治疗效果的条件培养基的神经分化人类骨骨髓来源干细胞Rotenone-Inducedα-突触核蛋白聚集和细胞凋亡

文摘

间充质干细胞(msc)被用来对付一些疾病。他们潜在的主要分泌生物分子的出现。人类骨骨髓来源干细胞(hBMSC)显示神经元功能特征分化后基本成纤维细胞生长因子(bFGF)和forskolin。帕金森病是一种慢性老年性神经退行性疾病(NDD)以黑质多巴胺能神经元的损失(SN)和异常的积累α-核蛋白(αsyn)聚合。在本研究中,我们评估了治疗效果的神经分化hBMSC (NI-hBMSC)条件培养液(NI-hBMSC-CM)鱼藤酮-(腐烂)诱导帕金森病(PD)模型SH-SY5Y细胞。稀释NI-hBMSC-CM治疗(50%)在过去的24小时48 h腐烂(0.5μ米)毒性有显著提高细胞生存。减少酪氨酸羟化酶(TH)表达PD的一个特点是增加了NI-hBMSC-CM。海神x - 100可溶性和特里同x - 100不可溶性细胞溶解产物分数被用于免疫印迹。寡聚,二聚的,单体的磷酸化serine129 (p-S129)αsyn和总单体的αsyn腐烂期间减少毒性在海神x - 100可溶性分数。海神x - 100不溶性分数显示,腐烂毒性显著增加低聚物的,但减少二聚和单体的p-S129α在所有形式的总syn表达式αsyn SH-SY5Y细胞增加。NI-hBMSC-CM稳定的生理αsyn单体和聚合的不溶性p-S129的降低αsyn攻击腐烂。细胞骨架蛋白,neurofilament-H (NF-H),β3-tubulin (Tuj1),神经元细胞核(NeuN),和synaptophysin (SYP)在腐烂的毒性明显降低。此外,proapoptotic伯灵顿增加了腐败与降低凋亡bcl - 2、caspase-9 mcl1以及proforms caspase-3 caspase-7, PARP-1。NI-hBMSC-CM改善神经营养蛋白表达,伯灵顿/ bcl - 2比例控制,调节procaspases,和灭活PARP-1。从我们的结果,我们得出这样的结论:NI-hBMSC-CM发布的包含生物分子在神经分化使用再生影响腐烂的PD模型SH-SY5Y细胞。

1。介绍

间充质干细胞(msc)可以发现并分离出许多不同的身体组织,包括骨髓、胎盘,脂肪组织(1),脐带,骨骨小梁、肌肉、滑膜,牙髓和牙周韧带2]。骨骨髓来源msc (BMSC)是研究最多的由于他们的自我更新能力和proregenerative属性分化成组织细胞(3)如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,肝细胞,神经元(4]。MSC治疗候选人有吸引力的治疗一些疾病包括神经退行性疾病(NDD) [3,5]。

msc能穿过血脑屏障(BBB) [6]。然而,在活的有机体内MSC治疗与细胞分化和肿瘤发生的潜在风险(7),和随之而来的未能达成目标站点8]或达到大脑受伤的网站是可以忽略不计9]。证据证实神经保护的MSC出现分泌不同的蛋白质,包括生长因子、细胞因子、趋化因子、代谢物,和生物活性脂质,旁分泌和自分泌的治疗活动(10,11]。检查参与组成分泌腺的/条件培养液(CM)从MSC (MSC-CM)是一个异构生物活性分子被认为是生物技术产品,这是更安全的生活相比MSC (5]。MSC-CM直接导致经济复苏的受损组织11]。再生和恢复能力,因此,考虑到他们MSC-CM从不同来源提出了MSC为主要的生物效应是一个可能的替代MSC治疗NDD [3,12]。

帕金森病是一种慢性NDD在老化主要表现为运动(运动徐缓、刚度和休息震颤)和nonmotor(抑郁、睡眠障碍和内存赤字)并发症由于多巴胺的减少在黑质致密部多巴胺能神经元的变性(SNpc) [13]。此外,PD是一个高度复杂和多方面的障碍14)包括intraneuronal聚合的蛋白质的存在α-核蛋白(αsyn),称为路易小体(磅)和路易(LN)[神经突15]。在神经细胞中,αsyn结合突触囊泡和发挥生理作用在稳定和调节膜结构和交互presynapse [16]。αsyn是一个140个氨基酸的蛋白质(17),和单体的αsyn amphiphatic N终端,一个疏水nonamyloid组件,和酸性C终端(18]。然而,扰乱单体的转译后的修改αsyn导致齐聚和聚合αsyn [19]。磷酸化的serine129 (p-S129) C末端高度认为是主要的标志αsyn包体像的磅PD (20.]。

