1。介绍
股骨头坏死(ONFH)的特点是osteocytic坏死和骨髓坏死的不足或完全缺乏血液供应的软骨下骨。目前全球ONFH的3000万例确诊病例,其中812万是仅在中国,的发病率也逐年增加,(
1]。最近在中国ONFH患者进行多中心研究发现,使用类固醇被确定为致病因素26.35%的男性患者和女性患者的55.75% (
2]。长期使用大剂量糖皮质激素(GC)可能会影响细胞的分化在股骨头和改变骨代谢,从而减少股骨头血管生成活动,引发缺血性缺氧。
在缺乏一个有效的治疗方法,ONFH可以进展成软骨下骨崩溃在1 - 3年内80%的病人。软骨下骨崩溃原因导致相当大的痛苦和髋关节功能受损,最终将需要全髋关节置换术(THA)。然而,因为那不是年轻患者的最佳选择,需要尽早采取行动减缓ONFH的进展和延缓关节置换的时代。
核心减压(CD)是一种joint-preserving手术(
3],适用于早期ONFH患者完整的节理面(
4]。它可以减少股骨头髓内的压力,加速骨再生后,可能会形成一个腔核心减压,和反向股骨头坏死(
5),从而延缓疾病的进展,防止股骨头塌陷。然而,37%的患者接受核心减压治疗进展股骨头塌陷(
4]。
富含血小板血浆(PRP)可以通过恢复加速骨形成成骨细胞增殖和活化通路,促进血管新生和骨生成
6),这是一种策略,可以用来ONFH的病理进程。PRP能促进软骨形成生长因子(
7和骨生成
8),因此可以减轻ONFH (
9]。此外,血小板溶解产物(PL)生长因子也促进各种细胞的趋化迁移(
10,
11]。PL可以被纳入生物支架,可以保持其有利影响的时间较长(
7,
12制备方法的基础上,激活,初始血小板浓度,捐赠
12,
13]。市场繁荣期血小板溶解产物(sPL)准备从PRP通过超低温度冻融。富含生物活性因子,能促进组织再生和血管重建。然而,生长因子在sPL的短半衰期限制了他们的生物效应
在活的有机体内。此外,高剂量和/或频繁sPL管理局不是经济可行的,并可能导致有毒副作用。sPL的控释富含亲水性大分子如生长因子可以显著提高其功效
在活的有机体内。
具有高分子量聚合物(
14),如聚lactic-co-glycolic酸(PLGA),可以作为有效的
在活的有机体内药物输送系统由于其生物相容性和生物降解性。高分子材料可以保护sPL的组织微环境,导致控释。骨是一种天然organic-inorganic-inorganic复合材料,主要由胶原蛋白和羟基磷灰石(HA, Ca10(PO4)6(哦)2))。各种各样的有机-无机复合材料,可以模仿的成分和结构的骨头已经开发出来。锶(Sr)是一种微量元素在人体中发现,促进骨形成和骨质疏松性组织的愈合。因此,我们设计了一个复合水凝胶由热敏PLGA,骨矿物质的羟磷灰石(HA),和锶
15,
16]。然而,水凝胶可以流到其他地方的缺陷,和水凝胶的性质需要改变,以防止流出的水凝胶。
热敏PLGA / HA / SrCl2水凝胶含有sPL被用来重建退化骨组织结合CD手术。sPL是缓慢释放温度敏感水凝胶的方式,导致加速骨修复股骨头的核心减压和ONFH之后。因此,我们的研究奠定了基础为热敏水凝胶材料的临床应用,以及成本的大大降低治疗ONFH患者。
2。材料和方法
2.1。材料
热敏PLGA购买从济南Daigang生物材料有限公司,有限公司SrCl2购买化学试剂国药控股有限公司、哈购买从阿拉丁,脂多糖是从Sigma-Aldrich Inc .(美国)购买的,而磺酸甲酯购买辉瑞制药(杭州)。
2.2。sPL的准备
sPL是独立于人类血液通过超低温度冻结,如前所述[
17]。总之,PRP被离心法提取新鲜全血。PRP ultralow-frozen使用融化准备和专利技术,细胞因子文化sPL可以有效地诱导、激活和培养。
2.3。水凝胶的合成和表征
热敏PLGA \ SrCl2和HA混合的比例94:5:1,和混合添加到0,250,500
μl (sPL电磁搅拌器。结果PLS0、PLS1 PLS2水凝胶冻干,喷金,及其形态学观察在扫描电子显微镜(SEM)(日本电子有限公司)。
测量持续释放创建请水凝胶的生物活性因子,后者被放置在干净的瓶(
n
=
4
每组)和完全淹没在4毫升的模拟体液(SBF)。瓶被密封在水浴和孵化,在中收集和整除天3、6、9、12、15、18日21日24日27日和30日。VEGF和TGF -的浓度
β测量使用特定ELISA试剂盒(Jingmei、江苏)。
