mir - 129 - 5 - p促进成骨的通过压抑Dkk3 bmsc的分化和骨再生

文摘

客观的。越来越多的证据表明小分子核糖核酸(microrna)在成骨分化发挥至关重要的作用。然而,相关的机制仍然是难以捉摸的。本文旨在探索mir - 129 - 5 - p的作用在调节骨髓间充质干细胞(BMSC)分化和骨再生的体内和体外。方法。bmsc被转导mir - 129 - 5 - p模仿,mir - 129 - 5 - p抑制剂,和消极的控制慢病毒。BMSC分化为成骨细胞的能力测试,碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色(ARS)。成骨的基因的表达(Runx2、Bmp2 OCN)是通过定量rt - pcr和免疫印迹检测。头顶缺陷的小鼠模型研究了由ct机、免疫组织化学、组织学检查。荧光素酶报告基因实验进行确认Dkk3之间的绑定和mir - 129 - 5 - p。转染实验,lipofectamine 3000被用来使转染pcDNA-Dkk3 bmsc Dkk3过表达。Coimmunoprecipitation和immunofluorescent本地化分析包括探索Dkk3和的作用β连环蛋白。结果。mir - 129 - 5 - p是诱导bmsc和MSC细胞系C3H10T1/2细胞成骨的媒介。mir - 129 - 5 - p的超表达显著促进成骨的bmsc体外分化。此外,bmsc转导mir - 129 - 5 - p模仿表现出更好的骨再生与bmsc体内转导与控制。荧光素酶和免疫印迹数据显示Dickkopf3 (Dkk3)是一个目标基因mir - 129 - 5 - p和Dkk3的表达被抑制在bmsc转导mir - 129 - 5 - p模仿但增强bmsc转导mir - 129 - 5 - p抑制剂。此外,Dkk3与之交互β直接连环蛋白。结论。mir - 129 - 5 - p促进成骨的bmsc的分化和骨再生,和mir - 129 - 5 - p / Dkk3轴可能是新的潜在目标治疗骨缺损和骨质流失。

1。介绍

广泛需要高效的骨再生,因为骨缺陷经常发生由于各种原因,如肿瘤,感染,骨骨折。近年来,间充质干细胞(msc)移植中最广泛的研究和应用和治疗在基础实验和临床试验(1]。他们被广泛应用于骨再生的应用由于其自我更新,成骨能力,和较低的免疫原性(2]。像大多数干细胞,msc使用几个关键转录因子来编排他们的增殖和分化3,4]。此外,越来越多的表观遗传监管机构参与发现了MSC血统的选择。虽然生物功能msc的认识和他们研究骨组织工程取得了极大的过程中,仍有某些调节器未定义(5,6]。

小分子核糖核酸(microrna)短,通过转录后的内生非编码rna功能抑制特定目标mrna调节各种生物过程(7,8]。几个microrna的分子机制在骨再生的过程已经被调查9- - - - - -11]。通过镇压CRY2 miR-7-5p诱导成骨分化,这抑制了时钟/ BMAL1复杂的表达式(12]。mir - 136 - 3 - p改善饮酒导致的骨量减少和随之而来的恢复骨量type-H血管形成在一个小鼠模型(13]。然而,mir - 451 a加速骨质流失在骨质疏松症(通过Bmp6信号14]。这些研究表明,对osteogenesis-related microrna的功能和机制的研究将有助于对骨形成潜在的策略。mir - 129 - 5 - p是一个潜在的治疗剂因其与细胞凋亡、细胞周期和药物抗性(15- - - - - -17]。体育锻炼是促进成骨的承诺,mir - 129 - 5 - p表达式中增加体育锻炼(18]。尽管mir - 129 - 5 - p被报道通过减少促进成骨细胞分化的人类bmsc STAT1的水平(19)的详细机制mir - 129 - 5 - p在骨和骨再生并不完全理解。

