液从LPS-Stimulated hDPSCs激活HUVECs体外血管生成的潜力

文摘

背景。液从人类牙髓干细胞(hDPSCs)显示血管再生过程中发挥积极作用。但从炎症hDPSCs液的血管生成功能和底层机制仍然未知。在这项研究中,炎症因子脂多糖(LPS)被用来刺激hDPSCs,并从这些hDPSCs提取液。液的proangiogenic潜力研究,底层的机制进行了研究。方法。液分离得到hDPSCs有或没有LPS刺激(N-EXO和LPS-EXO)和cocultured人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)。液的proangiogenic潜力评估由内皮细胞增殖,迁移和管体外形成的能力。探讨proangiogenic LPS-EXO机制,microRNA测序进行探索N-EXO和LPS-EXO微的状况。基因本体论(去)分析被用来预测目标基因的功能研究。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路分析被用来估计相关的信号通路inflammation-induced血管生成过程。结果。相比N-EXO的吸收,吸收LPS-EXO激活的血管生成潜力HUVECs通过促进增殖、迁移和管体外形成能力。信使rna表达水平的血管内皮生长因子(VEGF)和kinase-insert domain-containing受体(KDR) LPS-EXO组明显高于N-EXO组。微测序表明10小分子核糖核酸在LPS-EXO显著改变。路径分析表明,差异表达的基因靶向小分子核糖核酸参与多个angiogenesis-related通路。结论。本研究显示液来自体外炎症hDPSCs拥有更好的proangiogenic潜力。这是第一次探索exosomal microRNA在inflammation-induced hDPSCs血管生成的作用。这一发现的影响发表了inflammation-stimulated hDPSCs组织再生。

1。介绍

干细胞牙髓再生被认为是治疗炎症牙髓组织的新途径。然而,血管再生牙髓的组织仍然是最大的挑战在仿生果肉再生。血管系统的重建是营养和氧气运输的先决条件,血管生成在牙髓再生中起着基础性作用。血管生成是一个复杂、动态的过程涉及到几个重要的步骤。这些步骤包括内皮细胞增殖、迁移,管形成。随后,这些管成熟血管功能(1]。

hDPSCs是一种间充质干细胞(MSC)的多能性和增殖潜力(2]。hDPSCs可以从提取分离方便、无创的牙齿。位于神经与血管的利基,hDPSCs有很强的潜在神经发生和血管生成3]。许多研究表明hDPSCs履行proangiogenic函数通过指导内皮细胞(4]。检查参与组成分泌腺的条件培养基,细胞外囊泡,细胞因子从hDPSCs证明促进内皮细胞迁移和tubulogenesis,和这些发现表明血管再生过程中旁分泌机制的重要性(5,6]。在炎症刺激反应、免疫调节和再生事件可以由hDPSCs诱导。在这些情况下,hDPSCs显示牙髓修复和再生的临床价值。

hDPSCs表现出强大的再生控制炎症微环境的潜力,这潜力包括强大的分化能力和细胞增殖、迁移、和导航能力(7]。类似的现象在血管生成。增加血管密度在牙髓的组织从深龋齿、牙髓炎8]。为了应对与脂多糖(LPS)刺激,血管内皮生长因子(VEGF)表达可以诱导hDPSCs通过增殖蛋白激酶(MAPK)信号9]。然而,炎症hDPSCs proangiogenic效应的机制仍不清楚。

外来体,一个至关重要的元素在旁分泌机制,是一个重要的细胞间的通讯手段(10]。是一种细胞外囊泡(EVs)一个直径为30 - 200 nm,液显示良好的安全性和稳定性。液可以在某些方向迁移。液中包含的复杂的货物可以反映亲代细胞的状态11]。所有这些优势使液再生颗粒治疗的一个有前途的工具。MSC-derived液显示监管职能通过信使rna和蛋白质微rna,转移(12]。已经证明可以由目标细胞的血管生成小分子核糖核酸从液13]。西安等人表明,液从牙髓细胞可以促进增殖,细胞因子表达,和管形成的人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)通过p38 MAPK信号(6]。有趣的是,EVs分泌炎性hDPSCs显示优越的能力在新血管形成和皮肤伤口愈合比EVs分泌健康的牙齿。综上所述,这些研究结果提出的问题是否液从炎症hDPSCs有助于改善血管生成能力14]。在这项研究中,我们假设液源自hDPSCs从炎症环境有更强的proangiogenesis效果,这些属性是由特定的exosomal小分子核糖核酸。