鱼藤酮(腐烂),piscicide根与植物的属Lonchocarpus和鱼藤酮,抑制线粒体电子传递链(等)复杂1 (EC 7.1.1.2;还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸泛醌还原酶;NADH泛醌氧化还原酶;I型NADH脱氢酶)导致ATP生产导致氧化应激减少了形成的活性氧(ROS) (21]。也再现了帕金森病的病理特点,比如黑多巴胺(DA)水平降低了酪氨酸羟化酶的变性,αsyn磷酸化和聚合,PD-like电动机和nonmotor症状在培养细胞和实验动物(22]。这些研究代表腐朽的政府作为神经毒性剂复制PD模型分析PD的潜在治疗药物治疗的影响。

以前,我们组报道,neural-induced hBMSC (NI-hBMSC)显示神经细胞的功能特征的基本成纤维细胞生长因子(bFGF)和forskolin超过两周23,24]。因此,进一步调查与NI-hBMSC条件培养液(NI-hBMSC-CM)可能提供协同活动实现多因子的治疗效果,以发现PD的发生和发展的分子机制。在本研究中,我们评估疗效的NI-hBMSC-CM腐烂的PD模型在人类SH-SY5Y细胞可溶性或不溶性单体的、二聚的,寡聚p-S129和总αsyn以及特定的细胞信号通路对于理解PD。

2。材料和方法

2.1。准备NI-hBMSC hBMSC和神经源性分化的

人类骨髓获得健康29 - 51岁的乳突捐助者在耳朵手术的乳突切开术。知情同意是来自十个捐助者的方针Chonnam国立大学医学院伦理委员会(机构审查委员会。i - 2009 - 03 - 016)。hBMSC种植文化附着在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;美国Hyclone,洛根,UT)补充10%胎牛血清(的边后卫;Hyclone), 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL大岛,纽约,美国),和0.2%的两性霉素B (Gibco) 37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。的实验中,hBMSC细胞在DMEM(段落3 - 5)维护包含1%的边后卫为7天;然后,细胞培养基(hBMSC-CM)吸气,汇集、无菌过滤为0.2μm注射器过滤器,直到使用存储在-80°C。

诱导神经源性分化,hBMSC(段落3 - 5)维护在DMEM含有1%的边后卫和补充100 ng / mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF;英杰公司有限公司,卡尔斯巴德、钙、美国),七天,然后孵化10μM forskolin(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)在接下来的七天(23,24]。然后,neural-induced条件培养液(NI-hBMSC-CM)吸气,汇集、无菌过滤为0.2μm注射器过滤器,直到使用存储在-80°C。我们使用多个批次收集hBMSC-CM和NI-hBMSC-CM实验。

2.2。SH-SY5Y细胞培养和鱼藤酮制备

人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y (RRID: CVCL_0019;写明ATCC®crl - 2266)是维护在DMEM (Gyeonsangbuk-do Welgene Inc .,韩国)与10%的边后卫和1% penicillin-streptomycin补充37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂/ 95%空气如前所述25]。支流文化(段落第15 - 22)用磷酸盐(PBS)分离trypsin-EDTA 0.25%解决方案,受移植者 细胞/毫升的DMEM包含1%的边后卫,隔夜孵化后用于实验。

腐烂(σR8875)股票准备在10毫米的浓度溶剂二甲亚砜(DMSO溶液;σD2650)整除,储存在-80°C,在6个月内使用。每次实验开始前,一个腐烂股票工作的解决方案是通过稀释血清DMEM媒体准备的。

2.3。鱼藤酮的毒性和治疗hBMSC-CM或NI-hBMSC-CM

SH-SY5Y细胞没有孵化或腐烂(0.5的存在μ米)或溶剂DMSO 24 h。然后,媒体被移除,细胞治疗有或没有hBMSC-CM或NI-hBMSC-CM DMEM稀释50%,和没有孵化或腐烂(0.5μ为另一个24小时(M)的试验研究计划是策划补充图2(一个))。的边后卫是维持在1%的浓度在整个研究。相位对比图片使用奥林巴斯显微镜拍摄(CKX41)配备了照相机。受损,耗尽漂浮细胞培养基和贴壁细胞分离胰蛋白酶化相结合,受到台盼蓝细胞计数方法。存活细胞的数量被数使用LUNA-II™(标志生物系统,京畿道,韩国)自动细胞计数。细胞计数分析进行了一式三份,表示为一个百分比(%)的控制。