在目前的研究中,我们已经确定了超表达mir - 129 - 5 - p的bmsc促进其增殖和成骨细胞分化。移植的bmsc转导mir - 129 - 5 - p模拟加速骨再生。此外,我们的研究结果表明,mir - 129 - 5 - p施加其影响直接针对Dkk3-mediated激活Wnt /β连环蛋白通路。我们的研究发现mir - 129 - 5 - p / Dkk3轴导致骨和骨再生,这可能提供新的治疗策略来维持稳定的骨在骨缺损或骨骼疾病。

2。材料和方法

2.1。动物

所有实验过程在本研究中被批准,依法执行指南医学伦理委员会的实验动物中心北京基本医疗科学研究所。两到八周大的雄性C57BL / 6 j小鼠购自北京河实验动物技术至关重要。所有的老鼠被安置在一个标准的动物设施控制温度(21°C)与光周期(12 h光明/ 12 h黑暗)免费的水和食物。综述了体内实验过程和实验动物医学伦理委员会批准的中心中国军事医学科学院。

2.2。隔离和bmsc的文化

胫骨和股骨的bmsc分离降生雄性C57BL / 6 j小鼠如前所述[20.]。短暂,骨髓是刷新5毫升α使用注射器针头mem培养基(Gibco),直到骨骼变得苍白。紧凑的骨头仔细切除3毫升的芯片和转移αmem含10%胎牛血清(的边后卫)的1%胶原酶II 2小时。enzyme-treated骨芯片被洗了三次,然后培养αmem补充10%的边后卫和1%青霉素和链霉素在37°C和5%湿润孵化器有限公司₂。培养基是每2天更换一次。通过每周两次的分流比1:4或者1:3。细胞通道3 - 4被用于后续的实验。

2.3。慢病毒转导

重组慢病毒载体编码mir - 129 - 5 - p模仿,mir - 129 - 5 - p抑制剂,消极控制microrna与绿色荧光蛋白(GFP)买来GeneChem(上海,中国)。bmsc是转导如前所述21]。简而言之,bmsc被播种在six-well 10板的密度⁵每口井与慢病毒转导在莫伊30(模拟)和莫伊20(抑制剂和消极控制)的血清αmem (Gibco) HitransG (GeneChem、上海、中国)为4小时,并配以中含有20%的边后卫。文化的24小时后,细胞所取代αmem包含10%的边后卫。GFP表达被荧光显微镜检查。进行后续实验,直到通过GFP表达病毒转导效率在90%以上。

2.4。细胞转染

pcDNA3.1-Dkk3和pcDNA3.1-vector从Sangon购买(上海,中国)。转染实验,lipofectamine 3000(美国表达载体)被用来使转染Dkk3或向量构造成bmsc (pcDNA3.1: 50海里)。转导效率被免疫印迹分析。

2.5。成骨细胞分化诱导

成骨诱导,bmsc通道3 - 4被播种在six-well板( 每)osteoblast-specific感应介质包含50 (Cyagen,中国)μg / ml抗坏血酸,1毫米地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐。培养基是每2天更换一次的14天。然后,细胞被收集和分析表明天。

2.6。碱性磷酸酶染色(高山)和活动分析和茜素红染色(ARS)

成骨诱导后7和14天,样品在室温下和4%多聚甲醛固定30分钟,然后用PBS洗3次。碱性磷酸酶试剂盒(美国Abcam、剑桥、马)是用于执行高山染色根据制造商的建议。高山活动检测使用商业套装(# P0321S Beyotime生物技术,中国),和bicinchoninic酸(BCA)方法进行检测后的蛋白质浓度标准协议。

茜素红染色,矿化结节和40毫米孵化ARS染料( ,美国σ)30分钟37°C,然后用PBS冲洗。染色细胞板拍摄。10%(染细胞溶解了。 )氯化十六烷吡啶,提取的溶液被吸光度测量在562 nm量化染色。结果进行至少三个独立的实验。

2.7。细胞生存能力分析

细胞被播种在96 -孔板的密度 细胞每口井。包含10个细胞被孵化的新媒介μl细胞计数Kit-8(中国Beyotime CCK-8) 1、3、5和7天。的光学密度CCK-8被标以450海里(热MultiskanFC)。实验进行了三次。