在这项研究中,液源自LPS-stimulated hDPSCs孤立和特征。的proangiogenic势液研究了评估内皮细胞增殖,迁移和管体外形成的能力。此外,microRNA的表达谱LPS-stimulated hDPSC-derived液进行分析,阐明小分子核糖核酸的作用和底层机制。

2。材料和方法

2.1。组织学研究

第三臼齿健康人的捐助者(18 - 24岁)提取和收集的口腔颌面外科,南方医院,广州,中国。本研究经伦理委员会批准的南方医院,南方医科大学。从每个病人知情同意了。对照组的牙齿健康的牙齿没有牙周炎、龋齿、牙髓炎、牙痛。深龋组牙齿是牙齿龋齿病变接近牙髓腔(≤2毫米),但无自发痛。牙髓组织的健康和深龋牙收集,分析,和固定在4%多聚甲醛一夜之间,脱水,嵌入在石蜡。部分与hematoxylin-eosin组织学分析水化和染色。免疫组织化学染色,样品在4°C隔夜孵化主要抗体CD31 (zm评选- 0044 z生物、北京、中国)和CD63 (zm评选- 0288 z生物,北京),随后孵化与二次抗体(Ab6721 Abcam,英国)在37°C,紧随其后的是颜色开发3、3 - - - - - -diaminobenzidine (DAB)染色。

2.2。hDPSC隔离、文化和身份证明

第三臼齿发出的龋齿和牙周炎健康人的捐助者(18 - 24岁)提取,和牙髓组织消化分离hDPSCs [15]。随后,hDPSCs培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco、大岛屿,美国纽约)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco,宏伟的岛,纽约,美国),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(美国纽约HyClone)有限公司5%₂气氛在37°C。流式细胞术(日本东京,正欲)干细胞表面标记进行识别。通过3 hDPSCs最终密度被停职 细胞/毫升和孵化与共轭人类抗体,包括CD29-PE CD90-APC, CD34-PE, CD45-FITC, CD44-FITC (BD Pharmingen,富兰克林湖,新泽西)在黑暗中1小时在4°C。洗后用磷酸盐(PBS;美国纽约康宁),细胞受到流仪分析。

2.3。Multilineage分化分析

成骨、脂肪形成的诱变进行确定multilineage hDPSCs的分化潜能。通道3 hDPSCs板材在6-well培养14天。成骨诱导组,100 nM地塞米松,更易与Lβ甘油磷酸盐和50毫克/毫升抗坏血酸(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到培养基,以及矿化结节茜素红S沾2%(茜素红S A5533 Sigma-Aldrich)。脂肪形成的分化组1更易/ L地塞米松,0.05 L更易与甲基异丁基黄嘌呤,10毫克/毫升胰岛素,和200年更易与L消炎痛(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到培养基,以及脂滴被油红O染色可视化标准协议。

2.4。细胞生存能力分析

hDPSCs播种在96孔板的密度 细胞/好,刺激与不同浓度的有限合伙人(Solarbio,北京,中国;0、1、5、10、50μg / mL) 2天。10毫升的细胞计数kit-8试剂(CCK-8;Beyotime生物技术,中国上海)添加到每个。经过2小时的在黑暗中孵化,吸光度测量的波长490 nm使用标(BioTek、斯文顿、英国)。HUVECs的扩散能力也测试了上述CCK-8化验。一式三份重复该试验中使用。

2.5。Exosome-Free血清制备和外来体集合

胎牛血清DMEM稀释至20%。隔夜超速离心法在100000 g进行消除serum-derived液(16]。达到70%的融合后,hDPSCs(文章3 - 5)在DMEM培养含有10% exosome-free牛血清和1% penicillin-streptomycin有或没有5μg / mL有限合伙人为2天。的培养基收集外来体由编程离心净化。培养基是离心机 10分钟,上层的是另一个离心收获 10分钟,随后跟着 30分钟。净化液,上层清液离心器(美国贝克曼库尔特Optima xpn - 100) 为70分钟。沉积颗粒在磷酸盐(PBS)然后resuspended超离心机 另一个70分钟。外来体颗粒resuspended在20μL PBS和储存在-80°C。