2.4。总细胞溶解产物和免疫印迹的准备

48小时后,细胞被刮收获细胞刮刀与媒体,颗粒状,用PBS,洗两次,然后暴露在细胞裂解缓冲(100毫米Tris-HCl (pH值7.6),100毫米氯化钠,1%诺乃清洁剂p 40, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和1% Triton x - 100)补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂和孵化30分钟的冰。溶菌产物离心机在13200 rpm 15分钟在4°C,和上层清液收集总细胞溶解产物。蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国# 23225)后,制造商的指示。蛋白质(15μg) 8 - 14% SDS-polyacrylamide凝胶分离和转移到硝化纤维素膜(美国微孔,Berlington HATF00010)。膜是用PBS含有0.5% ( )渐变20 (PBS-T)其次是阻塞与5% ( )脱脂奶粉的解决方案准备在一夜之间PBS-T然后孵化主要抗体在4°C。补充表中列出所使用的抗体1。之后,细胞膜受到二次抗体结合辣根过氧化物酶在室温下2 ~ 3 h (RT)和PBS-T清洗三次。信号由一个增强化学发光检测系统(ECL)(微孔,WBLUR0500)使用拉斯维加斯4000发光图像分析仪(通用电气医疗集团、日本)。被保存在免疫印迹膜剥离缓冲区(# 21059)热费希尔科学不断颤抖的60分钟。平等的蛋白质加载的表达水平进行评估β肌动蛋白或GAPDH。光密度分析使用ImageJ (National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达,美国)软件。

2.5。Triton - 100可溶性和特里同x - 100不溶性分离和免疫印迹αsyn

48 h后的实验中,SH-SY5Y细胞细胞溶解在冰上在细胞裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂有1% Triton x - 100如上所述30分钟。溶菌产物离心机在13200 rpm 15分钟在4°C,和收集上层的Triton x - 100可溶性分数。细胞颗粒与PBS洗然后溶解在细胞裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂Triton x - 100 1%和2% SDS和用近10年代和用作Triton x - 100不溶性分数。蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质化验设备。等量的蛋白质(30μg)分离或12% 8日SDS-polyacrylamide凝胶和转移到硝化纤维膜。后立即转移,膜前缀与4%多聚甲醛(PFA;GeneAll生物技术,首尔,韩国,sm - p - 01 - 100)在PBS含有0.01%戊二醛在RT(σ340855)60分钟,然后用PBS。阻止了5%的脱脂牛奶Tween-20 Tris-buffered盐水(TBS)和0.1% (TBS-T) 60分钟。膜与anti-p-S129被孵化αsyn (Abcam,剑桥,英国,ab51253)主要抗体阻断缓冲区一夜之间在4°C。然后洗膜 敏在TBS和孵化与二级抗体阻断缓冲区洗紧随其后 最小值与ECL TBS和发展。p-S129后αsyn可视化,膜PBS-T清洗和保存在免疫印迹剥离缓冲常摇晃60分钟,洗净 在PBS-T min,前缀为4% PFA在RT PBS 60分钟,然后冲洗PBS。阻塞在5%的脱脂牛奶TBS-T 60分钟。膜被孵化αsyn (Abcam ab212184)主要抗体阻断缓冲区一夜之间在4°C。随后,然后洗膜 分钟在TBS和孵化二级抗体阻断缓冲区洗紧随其后 最小值与ECL TBS和发展。平等的蛋白质加载被GAPDH表达水平的评估,作为内部控制。光密度分析使用ImageJ执行软件。

2.6。统计分析

数据表示为 从三个独立实验SH-SY5Y细胞接受不同批次的hBMSC-CM或NI-hBMSC-CM。治疗效果的显著性水平是决定使用单向方差分析(方差分析)图基的紧随其后事后多重比较检验。的概率< 5% ( )被认为是具有统计学意义。GraphPad棱镜®5.0软件(GraphPad软件Inc .)是用于数据分析和准备所有的图表。

3所示。结果

3.1。NI-hBMSC-CM在SH-SY5Y Rotenone-Induced死亡细胞

细胞存活率逐渐随浓度的增加而降低腐烂,腐烂的剂量和时间增加24和48 h后细胞死亡(数据没有显示)。在此基础上,腐烂在0.5的浓度μM 48 h用于所有后续实验。SH-SY5Y细胞暴露在有或没有腐烂(0.5μ米)24小时;然后,该培养基就被撤掉了;新培养基有或没有hBMSC-CM或NI-hBMSC-CM报100,50岁,25%是稀释在DMEM + 1%的边后卫没有孵化或腐烂(0.5μ米)24小时(图1(一))。NI-hBMSC-CM治疗100年,50岁和25%稀释腐烂毒性显示显著增加细胞数量;相反,治疗hBMSC-CM没有任何明显的变化对腐烂的毒性。治疗来控制细胞毒性没有腐烂,NI-hBMSC-CM显示无显著变化在100和50%稀释但下降25%。hBMSC-CM 50岁和25%稀释还显示在细胞数量与对照组明显降低(图1(一))。形态学图像显示,腐烂毒性细胞数量减少,改变了细胞表面与对照组相比。治疗NI-hBMSC-CM增加细胞数量(补充图1)。从这些结果,NI-hBMSC-CM稀释50%被选为进一步研究来评估其治疗效果。实验研究计划准备(补充图2(一个)),(补充图观察形态学变化2 (b))。