2.8。定量rt - pcr

总RNA提取使用商用转录酶工具包(Toyobo,大阪,日本)试剂盒(Sigma-Aldrich)根据制造商的指示,和总RNA是量化使用NanoDrop 2000(热)。mir - 129 - 5 - p的决心之后,产品的指令(B532451互补脱氧核糖核酸的合成,B532461 PCR)从Sangon生物技术(上海,中国)。互补脱氧核糖核酸被用作模板在定量PCR SYBR绿色(Toyobo)来确定特定的基因表达。反应是运行在一式三份。相对信使rna或microrna是内生规范化β肌动蛋白或U6。使用2表达水平计算^{- - - - - -ΔΔCt}方法确定的褶皱变化实验和对照组之间的表达式。本研究中使用的microrna和信使rna引物序列表中列出1。

2.9。免疫印迹

首次用PBS和细胞溶解细胞里帕缓冲与完整的蛋白酶抑制剂(Solarbio,北京)。蛋白质量化后,样本12% sds - page凝胶分离和转移到PVDF膜(美国Bio-Rad大力神,CA)根据标准的过程。脱脂牛奶和孵化的膜被封锁在4°C一夜之间主要抗体。抗体Dkk3 (# 187532), Runx2(# 23981),和Ki67(# 15580)从Abcam购买。抗体β连环蛋白(# 8480),原癌基因(# 18583),和Gsk-3β(# 12456)购买的细胞信号技术。抗体Bmp2 (AF5163) OCN (DF12303)β肌动蛋白(AF7018)获得亲和力生物科学。之后,膜与二次孵化抗体室温1小时,其次是TBST洗了30分钟。这些墨迹可视化使用Tanon图像扫描。ImageJ用于定量分析的墨迹。

2.10。荧光素酶检测

潜在的mir - 129 - 5 - p Sclerostin 3结合位点与TargetScan UTR预测(http://www.targetscan.org)。mir - 129 - 5 - p的关系和Dkk3交互证实了荧光素酶记者分析。序列包含了野生型(Dkk3-wt)或突变(Dkk3-mut)种子区域Sclerostin合成和克隆到一个荧光素酶报告质粒。主机293 t细胞被播种在48-well板( 细胞每)表示记者构造和renilla荧光素酶质粒。转染24小时后,renilla和萤火虫荧光素酶的活动是使用荧光分光光度计测量的(热MultiskanFC)根据制造商的指示。相对转录活动规范化到相应的车辆控制的价值。

2.11。Coimmunoprecipitation

免疫沉淀反应分析,细胞被收集和中断在裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂。总细胞提取物与事先批准混合蛋白G(# 9007,细胞信号技术,美国)然后孵化1μg主要抗体β连环蛋白或消极控制兔免疫球蛋白(# 2729,细胞信号技术,美国)在一夜之间在4°C。珠子被离心收集,清洗三次使用洗涤缓冲,然后像之前描述的那样受到西方墨点法。

2.12。动物外科手术

C57BL / 6 j小鼠(8周)被随机分为3组,包括miR-NC集团( ),mir - 129 - 5 - p模仿集团( ),和mir - 129 - 5 - p抑制剂组( )。背地区碘载体消毒后,皮肤和皮下组织沿矢状缝切割。头顶被曝光,创建一个3毫米直径的一个缺陷两边用牙钻(22]。主要关闭切口在无菌条件下进行不同组的基底膜基质(100μl)包含200万BMSC-transducted轻轻植入新形成的缺陷。美联储4或8周后与正常饮食,小鼠安乐死戊巴比妥钠腹腔注射(10毫克/公斤体重)为后续测量。

2.13。Microcomputed断层扫描(ct机)分析

4和8周后,颅顶的骨头是收获并受48小时的固定在4%多聚甲醛被微ct成像系统分析(PerkinElmer,量子GX沃尔瑟姆,美国)。扫描参数设置如下:88年90千伏的电压和电流μ一、集成时间14分钟。体素的大小被选定的各向同性和固定在4.5μm。扫描轴调整是正常的额平面。随后,新骨形成的三维结构在手术地点正是评估使用辅助histomorphometric软件(美国堪萨斯州AnalyzeDirect)。此外,测量骨体积组织体积的比值(BV /电视)和骨矿物质密度(BMD)的新形成的矿物也进一步识别出任何差异分析三组。