Preweighed冻干凝胶在去离子水孵化30°C, 34°C, 38°C, 42°C 1小时测量水凝胶肿胀。肿胀的凝胶被检索,沾上污渍的去除多余的水和重。胶体含水量(SR)计算使用公式:
W
1
−
W
0
/
W
0
,在那里
W
0
和
W
1
分别显示温度和干重的重量。
2.4。体内<斜体> < /斜体>实验
2.4.1。建立一个ONFH模型和治疗
所有动物实验按照动物的人道的使用和护理指南由美国国立卫生研究院的制定,实验动物都是照顾,所有操作在动物福利伦理委员会批准的实验动物使用和哈尔滨医科大学第一附属医院(伦理批准号:2019029)。
雄性SD大鼠体重280 - 300 g在动物饲养中心,哈尔滨医科大学第一附属医院和美联储
随意在标准实验室饮食和水。总共27个老鼠通过静脉注射10
μ克/公斤脂多糖(LPS),其次是24 h后三个肌肉内注射20毫克/公斤的磺酸甲酯(MPS)然后每隔24小时。Osteonecrotic病变首次出现在手术后两周,继续出现在术后6周(
18]。三个老鼠的安乐死,组织样本收集CT和组织病理学检查。一旦ONFH的诊断证实,其他老鼠被随机分配到PLS0 PLS1, PLS2组(
n
=
8
)。老鼠使用3%戊巴比妥钠麻醉,和右臀部被曝光使用前部和后部的方法,同时保留主要的股骨头血管。髋关节被切断开关胶囊,阻止转移和股骨头颈被暴露。减压进行从大转子的核心使用钻股骨头,病变充满了请。植入地区布满了骨蜡,和伤口被关闭。所有动物肌内注射庆大霉素(4毫克/公斤)之前和之后的操作,以防止伤口感染。
2.4.2。放射学分析
四只动物从每组都牺牲了用于微ct分析4th和12th周参与。股骨头的变化检测,并且采用了QuantumGX CT成像系统(美国PerkinElmer)。一个各向同性20毫米立体像素间距数据集获得使用总旋转360°和下步长为0.5°80千伏的力量,和股骨头的计算机生成的三维模型构造的。
2.4.3。组织病理学分析
从每组动物被用于的组织学观察4th和12th周后手术。组织样本固定用4%多聚甲醛一段1周和脱钙使用20% EDTA溶液一段一个月。然后,样本使用酒精梯度脱水,并使用二甲苯澄清。此后,组织是嵌入在石蜡,切成4
μ米厚的部分,其次是苏木精和伊红(他),马森,高山染色,每标准协议。
2.4.4。Tunel分析
组织部分被孵化与Tunel试剂使用特定Tunel试剂盒按照制造商的指示。颜色是由应用0.03%轻敷5分钟,和幻灯片与苏木精复染色。Tunel-positive细胞的数量统计在四个随机微观领域200 x放大。细胞凋亡率(%)的比例计算的数量Tunel-positive细胞细胞的总数。
2.4.5。免疫组织化学
组织部分探讨了使用初级I型胶原抗体和CD31,紧随其后的是二级抗体/ Cy5共轭。与苏木精复染色后,幻灯片荧光显微镜下观察(徕卡,曼海姆,德国)或光学显微镜(徕卡,曼海姆,德国)。
2.5。统计分析
数据表示为
的意思是
±
标准
偏差
(SD)。单向方差分析(方差分析)是用于比较数据之间的组。一个
P
值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果与讨论
3.1。水凝胶的表征
我们sPL加载到一个可持续释放温度敏感性水凝胶和更强的治疗效果。如图
1(一),冷冻水凝胶有部分多孔结构,而sPL整合降低了粒子的大小。
(a)代表SEM图像显示的结构冻干热敏的水凝胶。(b, c)释放的生长因子加载sPL水凝胶。(d)与温度有关的含水量的变化。
![]()
聚合物水凝胶稳步释放TGF -
β和VEGF在30天(数字
1(b)和
1(c))取决于封装sPL的数量。正如所料,没有明显的从PLS0释放生长因子。此外,水凝胶膨胀到2.1,2.8,和3.9倍,它的体积在30°C时加热到34°C, 38°C,分别和42°C(图
1(d))。
3.2。sPL-Loaded水凝胶缓解骨坏死和促进骨形成
ONFH模型建立了使用有限合伙人和国会议员,正如前面所描述的吴et al。
19]。成像和骨坏死的组织学诊断测试清楚地演示了6周,随着骨髓坏死,脂肪分布异常,股骨头的内部压力增加。股骨头坏死的核心减压通道是构造,水凝胶是准确植入没有任何损伤的肌肉,神经或血管。所有的动物都是健康的,没有观察到明显的感染的迹象。几项研究已经报道的成骨生长因子在PL (
10,
20.),和封装的sPL水凝胶支架增强组分的保留能力增长的因素。如图