3.2。NI-hBMSC-CM ROT-Induced TH SH-SY5Y细胞蛋白表达

酪氨酸羟化酶(TH)、病原反应酶的生物合成多巴胺和PD的具体特征,评价了免疫印迹法(图1 (b);补充图5)。腐烂的毒性48 h显著下降( )TH蛋白表达表明腐烂诱导帕金森病的多巴胺能神经退化的标志。正如预期的那样,过去24小时显示NI-hBMSC-CM治疗增加TH表达式( )针对48 h的腐烂的毒性。hBMSC-CM显示无意义的增加在表达式( )。这些结果揭示了NI-hBMSC-CM在神经保护治疗效率对ROT-induced PD SH-SY5Y细胞。

3.3。在ROT-Induced NI-hBMSC-CM p-S129和总αsyn SH-SY5Y细胞蛋白质表达

评估ROT-inducedα-syn-mediated SH-SY5Y细胞毒性、免疫印迹分析海神x - 100可溶性和特里同x - 100不可溶性细胞溶解产物分数被用来检测蛋白质p-S129表达式和总αsyn(图2和3)。蛋白质的溶解产物分数被加载到12%和8% sds - page凝胶和免疫印迹检测寡聚,二聚的,单体的形式的p-S129和总αsyn积累。

从图2(一个)和补充图6腐烂(0.5μM 48 h)毒性显著降低低聚物的( 在12和8% sds - page凝胶)、二聚的和单体的(两者都是 在12% sds - page凝胶; 在8% sds - page凝胶)的p-S129形式αsyn(图2 (b)和2 (d))以及总单体的αsyn ( 在12和8% sds - page凝胶(数字2 (c)和2 (e))在海神x - 100可溶性细胞溶解产物分数。在NI-hBMSC-CM治疗,p-S129和总αsyn显著增加而腐烂的毒性。低聚物的( 在12% sds - page凝胶; 在8% sds - page凝胶)、二聚的和单体的(两者都是 在12% sds - page凝胶; 在8% sds - page凝胶)的p-S129形式αsyn以及单体的总额αsyn ( 在12% sds - page凝胶; 在sds - page凝胶)增加了8%。此外,单体的比率p-S129 /总αsyn期间没有改变ROT-induced毒性和NI-hBMSC-CM治疗(补充数据3(一个)和3 (b))表明p-S129表达式与总量呈正相关αsyn水平。

特里同x - 100不溶性p-S129与其总蛋白表达αsyn表达式如图3(一个)和补充图7。腐烂毒性诱导低聚物的增加( 在12% sds - page凝胶,图3 (b); 在8% sds - page凝胶,图3 (c)),但在二聚的减少( 在12% sds - page凝胶; 在8% sds - page凝胶)和单体的( 在12% sds - page凝胶; p-S129 8% sds - page凝胶)αsyn表达式。NI-hBMSC-CM治疗明显返回寡聚( 在12和8% sds - page凝胶)、二聚的( 在12%和8% sds - page凝胶)和单体的( 在12% sds - page凝胶; 在8% sds - page凝胶)p-S129蛋白质表达引起腐烂。此外,总数αsyn Triton x - 100不溶性分数在低聚物的显著增加,二聚的,单体的形式( , ,和 在12% sds - page凝胶,图3 (d); , ,和 在8% sds - page凝胶,图3 (e))ROT-induced毒性与控制水平。NI-hBMSC-CM腐烂毒性治疗的最后24小时48 h减少了低聚物的( 在12% sds - page凝胶; 在8% sds - page凝胶)、二聚的( 在12% sds - page凝胶; 在8% sds - page凝胶),和单体的( 在12% sds - page凝胶; 8% sds - page凝胶)的形式αsyn(图3 (d)和3 (e))。此外,寡聚p-S129 /总数的比率αsyn ROT-induced毒性和NI-hBMSC-CM治疗腐烂没有改变(补充数据3 (c)和3 (d))表明p-S129表达式的不溶性低聚物与总呈正相关αsyn低聚物的水平。二聚的比率和单体的p-S129 /总αsyn在ROT-induced毒性显著降低( ),NI-hBMSC-CM治疗显著提高控制水平在腐烂的毒性(补充数据3 (c)和3 (d))。