2.14。组织学、免疫组织化学和免疫荧光分析

三维histomorphometric分析后,头顶样本固定在4%多聚甲醛,在10% EDTA脱钙,在自来水洗,脱水,diaphanization,嵌入在石蜡。组织被切割成4μm切片苏木精和伊红染色和免疫组织化学())Dkk3, Runx2, OCN。简要描述,样品接受治疗的压力锅1分钟在125°C EDTA缓冲区(pH值8.0),然后被煮熟的另一个2分钟和30年代在100°C。样品被允许冷却至室温在孵化前3%的过氧化氢,持续15分钟。随后,一夜之间,部分被孵化在4°C主要抗体,然后孵化顺序与二次抗体和diaminobenzidine 20日20日和10分钟。最后,幻灯片和苏木精复染色(Abcam),脱水和安装。

免疫荧光分析,组织切成6μ米的部分。冰冻切片是孵化14 h在4°C主要抗体Dkk3, Ki67,β连环蛋白和孵化CY3-conjugated二级抗体(美国ab6939 Abcam, MA)在室温下2 h。幻灯片激光扫描共焦显微镜下观察(徕卡,位于德国)。

2.15。统计分析

使用SPSS软件进行统计分析(版本20.0.0.0)和GraphPad Prism 8.0(美国圣地亚哥GraphPad软件)。定量数据被表示为 。组间差异的统计分析是由学生完成 - - - - - -测试。单向方差分析(方差分析)是用于以上三组之间的比较。 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。mir - 129 - 5 - p表达式中诱导成骨分化

microrna监管者在骨和骨形成至关重要。检查mir - 129 - 5 - p的影响在成骨分化,mir - 129 - 5 - p的表达分析在bmsc C3H10T1/2细胞成骨分化处理介质(Cyagen,中国)。如数据所示1(一)和1 (b),有轻微upregulation mir - 129 - 5 - p在成骨细胞分化的初始阶段(0到天7),而mir - 129 - 5 - p的表达显著增加之后(7天14)。增加时间被发现在BMSC C3H10T1/2细胞成骨诱导的最高点观察到14天(BMSC: 5.49折, ;C3H10T1/2细胞:8.35折, )。这些数据表明,mir - 129 - 5 - p可能参与成骨分化过程。

3.2。mir - 129 - 5 - p促进细胞增殖

进一步调查的参与mir - 129 - 5 - p在骨,bmsc培养和转导与慢病毒载体包含mir - 129 - 5 - p模仿,mir - 129 - 5 - p抑制剂,分别或控制(数控)慢病毒。转导效率证实了GFP表达通过荧光显微镜分析(数据未显示)和定量rt - pcr。mir - 129 - 5 - p的表达显著增加bmsc转导mir - 129 - 5 - p模仿和减少后转导mir - 129 - 5 - p抑制剂(图2(一个))。Ki67被广泛认为是细胞增殖的生物标志物。免疫荧光染色(图2 (b)和2 (c))和免疫印迹分析(数据2 (d)和2 (e))表示,Ki67的表达水平显著增加mir - 129 - 5 - p模仿组相比,数控和mir - 129 - 5 - p抑制剂组。然后我们探讨的影响mir - 129 - 5 - p过度和可拆卸的bmsc体外细胞增殖。细胞计数Kit-8 bmsc的(CCK-8)结果表明,扩散能力下降了10.70%,23.08%,39.30%,和19.21%的天1,3,5,7 posttransduction mir - 129 - 5 - p的抑制剂,与负控制相比microrna (NC)(图2 (f), 或 )。与此同时,在综合治疗mir - 129 - 5 - p模仿,细胞增殖增加了11.51%,38.16%,24.27%,和24.32%的天1,3,5,7(图2 (f), 或 )。总的来说,这些结果表明,mir - 129 - 5 - p bmsc的促进细胞增殖。

