全浸没在4ml模拟体液（SBF）中。然后将小瓶密封并在水浴中温育，并在第3,6,9,12,15,18,21,21,24,27和30天收集培养基中的等分试样。VEGF和TGF-的浓度β使用特定的ELISA套件（江苏，江苏）测量。

预称重的冻干凝胶在去离子水中30°C, 34°C, 38°C, 42°C孵育1小时，测量水凝胶溶胀。将肿胀的凝胶取出，吸去多余的水分，并称重。胶体含水量(SR)计算公式: ，在哪里和分别表示干重和温度重。

2.4。体内实验

2.4.1。建立ONFH模型和治疗

所有动物实验均按照国家卫生研究院制定的人道使用和护理的指南进行，所有实验动物都在处理，并通过实验动物使用和福利伦理委员会批准动物的所有操作哈尔滨医科大学第一附属医院（道德批准号：2019029）。

哈尔滨医科大学第一次附属医院的动物中心饲养重280-300克的雄性SD大鼠，并喂养自由在标准的实验室饮食和水。总共27只大鼠静脉内注射10 μ.g/kg脂多糖(LPS)， 24 h后肌肉注射3次20 mg/kg甲基磺酸盐(MPS)，然后每隔24 h注射一次。骨坏死病变在手术后2周首次出现，并持续到手术后6周出现[18］．将三只大鼠进行了安乐死，收集组织样品用于CT和组织病理学检查。一旦确认了ONFH的诊断，将其他大鼠随机分配给PLS0，PLS1和PLS2组（ )．使用3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，并且使用前后和后探测的右髋部暴露，同时保留股骨头中的主血管。通过切割开关胶囊防止髋关节移位，股骨头和颈部暴露。使用钻头从股骨头的核心从更大的较大的较大的传递者进行减压，并且损伤用PLS填充。用骨蜡覆盖植入区域，伤口闭合。在操作前后，所有动物肌肉内注射庆大霉素（4mg / kg），以防止任何伤口感染。

2.4.2。放射学分析

处死来自每组的四只动物用于4次微型CT分析^th和12^th周参与。使用QuantumGX CT成像系统(PerkinElmer, USA)监测股骨头的变化。在80 kV功率下，总旋转360°，步长0.5°，获得各向同性20 mm体素基音数据集，构建计算机生成的股骨头三维模型。

2.4.3。组织病理学分析

来自每组的动物用于4次上的组织学观察^th和12^th周后手术。组织标本用4%多聚甲醛固定1周，用20% EDTA溶液脱钙1月。然后，样品用乙醇梯度脱水，用二甲苯澄清。石蜡包埋后切成4块μ.m厚切片，然后按照标准方案进行苏木精伊红(HE)、Masson和ALP染色。

2.4.4。Tunel分析

按照制造商的说明，使用特定的Tunel试剂盒，将组织切片与Tunel试剂一起孵育。0.03% DAB显色5min，苏木精对载玻片进行复染。在200倍放大倍数下，在4个随机显微镜下计数tunel阳性细胞的数量。以tunel阳性细胞数与总细胞数之比计算细胞凋亡率(%)。

2.4.5。免疫组织化学

使用针对I型胶原蛋白和CD31的初级抗体探测组织切片，然后用/输出CY5缀合物的二次抗体。在用苏木精染色后，在荧光显微镜（Leica，Mannheim，Germany）或光学显微镜（Leica，Mannheim，Germany）下观察到载玻片。

2．5．统计分析

数据表示为 (SD)。采用单因素方差分析(ANOVA)比较组间数据。一个值<0.05被认为是统计学意义的。

3。结果与讨论

３.１.水凝胶的表征

我们将sPL加载到温度敏感的水凝胶中，以实现持续释放和更强的治疗效果。如图所示1(a)冻干水凝胶具有部分多孔结构，sPL的加入使颗粒尺寸减小。

聚合物水凝胶稳定释放TGF-β和VEGF在30天的时间（图1（乐队1（c））取决于封装的SPL的量。正如预期的那样，PLS0没有明显释放生长因素。此外，当分别加热至34°C，38°C和42°C时，水凝胶在30℃下膨胀至2.1,2.8和3.9倍的体积（图1(d))。