3.4。NI-hBMSC-CM ROT-Induced蛋白质的表达神经元标记SH-SY5Y细胞

的磷酸化和寡聚化αsyn可以与多个神经元标记如neurofilament-heavy (NF-H),β3-tubulin (Tuj1),神经元细胞核(NeuN),和synaptophysin (SYP)。正如所料,NF-H ( ;图4(一)),β3-tubulin ( ;图4 (b)),NeuN ( ;图4 (c))和SYP ( ;图4 (d))蛋白表达显著减少腐烂毒性组与对照组相比。同时,NI-hBMSC-CM治疗这些蛋白表达显著增加(NF-H NeuN: ;β3-tubulin SYP: )在腐烂SH-SY5Y细胞毒性。hBMSC-CM治疗也增加了β3-tubulin ( ),NeuN ( ),和SYP ( )表达对腐败的毒性。治疗NI-hBMSC-CM或hBMSC-CM控制细胞没有表现出任何变化(图4和补充图8)。

3.5。在ROT-Induced NI-hBMSC-CM SH-SY5Y细胞凋亡蛋白表达

我们下一个检测到的水平proapoptotic伯灵顿,bcl - 2凋亡,mcl1蛋白质表达研究的影响NI-hBMSC-CM apoptosis-related蛋白的表达在ROT-induced SH-SY5Y细胞(图5和补充图9)。腐烂的毒性48 h显著增加伯灵顿( ;图5(一个)),而减少bcl - 2 ( ;图5 (b))和mcl1 ( ;图5 (d))蛋白表达水平与对照组相比。然而,治疗NI-hBMSC-CM或hBMSC-CM显著抑制了伯灵顿水平( NI-hBMSC-CM; 通过hBMSC-CM)增加bcl - 2 ( NI-hBMSC-CM; 由hBMSC-CM)和mcl1 ( NI-hBMSC-CM)水平对ROT-induced SH-SY5Y细胞。值得注意的是,NI-hBMSC-CM治疗来控制细胞显示减少伯灵顿( )和bcl - 2和mcl1(增加 )比未经处理的控制SH-SY5Y细胞蛋白质表达。bcl - 2作为凋亡bcl - 2家族的成员可以绑定到巴克斯形成bcl - 2:伯灵顿形成,从而衰减伯灵顿的凋亡效应。显然,腐烂导致增加伯灵顿/ bcl - 2比例( ;图5 (c)),同时减少bcl - 2 /伯灵顿比( ;补充图4(一))。治疗NI-hBMSC-CM或hBMSC-CM显著降低了伯灵顿/ bcl - 2比例( ;图5 (c))随着bcl - 2 /伯灵顿比( ;补充图4(一))对ROT-induced和未经处理的控制SH-SY5Y细胞。

在图6和补充图10、pro-Cas-9 pro-Cas-3和pro-Cas-7表达明显下调( ,图6(一); ,图6 (b);和 ,图6 (c)腐烂毒性组,分别)。然而,治疗NI-hBMSC-CM显著增加的表情pro-caspases (Cas-9: ;Cas-3 Cas-7: )反对ROT-induced细胞凋亡。hBMSC-CM治疗也增加了pro-Cas-9 ( )对腐烂的毒性水平。此外,pro-PARP-1水平下降( ;补充图4 (b)),但是cleaved-PARP-1水平( ;补充图4 (c))随着裂解/ pro-PARP-1比( ;图6 (d))在SH-SY5Y ROT-induced PD模型中增加了细胞。NI-hBMSC-CM治疗增加了pro-PARP-1 ( )水平以及减少cleaved-PARP-1 ( )和裂解/ pro-PARP-1比( ;图6 (d)在腐烂的毒性。hBMSC-CM治疗减少cleaved-PARP-1级别( )裂解/ pro-PARP-1比率下降( )在SH-SY5Y ROT-induced毒性细胞。这些结果表明,NI-hBMSC-CM抑制SH-SY5Y ROT-induced凋亡的细胞。

4所示。讨论

msc广泛分布,容易从身体组织获得保证的自我更新能力和regeneration-mediated治疗方法在管理多种疾病(26,27]。我们之前报道的隔离和文化hBMSC表示超过95% MSC-specific标记如CD13、CD44 (endoglin), CD90 (Thy-1),或存在但没有表达造血干细胞的标记,包括CD14、CD34、CD45。星形胶质细胞标记(GFAP)和神经元标记(NF-L、NF-M NF-H, MAP2, NeuN,和Tuj1)非常低或检测不到hBMSC [23]。