3.3。mir - 129 - 5 - p增强成骨细胞分化和矩阵体外矿化

接下来,我们调查的影响,mir - 129 - 5 - p bmsc的成骨分化。归纳了慢病毒转导后72 h。如数据所示3(一个)和3 (b)高山强度,mir - 129 - 5 - p模仿组2.32折( )和3.60折( )数控组高于7和14天,分别。同样,ARS强度mir - 129 - 5 - p模仿组3.02折( )和2.59折( )高于数控组在14和21天,分别为(数字3 (c)和3 (d))。高山和ARS染色数据表明高山活动和钙沉积显著增强了mir - 129 - 5 - p过度,而他们大大减毒和mir - 129 - 5 - p击倒。定量rt - pcr和免疫印迹分析被用来检查成骨的基因的表达。我们发现mRNA水平的Runx2, Bmp2, OCN显著的高于mir - 129 - 5 - p模仿但低mir - 129 - 5 - p抑制剂组相比,数控(图3 (e))。相应地,Runx2的蛋白质含量,高Bmp2, OCN mir - 129 - 5 - p模仿但显著降低mir - 129 - 5 - p抑制剂组相比,其控制(图3 (f))。综上所述,我们的研究结果表明,mir - 129 - 5 - p在成骨细胞分化中发挥了积极的监管作用,随后促进矿化。

3.4。mir - 129 - 5 - p加速骨再生在头顶缺陷的小鼠模型

进一步探索mir - 129 - 5 - p的函数在骨形成,头顶缺陷的小鼠模型。bmsc转导与慢病毒包含mir - 129 - 5 - p模仿或控制microrna的加载在基底膜基质支架,分别,然后植入小鼠颅盖的缺陷。老鼠牺牲在植入后4周和8,然后,头骨样本为ct机收集分析。从日冕和矢状视图、新骨再生中检测出缺陷区域内每组(直径:3毫米)。BMSC过度mir - 129 - 5 - p显著增强的新骨形成与对照组相比(图4(一))。骨histomorphometrical分析显示,骨形成相关参数骨体积/骨总量(BV /电视)和骨矿物质密度(BMD)增加。对准确的计算数据,骨头generation-related参数的定量测量。BV /电视mir - 129 - 5 - p模仿组(4周: ;8周: )远远高于NC组(4周: ;8周: )(图4 (b))。的BMD, mir - 129 - 5 - p模仿组(4周: 克/厘米³;8周: 克/厘米³)也显著高于控制对应(4周: 克/厘米³;8周: 克/厘米³)(图4 (c))。Histomorphometrical分析已由在8周)染色。如图4 (d)观察,更多的骨突结构和胶原沉积的bmsc mir - 129 - 5 - p超表达组。此外,免疫组织化学数据显示成骨基因Runx2和OCN高度表达mir - 129 - 5 - p模仿转导组(图4 (e))。因此,mir - 129 - 5 - p upregulation对骨再生有着积极的影响。

3.5。击倒mir - 129 - 5 - p抑制骨再生

进一步证实上述观察体内,bmsc转导与慢病毒包含mir - 129 - 5 - p抑制剂或控制microrna (NC)移植到小鼠颅盖的缺陷。如图5(一个),mir - 129 - 5 - p抑制剂抑制新骨形成与NC组。三维重建显示,新骨形成mir - 129 - 5 - p抑制剂组比,NC组冠状及矢状视图。BV /电视减少mir - 129 - 5 - p抑制剂组(4周: ;8周: )的价格相比NC组(4周: ;8周: )(图5 (b))。BMD mir - 129 - 5 - p抑制剂组(4周: 克/厘米³;8周: 克/厘米³)也显示相同的相对影响BV /电视相比,NC组(4周: 克/厘米³;8周: 克/厘米³)(图5 (c))。少)染色进一步证实,新形成的骨沿缺陷边缘组织在场mir - 129 - 5 - p抑制剂组比NC组(图5 (d))。此外,免疫组织化学数据显示成骨基因Runx2和OCN显著降低在mir - 129 - 5 - p抑制剂转导组(图5 (e))。综上所述,这些研究结果进一步证实了积极影响mir - 129 - 5 - p在体内骨再生。