2.6。外来体识别和BCA蛋白质分析

液的蛋白质浓度与微BCA量化蛋白质分析工具包(美国热费希尔)。透射电子显微镜(TEM)被用来识别外来体形态。液是用移液器吸取到formvar /碳涂层在室温下TEM网格。用4%的醋酸双氧铀染色后,液被捕获的图像通过TEM (jem - 1400 +,东京,日本)。粒径是由纳米粒子跟踪化验(NTA) NanoSight NS300(莫尔文,伍斯特,英国)。exosomal表面标记CD9和CD63,热休克蛋白70 (HSP70)(美国PA系统生物科学)使用自动免疫印迹检测。一式三份重复该试验中使用。

2.7。外来体吸收试验

pkh - 67 (0.4μL, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)添加到200μ20 L稀释剂C和孵化μL液在室温下为2分钟。然后,200年μL exosome-free的边后卫是添加到终止反应。液洗PBS和超离心机 为70分钟。HUVECs被培养的内皮生长medium-2子弹工具包(EGM-2;Lonza cc - 3162,医学博士,美国)在37°C公司为5%₂。pkh - 67标记添加液和孵化4小时37°C。HUVECs是与4%多聚甲醛固定20分钟。不变色与4安装介质 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;Beyotime生物技术,中国上海)是用于核染色。图像的外来体吸收HUVECs被捕与电动倒置显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。

2.8。扩散分析

评估对HUVEC增殖液的影响,HUVECs被播种在96 -孔板的密度 细胞/。液来自正常hDPSCs (N-EXO)或液源自LPS-stimulated hDPSCs (LPS-EXO)被添加(100μg / mL)。细胞培养为1、3、5、7天。细胞计数Kit-8 (Beyotime生物科技、上海、中国)添加到每个。经过2小时的在黑暗中孵化,吸光度测量的波长490 nm使用标(BioTek、斯文顿、英国)。一式三份重复该试验中使用。

2.9。迁移分析

Transwell试验被用来估计的迁移能力HUVECs N-EXO或LPS-EXO的反应。HUVECs resuspended无血清培养基,是最近播种密度 细胞/在参议院24-well Transwell板块(美国纽约康宁)。新鲜的培养基与N-EXO或LPS-EXO (100μg / mL)添加到众议院。同等体积的增加了PBS对照组。24小时后,细胞在参议院被移除的上表面,而下表面上的迁移细胞的参议院和4%多聚甲醛固定了20分钟。固定细胞的1%结晶紫染色20分钟。四个视图中随机挑选的,显微镜和图像捕获。迁移细胞的数量被ImageJ软件计算和分析。一式三份重复该试验中使用。

2.10。管形成血管生成试验

管形成HUVECs是血管生成的关键一步。人工基底膜管的形成进行了试验检测proangiogenic HUVECs LPS-EXO效果。HUVECs使用N-EXO或LPS-EXO (100μg / mL)为24小时。同等体积的增加了PBS对照组。HUVECs resuspended,播种到Matrigel-precoated (150μL) (BD生物科学,圣何塞,CA) 48-well 10板的密度⁵细胞/好,孵化在37°C 1到9个小时。液或PBS被添加到每个。管的形成是在显微镜上获得的图像。管形成的指标分析ImageJ软件。一式三份重复该试验中使用。

2.11。微测序

总共3μ从每个外来体g RNA提取样本送到Novogene有限公司有限公司(中国,北京)小核糖核酸库的建设。集群生成后,图书馆是测序Illumina公司HiSeq 2500平台上(美国CA Illumina公司),和50个基点单头读取生成。一个值为0.05时被设置为默认阈值显著的微分表达式。差异表达小分子核糖核酸进行了分析。微靶基因预测的两个生物信息学工具(米兰达和RNAhybrid)。基因本体论(去;http://geneontology.org/)属性用于定义基因生物富集分析从三个领域:生物过程(BP),细胞组件(CC)和分子功能(MF) ( 使用)。KOBAS软件被用来测试统计浓缩目标基因的候选人在基因和基因组的京都百科全书KEGG数据库路径(KEGG;https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。

2.12。定量逆转录聚合酶链反应(存在)