与bFGF和forskolin补充剂神经元分化后两周,大多数NI-hBMSC表现出双极或多极形态与分支流程,神经元和神经元marker-positive大大增加了在大量而GFAP-positive星形胶质细胞。用全细胞膜片箝技术配置,66%以上的NI-hBMSC表示压敏电阻器钠电流与hBMSC相比表现出几乎没有钠电流。MaxiK mRNA表达水平(负责人类large-conductance、电压,calcium-dependent K⁺通道);Kv1.4、Kv4.2 Kv4.3(负责人类压敏电阻器K⁺通道);Eag1和Eag2(负责人类ether-a-go-go K⁺通道);NE-Na(负责TTX-sensitive Na⁺通道);CACNA1C(负责人类压敏电阻器l型^{2 +}频道,α1 c亚基);和CACNA1G(负责人类压敏电阻器衣架式Ca^{2 +}频道,α1 g亚基)在NI-hBMSC显著增加23]。mRNA表达Wnt4基因、Wnt5a Wnt11, Fzd3 Wnt4蛋白质表达的增加和Wnt5a增加了调节JNK-related蛋白质NI-hBMSC表明物是一个重要的调制器在神经源性分化24]。此外,移植的NI-hBMSC neomycin-treated耳聋豚鼠耳蜗表现出显著增加螺旋神经节神经元的数量(胡志明市)结束的潜力NI-hBMSC在听力损失的哺乳动物23]。

细胞间接触以及免疫调节分泌因素归因于行动受伤的细胞和组织再生的机制(26]。Secretome或条件培养液(CM)包含一组生物活性因子/分子包括脂质、蛋白质、核酸、趋化因子、细胞因子、生长因子、激素和细胞外囊泡释放细胞,组织,或生物28- - - - - -30.]。MSC分泌生物活性分子释放到周围介质有治疗作用细胞迁移、增殖、免疫调节和组织再生26,31日]。神经分化人类脂肪组织——或骨骨髓来源干细胞触发各种神经生物分子的报道在我们先前的研究[23,24,27]表明对NDD可以使用MSC-CM目标重要的生物和功能流程了解的神经保护机制。

在这项研究中,我们研究了NI-hBMSC-CM治疗的治疗效果在SH-SY5Y ROT-induced PD模型细胞。治疗后50%的稀释NI-hBMSC-CM过去24小时显著减少腐烂(0.5的毒性作用μ米)48 h。此外,大多数ROT-induced细胞受损,失去了探明枯竭,及其神经网络在SH-SY5Y细胞被发现;相反,NI-hBMSC-CM治疗显示扩展探明接触其他探明和邻近细胞的细胞体。TH是病原反应酶生物合成的儿茶酚胺类神经递质主要负责酪氨酸转化为多巴胺前体左旋多巴,促进突触连接。ROT-induced下降届活动在这个研究可能是由于底物合成与多巴胺减少赤字损害多巴胺的合成,及其在神经元代谢表明选择性变性在PD (22]。同时,增加表达TH NI-hBMSC-CM治疗后表明,增强多巴胺生产结果增加形成的突触和神经传递。

αsyn在神经细胞的突触囊泡有几个重要的监管职能,包括突触维护,线粒体内稳态,蛋白酶体功能,多巴胺代谢,和陪护人员的活动32]。多余的αsyn聚合的多巴胺能神经元诱发减少多巴胺再摄取[33]。折叠的天真αsyn可溶性,无毒;然而,错误折叠αsyn转变成不稳定的二聚体,开发小型高分子量有毒不溶性低聚物在PD (34,35]。这些有毒的寡聚物αsyn可以从病变细胞传播健康的神经元和诱导原生的转换αsyn变成有毒的低聚物的物种(36]。此外,磷酸化在serine129 (p-S129)αsyn C末端(95 ~ 140)导致更高的倾向αsyn聚合(37)和减少其亲和力囊泡(38]。因此,海神x - 100可溶性和特里同x - 100不可溶性细胞蛋白质分数为寡聚的表达式,分析了二聚的,单体的p-S129和总αsyn形式在西方墨点法使用多聚甲醛和戊二醛作为膜固定液。在这项研究中,不溶性p-S129寡聚物的增加αsyn不溶性总量的比例增加了低聚物αsyn腐烂毒性以及减少可溶性总αsyn寡聚物表明腐败增加了有毒的αsyn聚合与帕金森病的进展。其他的研究也证明,低聚物的αsyn与PD患者的运动能力损伤呈正相关(39- - - - - -41),p-S129增加αsyn PD患者的过程中αsyn聚合(42,43]。

此外,不溶性二聚的和单体的p-S129αsyn减少与增加αsyn二聚的毒性和单体的腐烂在这项研究中表明,不溶性p-S129αsyn主要是与低聚物的聚合,而不是二聚的或单体的总αsyn。这些增加Triton x - 100不溶性单体和二聚的总数αsyn在这项研究表明,抑制线粒体复杂我影响单体的腐烂αsyn稳定(44)参与发起和总量的积累αsyn寡聚物(45]。此外,不变的比例溶性单体的p-S129 /总α期间syn ROT-induced毒性表明可溶性p-S129与总可溶性的表达呈正相关αsyn水平。治疗NI-hBMSC-CM显著减少了不溶性p-S129寡聚物和总αsyn积累而增加可溶性p-S129和总水平αsyn在腐烂的毒性。这些结果表明,不溶性p-S129和总αsyn寡聚物变成可溶性低聚物不溶性的提高间隙αsyn NI-hBMSC-CM聚合的治疗和保持可溶性的生理功能αsyn单体治疗PD的磅。