3.6。Dkk3直接mir - 129 - 5 - p的目标

破译下游基因受mir - 129 - 5 - p,我们预测可能的目标mir - 129 - 5 - p TargetScan的帮助下,miRDB, miRWalk(图6(一))。的结果分析,我们选择Dkk3,相关监管机构的Wnt信号通路与骨应该密切联系。图6 (b)显示mir - 129 - 5 - 3 p结合位点UTR Dkk3信使rna。此外,我们进行了荧光素酶记者化验证实的交互mir - 129 - 5 - p和Dkk3。我们转染构造成293 t细胞,明显减轻细胞中观察到的荧光素酶活性与野生型Dkk3 cotransfected 3UTR和mir - 129 - 5 - p在36小时(0.60折, )但与突变细胞转染3UTR。结果表明,荧光素酶的活性Dkk3 3UTR显著减少mir - 129 - 5 - p -转染293 t细胞(图6 (c))。这些发现表明,假定的mir - 129 - 5 - p结合位点位于3UTR Dkk3信使rna的功能mir - 129 - 5 - p管理网站。为目的的额外澄清之间的连接现有mir - 129 - 5 - p和Dkk3,初步实验用免疫印迹显示Dkk3蛋白质水平的改变。如图6 (d)、免疫印迹结果表明Dkk3水平显著下降了mir - 129 - 5 - p模仿和增加了mir - 129 - 5 - p抑制剂( 或 )。免疫荧光染色分析还表明,mir - 129 - 5 - p模仿组Dkk3染色阳性细胞的比例最低,而Dkk3染色阳性细胞的面积是最大的mir - 129 - 5 - p抑制剂组(数字6 (e)和6 (f))。一致,Dkk3新骨的表达较低的mir - 129 - 5 - p模仿但高mir - 129 - 5 - p抑制剂组(数字4 (e)和5 (e))。总的来说,这些发现证实Dkk3直接mir - 129 - 5 - p的目标。

3.7。mir - 129 - 5 - p规范通过压抑Dkk3 BMSC成骨分化

进一步证实Dkk3作为调停人的角色mir - 129 - 5 - p和成骨细胞分化,骨与Dkk3超表达。转染效率pcDNA-Dkk3向量被免疫印迹(图检测7(一))。高山和农业研究所数据显示,高山显著增加活动和钙结节形成和mir - 129 - 5 - p过度;然而,Dkk3超表达可以抑制mir - 129 - 5 - p的影响成骨分化(图7 (b))。调查的生物功能mir - 129 - 5 - p和Dkk3骨生成,我们发现的蛋白质和mRNA水平成骨的标记bmsc转染mir - 129 - 5 - p模仿或pcDNA-Dkk3。一致,rt - pcr和免疫印迹结果都表明,mir - 129 - 5 - p模仿Runx2明显增加,Bmp2,和OCN表达成骨分化后,虽然过度Dkk3压抑的促销效果mir - 129 - 5 - p(数字7 (e)和7 (f))。这些结果表明,mir - 129 - 5 - p通过压抑Dkk3增强成骨细胞的分化。

3.8。mir - 129 - 5 - p Wnt /激活β连环蛋白通路及其下游bmsc成绩单因素

我们继续进行了深入的调查,成骨细胞分化的机制被mir - 129 - 5 - p。规范化Wnt /β连环蛋白通路已经被证明是至关重要的骨骼内稳态和BMSC成骨分化。探索是否mir - 129 - 5 - p的影响通过Wnt /骨生成的过程β连环蛋白通路,相对关键蛋白质bmsc对待mir - 129 - 5 - p模仿,mir - 129 - 5 - p抑制剂,或控制microrna。结果表明,信使rna(图8(一个))和蛋白表达(数字8 (b)和8 (c))的水平β连环蛋白、Runx2和原癌基因的超表达均显著升高mir - 129 - 5 - p和抑制的击倒mir - 129 - 5 - p。此外,我们的数据也表明,信使rna(图8(一个))和蛋白质(数据8 (b)和8 (c))的表达glycogen-synthetase-kinase-3β(Gsk-3β)明显降低模拟组与NC组。免疫荧光染色显示的表达β连环蛋白也是最高的mir - 129 - 5 - p模仿组(图8 (d))。我们证明了几个方法,mir - 129 - 5 - p Wnt /激活β连环蛋白通路和积极的影响其下游的活动分子,这表明mir - 129 - 5 - p的规定对成骨细胞分化的可能是通过Wnt /β连环蛋白通路。