定义适当的LPS浓度hDPSCs LPS处理(0,1,5μg / mL)为24小时。探索在angiogenesis-related LPS-EXO基因的影响,HUVECs N-EXO处理或LPS-EXO (100μg / mL) 24小时,相同体积的PBS添加作为一个控制。信使RNA RNA隔离器从细胞中提取的总RNA提取试剂(Vazyme生物技术有限公司,南京,中国)。总RNA反转录成cDNA使用HiScript II第一链cDNA合成装备(Vazyme生物技术有限公司,南京,中国)。存在是由PCR SYBR-Green工具包(Vazyme生物技术有限公司,南京,中国)根据制造商的说明QuantStudio 5系统(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被用来作为内部控制。信使rna序列的引物如下列出。GAPDH:向前,5 - - - - - -GGACACTGAGCAAGAGAGGC-3 ,和反向,5 - - - - - -TTATGGGGGTCTGGGATGGA-3 。白细胞介素- 6 (il - 6):向前,5 - - - - - -AGGAGACTTGCCTGGTGAAA-3 ,和反向,5 - - - - - -CAGGGGTGGTTATTGCATCT-3 。肿瘤坏死因子-α(TNF -α):向前,5 - - - - - -CTATCTGGGAGGGGTCTTCC-3 ,和反向,5 - - - - - -GGTTGAGGGTGTCTGAAGGA-3 。VEGF:向前,5 - - - - - -AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3 ,和反向,5 - - - - - -AGGGTCTCGATTGGATGGC-3 。Kinase-insert domain-containing受体(KDR):向前,5 - - - - - -TACGTTGGAGCAATCCCTGT-3 ,和反向,5 - - - - - -TACACTTTCGCGATGCCAAG-3 。检验1 (Ang-1):向前,5 - - - - - -ACCGTGAGGATGGAAGCCTAGA-3 ,和反向,5 - - - - - -AATGAACTCGTTCCCAAGCCAATA-3 。血小板反应蛋白- 1(有):向前,5 - - - - - -AGACTCCGCATCGCAAAGG-3 ,和反向,5 - - - - - -TCACCACGTTGTTGTCAAGGG-3 。验证微测序结果,微N-EXO或LPS-EXO提取和反向转录通过使用Midetect轨道microRNA存在Starter Kit (RiboBio有限公司、广州、中国)。执行中存在。U6用作微内部控制。microrna的引物是由RiboBio设计公司(广州)。

2.13。统计分析

每个实验重复一式三份。所有的值都呈现 和SPSS 19.0进行分析(SPSS Inc .)、美国)。一个配对 - - - - - -测试是用于双官能团的比较。单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett事后测试被用于多个组比较。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。血管密度和外来体表达增加深龋牙髓

果肉组织收集从健康和深龋牙。)染色法是用来检测牙髓组织的病理变化。相比健康的牙髓组织,增加更多的浆细胞和淋巴细胞,血管密度深龋果肉组织观察,表明慢性炎症状态(图1(一))。识别血管密度和液,内皮标记CD31和外来体标记CD63被免疫组织化学染色检测。结果表明,水平的提高CD31和CD63被发现在深龋牙髓健康牙髓。综上所述,上述结果提出一个可能的相关性增加血管密度和外来体在炎症条件下(图1 (b))。

3.2。hDPSCs隔离和表征

hDPSCs提取健康的人类第三磨牙。主要培养牙髓干细胞在组织成长质量(图2(一个))。形态学观察显示与纤维母细胞外表(图2 (b))。进一步确定hDPSCs的multilineage-differentiation潜力,孤立hDPSCs被诱导为成骨细胞和脂肪细胞。茜素红染色显示矿化结节的形成。细胞质的脂质滴观察油红O染色(数字2 (c)和2 (d))。细胞的表面标记被流式细胞仪检测。结果反映,hDPSCs表达高水平的间充质干细胞标记CD90 (90.5%)、CD44(99.27%),和CD29最低级别的表达(99.63%)和造血细胞CD45标记(0.16%)和CD34(0.32%),表明hDPSCs的间叶细胞谱系(数字2 (e)- - - - - -2(我))。

3.3。描述液从LPS-Stimulated hDPSCs

旨在建立炎症模型体外,hDPSCs刺激有不同浓度的有限合伙人(0、1、5、10、50μg / mL)。CCK-8试验显示有限合伙人在hDPSC生存能力的影响。没有观察到显著差异之间的0,1,5μg / mL组。然而,相比,在对照组,细胞生存能力在10到50μg / mL组下降到70%和62%,分别为(图3(一个))。il - 6和TNF -α表达水平作为指标在体外炎症模型。与LPS刺激后24小时,il - 6和TNF -α表达水平在hDPSCs显著增加剂量依赖性的方式( )(图3 (b))。有限合伙人(5μg / mL)是用作刺激的最佳浓度,因为这个浓度可以诱发炎症微环境而减少细胞的可行性。