随后ROT-induced线粒体复杂我通过干扰线粒体动力学障碍损害细胞骨架蛋白(46),突触囊泡蛋白(47),和轴突运输完整(48]。神经突的产物主要由细胞骨架神经纤维细丝(NFs)和微管49]。NFs的角色形成和维持神经元的轴突结构和货物运输(50]。αsyn寡聚物与NF降低网络干扰微管结构在神经元和轴突运输功能(51]。NF-H的表达(或NF200)出现在轴突轴突的成熟是一个主要组成部分结果(52]。β3-Tubulin(或者Tuj1 TUBB3)是一个microtubule-related神经细胞标记(53]。在这项研究中,减少NF-H和表达β3-tubulin在腐烂的毒性与先前的发现被证实αsyn聚合NF-H和结合β3-tubulin [52,54),扰乱了NF网络完整性(55),运动神经元被撤出神经结(56]。此外,NF-H可以直接绑定C终端领域的微管蛋白和调节其活性(57]。β3-Tubulin聚合与αsyn形成一种不溶性蛋白质复杂的积累导致神经功能障碍的神经终端(58)与降低β3-tubulin NDD [59]。治疗NI-hBMSC-CM NF-H和恢复β与可溶性增加3-tubulin表达式αsyn。这些结果表明,NFs和微管网络需要进步的神经突的形成,轴突的产物,和他们的货物运输。这个稳定的神经细胞骨架的完整性起着重要的作用αsyn监管。

NeuN(或者Fox-3 RBFOX3)是一种可溶核终端神经元分化相关蛋白用于评估神经细胞丧失NDD [60]。Synaptophysin (SYP)是在突触前囊泡膜糖蛋白本地化,用于访问突触密度(61年和神经传递62年]。然而,αsyn聚集在突触前突触终端缺陷维护56)和传输(63年]。在我们的研究中,在腐烂NeuN毒性的重大损失随着SYP蛋白表达下降表明突触神经变性的α其他(syn积累在突触证明了这一点64年,65年),而NI-hBMSC-CM治疗增加了NeuN的表达式和SYP表明SH-SY5Y细胞经历与突触功能增加神经元分化。

腐烂抑制线粒体等复杂我导致积累电子生成细胞内活性氧(ROS),触发凋亡激活神经元死亡(66年在多巴胺能神经元67年,68年]。αsyn寡聚化和积累发挥细胞毒性影响神经元主要与凋亡bcl - 2论半胱天冬酶通路(69年]。bcl - 2家族蛋白质包含几个proapoptotic和凋亡调控线粒体膜的完整性。proapoptotic蛋白伯灵顿位于胞质。bcl - 2,抗凋亡蛋白之一,位于线粒体外膜抑制线粒体细胞色素c的释放,稳定的膜电位,ATP生产保护,防止氧化应激(70年]。在这项研究中,ROT-induced显著增加伯灵顿bcl - 2蛋白降解和mcl1蛋白质表达。伯灵顿/ bcl - 2蛋白比率是一个更好的预测凋亡细胞死亡比伯灵顿或bcl - 2单独的绝对浓度(71年]在腐烂SH-SY5Y细胞毒性增加,表明线粒体凋亡增加。NI-hBMSC-CM治疗减少了伯灵顿/ bcl - 2比例以及改善mcl1 SH-SY5Y细胞指示规范化线粒体功能的蛋白质表达。

伯灵顿的易位促进线粒体的细胞溶质从线粒体细胞色素c的释放到胞质被发现引起腐烂,还存在激活(66年]。还存在是蛋白酶的家庭最初合成活性procaspases,这必须经过二聚或寡聚化然后乳沟成为激活和促进凋亡细胞死亡(72年]。在这项研究中,腐烂毒性显著降低Cas-9 procaspases, Cas-3, Cas-7证据增加主动/裂解半胱天冬酶的水平。从线粒体细胞色素c的释放结合Apaf-1和Cas-9形成了“apoptosome”复杂随后激活Cas-9可以分裂并激活Cas-3 Cas-7 [73年]。此外,PARP-1裂解成碎片,检测到特定于89 kDa片段出现在激活细胞凋亡的Cas-3和Cas-7证明在这个研究。还存在过度激活和PARP-1触发凋亡过程如染色质缩合、核分裂,细胞骨架降解[74年,75年)消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和ATP导致细胞能量衰竭和细胞死亡。治疗对腐烂NI-hBMSC-CM毒性控制Cas-9 prolevels, Cas-3, Cas-7 PARP-1暗示激活的抑制细胞内apoptosis-related蛋白质。此外,PARP-1抑制剂可以减少引起的细胞死亡αsyn [76年),本研究支持NI-hBMSC-CM治疗减少ROT-induced线粒体缺陷,DNA损伤和凋亡细胞死亡。