3.9。Dkk3互动β连环蛋白直接

之前的报告进行验证β连环蛋白,Wnt信号通路的关键分子,为骨体内平衡是至关重要的,BMSC成骨分化。Dkk3可能调节成骨分化,但分子机制仍不清楚。基于以上研究,我们假设Dkk3可能连接β连环蛋白在骨生成。为了进一步验证我们的假设,我们首先应用immunofluorescent染色跟踪Dkk3和的位置β连环蛋白。我们的结果显示重叠β连环蛋白和Dkk3 C3H10T1/2(图9(一个))。然后,我们执行coimmunoprecipitation实验,表明Dkk3可以绑定到β在C3H10T1/2连环蛋白细胞(图9 (b))。在这其中,我们预测某些Dkk3和之间的关系β连环蛋白。

4所示。讨论

骨缺损有很高的发病率由于创伤、肿瘤、或先天性因素,导致病人患有肌肉萎缩,骨量减少,增加骨折的风险23]。再生医学的蓬勃发展对骨缺损的修复,但监管因素在成骨分化和骨形成仍不清楚。我们的研究结果表明,第一次,一本小说的角色mir - 129 - 5 - p / Dkk3轴调节成骨的bmsc的分化和骨形成。

成骨分化和骨再生是一个长期而复杂的生物过程,是受遗传和表观遗传因素。先前的研究表明,除了转录因子,骨被microrna严格控制,这可能是一个上游转录调节器的中介。Arfat和他的同事所描述,mechanosensitive mir - 208 a - 3 - p针对ACVR1抑制骨形成,这是一个监管机构的BMP通路(24]。玛丽亚报道,microrna (miR-21-5p mir - 129 - 5 - p,和mir - 378 - 5 - p)是调节在祖细胞,以应对体育锻炼18]。mir - 129 - 5 - p被报道参与胃癌,脂肪生成、器官损伤。最近的一项研究表明,mir - 129 - 5 - p抑制胃癌细胞增殖,迁移和入侵选择性地抑制COL1A1 [21]。mir - 129 - 5 - p通过自噬可以显著抑制脂肪细胞的分化,可能是治疗肥胖的目标(25]。这项研究还显示,mir - 129 - 5 - p缓解急性肾损伤通过针对HMGB1 /通常/ NF -κB通路(26]。

小分子核糖核酸中扮演不同的角色在不同的组织和细胞成骨分化(27]。miR-20a提升人类骨骼间充质干细胞成骨分化通过Bmp或Wnt信号(28,29日]。与上述研究,周等人报道,miR-20a抑制成骨分化3 t3-l1 C3H10T1/2细胞通过瞄准Tgfbr2 [30.]。研究函数的mir - 129 - 5 - p在骨仍然有限。殷等人发现mir - 129 - 5 - p MC3T3-E1抑制成骨分化的细胞和mir - 129 - 5 - p抑制剂改善更年期骨质疏松症在C57BL6小鼠31日]。然而,另一个研究表明,人类骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞在体外经过过度的mir - 129 - 5 - p (19]。这些有争议的报道可能造成unstandardized协议在不同的实验室。在我们的研究中,我们发现mir - 129 - 5 - p表达调节在bmsc和C3H10T1/2细胞的成骨分化。此外,我们的研究结果显示,mir - 129 - 5 - p增强BMSC体外成骨分化和加速修复骨再生在小鼠模型的临界规模头顶缺陷。我们的数据证明,mir - 129 - 5 - p是一个积极监管因素成骨细胞分化和骨形成。