液从hDPSCs治疗有或没有LPS刺激了2天,被编程超速离心法收获。利用TEM检测液的形状。hDPSCs呈现典型的细胞外囊泡的形状,也就是说,他们轮是杯子形状的双分子层膜(17)(图3 (c))。精确测量不同粒径,NTA使用。大部分的外来体直径范围从30到200海里,这是与液的标准尺寸(图一致3 (d))。最后,exosome-specific标记(CD9、CD63、HSP70)被西方墨点法(图检测3 (e))。这些结果表明,纯化细胞外囊泡的主要内容是液。

BCA化验结果表明,hDPSCs LPS-induced炎性微环境产生更多液比正常的微环境。此外,LPS浓度和外来体体积之间的正相关关系。外来体生产从5μg / mL LPS-treated hDPSCs高于1μg / mL LPS-treated hDPSCs(图3 (f))。

3.4。液源自LPS-Stimulated hDPSCs提升HUVECs体外的增殖和迁移

N-EXO和LPS-EXO贴上pkh - 67被HUVECs实验,主要是位于细胞质(图4(一))。这一结果表明,液可能是细胞间通讯的工具。

研究对HUVEC LPS-EXO迁移的影响,一个Transwell试验。在24小时,观察HUVECs迁移通过Transwell膜在所有组。与控制和N-EXO组相比,LPS-EXO迁移细胞的数量明显增加。上面的结果显示,LPS-EXO可能更proangiogenic可能通过改善HUVECs的扩散和迁移(数据4 (b)和4 (c))。

探讨LPS-EXO对HUVEC增殖的影响,CCK-8试验进行1,3,5,7天。结果显示HUVEC增殖不受LPS-EXO 1和3天。但是在5和7天,HUVECs的增殖能力明显提高了LPS-EXO刺激相比,控制和N-EXO组(图4 (d))。

3.5。液源自LPS-Stimulated hDPSCs促进了管HUVECs体外的形成

管的形成能力HUVECs血管生成的关键因素。探讨不同N-EXO管形成的影响和LPS-EXO HUVECs处理100人μg / mL N-EXO或LPS-EXO 1小时和9个小时;连接点的数量和总管长度进行了分析。早期的血管生成(1小时),capillary-like结构开始形成。链式结构可以观察到所有的组。管总长度和连接点LPS-EXO组高于那些N-EXO组。( ;数据5(一个),5 (c),5 (d))。在9个小时,后期的血管生成,血管内皮N-EXO vessel-like网络已经形成,LPS-EXO组。LPS-EXO组表现出最大的管结构,连接点和管总长度最大的数量( ;数据5 (b),5 (e),5 (f))。

此外,血管生成过程是高度依赖proangiogenic和反血管增生调解员之间的平衡。在这项研究中,影响LPS-EXO proangiogenic mRNA的表达和反血管增生mRNA估计。与那些N-EXO刺激组相比,VEGF和KDR mRNA水平调节和有mRNA水平下调LPS-EXO刺激组( ;数据5 (g)和5 (h))。然而,相比,在对照组,Ang-1 N-EXO刺激组中表达下降,没有明显改变LPS-EXO刺激组( ;图5 (g))。结果表明,比N-EXO LPS-EXO显示更好的血管生成功能。

3.6。差异表达Exosomal microrna在N-EXO和LPS-EXO

阐明不同的微rna组分N-EXO LPS-EXO,微rna序列。10个microrna的表达显著——LPS-EXO /表达下调,和这些小分子核糖核酸,7小分子核糖核酸(mir - 146 a - 5 - p, mir - 92 b - 5 - p, mir - 218 - 5 - p, miR-23b-5p, mir - 2110, miR-27a-5p,和mir - 200 b - 3 - p)是调节和3小分子核糖核酸(mir - 223 - 3 - p, mir - 1246,和mir - 494 - 3 - p)表达下调(数字6(一)和6 (b))。存在分析被用来验证测序结果的准确性。与测序结果一致,mir - 146 a的表达- 5 - p, mir - 2110,和mir - 200 b - 3 - p在LPS-EXO调节,而mir - 223 - 3的表达——p, mir - 1246, mir - 494 - 3 - p是表达下调(图6 (c))。