３．２．载苏氨酸水凝胶减轻骨坏死和促进骨形成

正如前面Wu等人所描述的，使用LPS和MPS建立了ONFH模型[19］．影像学和组织学检查清楚显示，6周时诊断为骨坏死，并伴有骨髓坏死、脂肪分布异常和股骨头内压增加。股骨头坏死核心减压通道构建良好，水凝胶植入准确，肌肉、神经、血管无损伤。所有动物均健康，无明显感染迹象。一些研究报告了PL中存在成骨生长因子[10，20.[水凝胶支架中的SPL封装增强了组成生长因子的保留能力。如图所示2，横截面和纵向CT图像表明，与PLS0基团相比，植入后4周，PLS1部分地修复了坏死区，而PLS2显示出更强的治疗效果。即使在PLS0组中12周后，坏死区域仍然可见，但大多在用PLS1和PLS2处理的大鼠中重构。

股骨头坏死的组织学检查显示，ONFH诱导引起稀疏空洞，弥漫性点状骨髓坏死，骨髓腔内可见稀疏的小梁样大脂肪细胞。植入水凝胶没有引起任何局部炎症反应或纤维化。PLS2导致新生骨和小梁的形成^th植入后的一周，导致骨折和造血坏死。同样，PLS0和PLS1给药导致形成新骨骼，但没有诱导小梁排列（图3.和4)．与上述观察结果一致，各组均观察到表达成骨因子ALP和I型胶原的骨组织，且植入ps组的阳性染色程度呈sPL浓度依赖性增加(图)5和6)．

３．3.载苏氨酸水凝胶促进血管生成

此外，sPL中的生长因子促进成骨细胞的粘附和增殖，同时也通过血管内皮细胞的增殖促进血管生成。血小板内皮细胞粘附分子-1 (CD31)，是内皮细胞系的典型特征[21］．如图所示7，与PLS0组相比，PLS1和PLS2治疗组CD31染色在4^th治疗周。CD31阳性细胞的数量随时间和分裂浓度依赖性的方式增加，并在手术后12周的PLS2治疗组中达到峰值。Vadasz等。[22据发现，VEGF（血管内皮生长因子，促进血管生成）水平的降低与ONFH进展相关，并促进VEGF合成诱导股骨头坏死中的小梁空间中的血管生成。Bai等人。[23]发现与单独的BMP-2相比，VEGF和BMP-2的组合增加了血管网络的形成，并显着增强了异位骨的形成。与先前的报道一致，血管生成因子CD31在PLS2处理组中高度表达（图7)．

3．4．载苏氨酸水凝胶抑制股骨头组织凋亡

在坏死股头中观察到许多动脉阳性凋亡骨细胞，而水凝胶植入后阳性细胞的数量显着下降。如图所示8，PLS0，PLS1和PLS2组细胞凋亡的速率是 ， ，和 ，分别在4周后， ， ，和 ，分别在12周后(图8 (b))．在第4周，与PLS0组相比，PLS1和PLS2组的凋亡率显着降低（ )．加入sPL后，组织中的凋亡率也显著降低( )．在第12周，与PLS0组相比，PLS1和PLS2组的凋亡率显着降低（ )．随着SPL的添加，PLS0和PLS1组之间的凋亡率，以及PLS1和PLS2组没有显着的统计显着性。在PLS0组，PLS1组和PLS2组中，与4周相比，手术后12周内组织的凋亡率显着降低（ )．

ER应激诱导的细胞凋亡可以通过独立于PERK / CHOP途径的方式抑制PRP外来凋亡[24］．PRP外泌体和地塞米松处理的骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)显示磷酸化的Akt (protein kinase B)和Bad (Bcl-2相关死亡启动子)水平升高，以及Bcl-2表达增强，表明PRP外泌体可以通过激活Akt/Bad/Bcl-2信号通路抑制细胞凋亡[24］．

尽管结果令人鼓舞，但我们的研究有两个主要的局限性。首先，我们建立了未发生股骨头塌陷的大鼠ONFH模型。但当我们进行核心减压时，软骨表面部分被破坏，模拟股骨头塌陷导致软骨的破坏。ONFH的病理情况与临床实际情况不一致，也排除了水凝胶使用的长期影响。因此，在这个阶段，无法确定水凝胶是否能够防止坍塌。相反，股骨塌陷将必须建立在一个大型动物模型，以证明软骨修复。其次，我们仅基于CD31的表达水平来评估血管生成，微血管造影可以更准确地观察新血管的形成。

4。结论

与热敏水凝胶相比，SPL加载的热敏水凝胶稳定地释放了降低成骨细胞凋亡水平，促进的骨质发生和血管生成的生物因素，并有效地防止了大鼠模型中ONFH的发育。因此，使用SPL加载热敏水凝胶的处理可以与核心减压手术组合使用，以改善股骨头坏死处理的结果。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者宣布没有竞争利益。

致谢

本研究由哈尔滨医科大学研究生科研与实践创新计划资助(批准号:YJSKYCX2019-39HYD)。

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