2,在横向和纵向CT图像显示PLS1部分修复坏死地区植入4周后,与PLS0组相比,而PLS2显示更强的治疗效果。坏死区仍可见即使在12周PLS0组但一直主要在老鼠PLS1处理和PLS2重组。
代表日冕,横向和矢状面ct机扫描不同的治疗组。
![]()
股骨头坏死的组织学检查显示,ONFH感应导致稀疏蛀牙,扩散斑点像骨髓坏死,稀疏的小梁骨髓腔有大量脂肪细胞。注入的水凝胶没有触发任何局部炎症反应或纤维化。PLS2导致新骨的形成和骨小梁的4th星期后植入导致骨坏死和造血坏死。同样,PLS0 PLS1管理局导致新骨的形成,但没有引起小梁排列(数据
3和
4)。与上面提到的观察结果一致,骨骼组织表达成骨因子高山和胶原蛋白我是所有组中观察到,和积极的染色程度增加PLS-implanted组sPL浓度的方式(数字
5和
6)。
他治疗股骨头坏死后染色(40 x)。
![]()
组织病理学马森染色ONFH治疗后4周和12周进行x (40)。
![]()
高山染色的组织病理学成骨的标记(200 x)。
![]()
组织病理学类型我染色了骨组织的构成(200 x)。
![]()
3.3。sPL-Loaded水凝胶促进血管生成
此外,生长因子在sPL促进成骨细胞的粘附和增殖,同时通过血管内皮细胞的增殖促进血管生成。血小板内皮细胞粘附molecule-1 (CD31),这是典型的内皮血统(
21]。如图
7与PLS0组相比,CD31染色增加PLS1和PLS2治疗组在4th周的治疗。CD31-positive细胞的数量增加时间和sPL浓度的方式和在PLS2治疗组的峰值,手术后12周。Vadasz et al。
22)发现,降低VEGF(血管内皮生长因子,促进血管生成)水平与ONFH发展和促进VEGF合成诱导血管生成在股骨头坏死小梁的空间。白等。
23)发现,独自BMP-2相比,VEGF和BMP-2增加血管网络的形成和显著提高异位骨的形成。与先前的报道一致,血管生成因子CD31 PLS2-treated组(图中高度表达
7)。
组织病理学CD31染色显示股骨头血管的形成(200 x)。
![]()
3.4。股骨头sPL-Loaded水凝胶抑制细胞凋亡的组织
众多Tunel-positive凋亡坏死股骨头骨细胞观察,而水凝胶植入后阳性细胞的数量大幅减少。如图
8PLS0,细胞凋亡,PLS1, PLS2组
31.48
±
1.80
%
,
13.60
±
1.27
%
,
8.05
±
0.27
%
4周后,分别
8.59
±
1.55
%
,
4.97
±
0.29
%
,
3.08
±
0.92
%
(图12周后,分别
8 (b))。第4周,相比之下PLS0集团PLS1和PLS2组织的细胞凋亡率显著降低(
P
<
0.05
)。sPL的增加,组织的细胞凋亡率也显著降低(
P
<
0.05
)。在12周,与PLS0组相比,PLS1和PLS2组织的细胞凋亡率显著降低(
P
<
0.05
)。的sPL, PLS0和PLS1团体之间的细胞凋亡率,和PLS1 PLS2组无显著统计学意义。PLS1集团PLS0组和PLS2集团与4周相比,在术后12周组织的细胞凋亡率显著降低(
P
<
0.05
)。
(一)Tunel染色进行ONFH治疗后第4周和12周(200 x)。(b)使用Tunel-staining凋亡率计算的结果。
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![]()
ER应激可以抑制细胞凋亡PRP液的方式独立于活跃/切途径[
24]。骨间充质干细胞(bmsc)与PRP液和地塞米松治疗显示增强的磷酸化Akt(蛋白激酶B)和坏(bcl - 2相关死亡发起人)水平,以及增强bcl - 2表达,表明PRP液可以通过激活一种蛋白激酶抑制细胞凋亡/坏/ bcl - 2信号通路(
24]。
尽管令人鼓舞的结果,我们的研究有两个主要的局限性。首先,我们建立了一个ONFH鼠模型大鼠,没有开发股骨头塌陷。然而,当我们执行核心减压,软骨表面部分,模拟软骨的破坏的结果股骨头坍塌。ONFH的病理条件不符合实际的临床情况,也排除了使用水凝胶的长期影响。因此,在这个阶段,是不可能确定水凝胶可以防止崩溃。相反,股崩溃必须建立在一个大动物模型证明软骨修复。第二,我们评估血管生成仅基于CD31表达水平,和microangiography可以用来观察新血管的形成以更精确的方式。