3.7。途径,分析差异表达的基因靶向小分子核糖核酸

10个不同的靶基因表达的小分子核糖核酸是由2生物信息学预测工具(米兰达和RNAhybrid)。目标基因被用于进一步的交集和KEGG分析。

去分析目标基因显示最重要的生物过程,包括细胞组件组织,调节细胞交流,开发过程和细胞(图7(一))。KEGG路径分析表明,目标基因参与了多个重要的信号转导(图7 (b)),包括低氧诱导因子- 1 (HIF-1)信号通路(图7 (c)),甲状腺癌血管生成有关,toll样受体信号通路(图7 (d)),细菌侵入上皮细胞与炎症有关,和内吞作用相关的外来体吸收。

四个不同的在线微数据库(TargetScan, miRTarBase miRDB, miRWalk)被用来过滤angiogenesis-related基因差异表达的小分子核糖核酸的目标。基因被表示为目标数据库上面提到的至少2被包括在内。大卫基因注释的生物信息学数据库(https://david.ncifcrf.gov/)。根据GO术语分析,生物过程相关的基因的血管生成mRNA-microRNA网络(图所示8)。

4所示。讨论

血管生成是一个先决条件和牙髓修复和再生的标志18]。新血管形成允许再生纸浆组织来执行其生理功能,提供氧气,提供营养,促进免疫反应。血管生成是一个项目涉及几个步骤。ECs proangiogenic激活介质,其次是EC细胞增殖,迁移,管形成,形成毛细循环(19]。hDPSCs被视为可靠的候选人干细胞再生策略因其杰出的proangiogenic能力(20.]。hDPSCs proangiogenic的效果已被证明在体内和体外21]。然而,hDPSCs显示不同proangiogenic能力是否在炎症微环境在很大程度上仍是个未知数。在先前的研究中,增加血管密度检测牙髓中提取从深龋8]。这个结果表明,血管生成也可能发生在炎症反应(22,23]。在另一项研究中,血管网络的形成HUVECs显著增强hDPSCs coculture系统和HUVECs的TNF -α(1]。在我们的研究中,当刺激5μg / mL有限合伙人,hDPSCs显示强angiogenesis-promoting影响HUVECs hDPSCs比正常控制。我们与上述研究的发现是一致的。我们假设在炎症的早期阶段,hDPSCs可能发挥保护作用在组织修复反应炎症因素然后在HUVECs促进血管生成。还需要进一步的研究来证明hDPSCs如何应对不同类型的炎症因素。

hDPSCs可以调节HUVECs通过各种细胞间通讯的功能,如旁分泌和juxtacrine沟通(24]。作为旁分泌的重要组成部分,液携带特定的生物分子,包括蛋白质、mrna和小分子核糖核酸。它已被广泛报道,液调节多个再生过程中发挥重要作用[25,26]。在一项由西安et al .,液源自hDPSCs被证明促进血管生成的潜力HUVECs通过抑制p38 MAPK信号通路(6]。在炎症条件下,液似乎有不同的功能。在另一项研究中,当cocultured液源自LPS-pretreated hDPSCs,雪旺细胞显示更好的迁移和成牙质细胞分化能力(27]。此外,电动汽车从periodontitis-hDPSCs表现出更强的对血管生成的影响和伤口愈合14]。在我们的研究中,我们证明了强proangiogenic旁分泌活动inflammation-induced hDPSCs是由液。我们还观察到与LPS浓度增加释放液增强。我们的研究提供了强有力的证据,对干细胞再生液是至关重要的。

液的细胞信号通路hDPSCs调节血管生成的炎症环境尚不清楚。Exosomal microrna负调控目标基因的表达通过绑定到3utr的目标基因,导致平移镇压[28,29日]。进行微测序,我们发现某些小分子核糖核酸的表达下调LPS-EXO /调节。总共10个microrna的表达显著改变在LPS刺激在我们的研究中,和这些小分子核糖核酸,7小分子核糖核酸增加(mir - 146 a - 5 - p, mir - 92 b - 5 - p, mir - 218 - 5 - p, miR-23b-5p, mir - 2110, miR-27a-5p,和mir - 200 b - 3 - p)和3小分子核糖核酸下降(mir - 223 - 3 - p, mir - 1246,和mir - 494 - 3 - p)。在小分子核糖核酸,5小分子核糖核酸已经证明在炎症和HUVEC扮演重要角色的功能和血管生成。我们假设差异表达exosomal小分子核糖核酸可能的原因inflammation-stimulated hDPSCs显示更强的血管再生的作用。