Wnt信号通路扮演关键角色在刺激成骨细胞生成和减少破骨细胞分化[32),由几种不同家庭的分泌调节监管机构(33]。我们的研究表明,mir - 129 - 5 - p活性的表达β连环蛋白和下游转录因子Wnt /活动β连环蛋白通路Runx2和原癌基因。然而,他们并不直接目标基因mir - 129 - 5 - p。探索mir - 129 - 5 - p的机制对成骨细胞分化和骨形成,我们寻找可能的目标mir - 129 - 5 - p在分子与Wnt /β连环蛋白通路的监管。有趣的是,我们发现mir - 129 - 5 - p选择性目标Dkk3通过生物信息学分析和后续使用dual-luciferase记者系统。

总价值是cysteine-rich蛋白质组成的家庭至少有四个不同的形式(Dkk1、2、3、4),它被确定为施加拮抗剂活动。Dkk1 2和4可以绑定Wnt coreceptor Lrp5/6和Kremen蛋白质对抗Wnt信号(34]。然而,Dkk3是一种分泌蛋白在Wnt /及其作用β连环蛋白途径仍然是难以捉摸的(35]。殷等人报道,Dkk3老老鼠中高度表达,导致老年性肌肉萎缩(36]。表明Dkk3可能与衰老相关疾病如骨质疏松症。张等人也发现Dkk3消极监管鼠牙卵泡细胞的成骨分化(37]。同样,阿斯兰等人报道Dkk3蛋白的表达可能会抑制对成骨分化的影响,但对软骨形成的影响(38]。与之前的研究一致,我们的结果表明,过度Dkk3减毒bmsc的成骨分化。自β连环蛋白是一个核心组件的Wnt信号作为核心功能的途径,我们进一步探讨Dkk3和之间的关系β连环蛋白。相关分析表明,Dkk3表达水平负相关β连环蛋白bmsc的蛋白质含量。Immunofluorescent染色和coimmunoprecipitation实验表明Dkk3直接与之交互β连环蛋白C3H10T1/2细胞。没有Wnt信号激活,免费的β连环蛋白在胞质很低然后磷酸化multiprotein破坏复杂(t (APC, GSK3b,和PP2A),标记β连环蛋白降解[39]。唐家璇等人报道,Smad7推广信息粘附稳定β连环蛋白,保护β连环蛋白的磷酸化和退化40]。我们认为Dkk3可能影响multiprotein免费销毁复杂β连环蛋白退化。图10显示了一个示意图,mir - 129 - 5 - p / Dkk3轴bmsc的成骨分化。然而,如何的详细分子机制Dkk3调节Wnt /β连环蛋白通路仍然需要进一步的研究。

5。结论

总之,目前的研究表明,mir - 129 - 5 - p促进成骨分化的bmsc,然后通过针对Dkk3加速骨再生。因此,mir - 129 - 5 - p / Dkk3可能代表一个潜在的目标为未来治疗骨缺损或骨质流失。还需要进一步的研究来探索Dkk3 Wnt /的具体行动β连环蛋白和如何应用mir - 129 - 5 - p / Dkk3临床治疗修复骨缺损。

缩写

伴着:	骨髓间充质干细胞
高山:	碱性磷酸酶
农业研究所:	茜素红染色
msc:	间充质干细胞
的边后卫:	胎牛血清
ct机:	Microcomputed断层扫描
BV /电视:	骨体积组织体积
弹道导弹防御:	骨矿物质密度。

数据可用性

所有生成的数据和/或分析在这项研究中都包含在发表的这篇文章。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

Changming赵和玉林顾了同样工作和分享第一作者。CZ写手稿并进行实验。YG负责数据的收集和写作手稿。YW提供财政支持。QQ分析实验数据。TW和MH试剂和材料。赫兹负责技术支持。YQ负责BMSC文化和分化。生理改变负责数据分析。ZD负责数据分析和解释。 XJ wrote the manuscript and designed the experiments. LX conceived and designed the experiments. All authors read and approved the manuscript.

确认

这项研究是由军方支持的青年学者医学研究基金(中国人民解放军总医院。QNC19022拉兹卡),中国国家自然科学基金(81771998号XXJ和31971285号XXJ),北京自然科学基金XXJ(7202149),和中国国家重点研发项目(2016号yfe0204400 YW)。

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