5。结论

总之,细胞生存和酪氨酸羟化酶蛋白表达增加NI-hBMSC-CM治疗后减少αsyn磷酸化,阻止有毒αsyn寡聚物,稳定溶性αsyn单体。改善了NF-H NI-hBMSC-CM治疗,β3-tubulin、NeuN SYP bcl - 2蛋白表达以及监管的伯灵顿/比和调节表达procaspase-9, procaspase-3, procaspase-7 PARP-1。上述结果证明,NI-hBMSC-CM对PD治疗效果通过抑制细胞死亡,稳定的αsyn单体、促进神经发生和降低细胞凋亡,概略地代表图7。生物分子释放的条件培养基bFGF和forskolin补充神经分化hBMSC可能负责neuroregenerative潜力。进一步的研究在ROT-induced病理生理学αsyn在PD动物模型需要理解神经分化条件培养液的新颖的治疗方法。

数据可用性

分析所使用的数据集和/或在此研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由韩国国家研究基金会(nrf - 2018 r1d1a1b07050883 nrf - 2020 r1i1a3070388和联盟- 2020 r1f1a1076616), Chonnam国家大学医院生物医学研究所(BCRI19044) Chonnam国立大学(2018 - 3498),和Jeollanam-do科技研发项目(干细胞新药的开发),由Jeollanam-do、韩国。

补充材料

补充图1:SH-SY5Y细胞被播种 细胞/毫升的DMEM含有1%的边后卫,隔夜孵化后用于实验。细胞培养与缺失或腐烂(0.5的存在μ米)48 h与hBMSC-CM治疗或NI-hBMSC-CM 100或50或25%在过去的24小时为形态变化和评估。每幅图片都代表三个独立的实验。补充图2:(a)试验研究计划。(b) SH-SY5Y细胞被播种 细胞/毫升的DMEM含有1%的边后卫,隔夜孵化后用于实验。细胞培养与缺失或腐烂(0.5的存在μ米)48 h与hBMSC-CM治疗(50%)或NI-hBMSC-CM(50%)在过去的24小时为形态变化和评估。每幅图片都代表三个独立的实验。补充图3:SH-SY5Y细胞被播种 细胞/毫升的DMEM含有1%的边后卫,隔夜孵化后用于实验。细胞缺乏或腐烂(0.5μ米)48 h与hBMSC-CM治疗(50%)或NI-hBMSC-CM(50%)在过去的24小时,免疫印迹分析。酒吧图表代表单体的褶皱变化p-S129 /总αsyn比率从12% sds - page凝胶(a)或8% (b)在特里同x - 100可溶性分数。寡聚,二聚的,单体的S129 /总αsyn比率从12% sds - page凝胶(c)或8% (d)在特里同x - 100不溶性分数。数据是 三个独立的实验,分析了单向方差分析(方差分析)图基的紧随其后事后测试。统计学意义:^一个相比之下,控制;^b相比之下,腐烂; 和 。补充图4:SH-SY5Y细胞被播种 细胞/毫升的DMEM含有1%的边后卫,隔夜孵化后用于实验。细胞缺乏或腐烂(0.5μ米)48 h与hBMSC-CM治疗(50%)或NI-hBMSC-CM(50%)在过去的24小时,免疫印迹分析。酒吧图代表了伯灵顿/ Bcl-1比率(a), pro-PARP-1 / GAPDH (b),和裂解PARP-1 / GAPDH比率(c),每个图片是代表三个独立的实验。数据是 三个独立的实验,分析了单向方差分析(方差分析)图基的紧随其后事后测试。统计学意义:^一个相比之下,控制;^b相比之下,腐烂; 和 。补充表1:西方墨点法条件和抗体用于这项研究。补充图5:未经编辑图片和分子量标记为各自的西方墨迹图中使用1 (b)这个手稿。补充图6:未经编辑图片和分子量标记为各自的西方墨迹图中使用2(一个)这个手稿。补充图7:未经编辑图片和分子量标记为各自的西方墨迹图中使用3(一个)这个手稿。补充图8:未经编辑图片和分子量标记为各自的西方墨迹图中使用4这个手稿。补充图9:未经编辑图片和分子量标记为各自的西方墨迹图中使用5这个手稿。补充图10:未经编辑图片和分子量标记为各自的西方墨迹图中使用6这个手稿。(补充材料)

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