mir - 223 - 3 - p已经确认来调节各个系统的功能,包括心血管系统、免疫系统(30.]。在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)组织,mir - 223 - 3 - p表达CD31表达呈负相关,表明其反血管增生性能(31日]。VEGF的mRNA和蛋白表达显著增加乳腺癌细胞中mir - 223 - 3 - p是抑制体外(32]。此外,mir - 223管制在几种类型的炎症性疾病,如败血症、2型糖尿病、风湿性关节炎(33]。总的来说,这些发现表明,mir - 223 - 3 - p是一个强有力的候选人的机制HUVECs LPS-EXO-derived microRNA促进血管生成。我们还发现了一些其他有趣的观察通过回顾文章。在这项研究中,李et al ., mir - 146 a的表达被LPS诱导治疗。血管生成抑制了通过TGF - mir - 146 a击倒β1信号通路激活(34]。在另一项研究中,mir - 218 - 5的表达水平- p在肾小球系膜细胞(gmc)被LPS刺激调节35]。mir - 218 - 5 - p击倒促进了细胞凋亡的HUVECs通过激活HMGB1 [36]。mir - 200 b - 3 - p报道影响HUVEC函数通过直接调节各种proangiogenic基因(如VEGFA)和反血管增生目标基因(如KLF2) [37]。先前的研究显示,mir - 1246抑制血管生成抑制NF -κB信号(38]。还需要进一步的研究来证明某些LPS-EXO microrna HUVECs促进血管生成。

5。结论

在当前的研究中,我们发现液从LPS-stimulated hDPSCs显示较强的促血管生成作用的HUVECs比从正常hDPSCs液。我们的研究还表明,某些exosomal小分子核糖核酸的表达改变可能增强的原因proangiogenic能力LPS-stimulated hDPSCs。我们所知,这是第一次研究证明exosomal小分子核糖核酸从inflammation-induced hDPSCs血管生成的作用。当前的研究可能揭示的影响inflammation-stimulated hDPSCs组织再生。

缩写

hPDSCs:	人牙髓干细胞
HUVECs:	人类脐静脉内皮细胞
硕士:	间充质干细胞
有限合伙人:	脂多糖
电动汽车:	细胞外囊泡
N-EXO:	液来自正常hDPSCs
LPS-EXO:	液源自LPS-stimulated hDPSCs
的边后卫:	胎牛血清
DMEM:	杜尔贝科修改鹰的媒介
PBS:	磷酸盐
EGM-2:	内皮生长medium-2
CCK-8:	细胞计数kit-8
透射电镜:	透射电子显微镜法
NTA:	纳米粒子跟踪分析
DAPI:	4 ,6-Diamidino-2-phenylindole
存在:	定量逆转录聚合酶链反应
HSP70:	热休克蛋白70
VEGF:	血管内皮生长因子
KDR:	Kinase-insert domain-containing受体
Ang-1:	检验1
那有:	血小板反应蛋白- 1
il - 6:	白细胞介素- 6
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
GAPDH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
走:	基因本体论
KEGG:	京都基因和基因组的百科全书
英国石油公司:	生物过程
答:	蜂窝组件
MF:	分子功能
MAPK:	增殖蛋白激酶
HIF-1:	低氧诱导因子- 1
HNSCC:	头颈部鳞状细胞癌
gmc:	肾小球系膜细胞。

数据可用性

微rna的高通量测序数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

本研究经伦理委员会批准的南方医院,南方医科大学。

同意

从所有成年患者书面知情同意了。

信息披露

本文可用的预印本副本在一个评论预印本平台(DOI: 10.21203 / rs.3.rs - 99756 / v1)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

XWA和WBL促成了本文的概念和逻辑。HXY和QW导致了写作和起草的手稿。HXY、PYH LJJ, CZ, ZKY LYF进行实验,收集数据,数据分析和解释。XWA、WBL QW导致关键的修订手稿的重要知识内容;所有作者最后批准的版本出版并同意负责所有方面的工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81870755,81870755)。

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