发现小说长非编码RNALx8-SINE B2多能性的标志

文摘

胚胎干细胞的多能性和自我更新(ESCs)的核心转录监管机构如Oct4、Sox2, Nanog。多能性的另一个重要的标志是长非编码RNA (lncRNA)。在这里,我们州的一部小说长非编码RNA (lncRNA)Lx8-SINE B2是一个多能性的标志。LncRNALx8-SINE B2丰富的ESCs和ESC分化中表达下调。通过快速放大cDNA结束,我们确定了长篇lncRNA序列Lx8-SINE B2。我们进一步表明,转位因子lncRNA的上游Lx8-SINE B2可以开lncRNA的表达吗Lx8-SINE B2。此外,ESC-specific lncRNA的表情Lx8-SINE B2是由Oct4 Sox2。总之,我们发现了一个新颖的标记lncRNA ESCs,这是由监管机构核心多能性。

1。介绍

大多数哺乳动物基因组的非编码序列组成。其中,转座的元素(te)有助于~ 40%的基因组1]。te是沉默的大多数,然而,一小部分te是表示在发展和疾病(2]。他们在这些过程扮演多个角色,包括函数作为增强剂,促进剂,长非编码rna (lncRNAs) [3- - - - - -6]。在脊椎动物中,70% lncRNAs由测试工程师(7]。te也赋予组织表达转录因子(lncRNAs通过招聘3,4,6]。TE-derived lncRNAs积极参与发展。TE-derived lncRNA ROR函数作为microrna的海绵,还与hnRNPA1促进原癌基因表达在重编程(8- - - - - -10]。内源性逆转录病毒HERVH-derived lncRNAs维持人类胚胎干细胞的多能性3,11- - - - - -13]。不对称的ERV1和ERVK-derived lncRNA LincGET在2到4个小鼠胚胎偏见细胞命运向内细胞团(14]。这些研究结果都表明,一个重要的角色TE-derived lncRNA在发展。大多数的结论是基于人类细胞系。我们仍缺乏理解TE-derived lncRNAs在小鼠胚胎干细胞(ESCs)。在这项研究中,我们调查了一个代表lncRNA的表达和调控Lx8-SINE B2ESCs。

2。方法

2.1。细胞培养

鼠标的ESCs (E14灯头)培养板上涂上0.2%的明胶(G1890σ)中有15%胎牛血清(的边后卫,SH30070.03 Hyclone), 2毫米谷酰胺(Gibco), 1% penicillin-streptomycin (P1400 Solarbio), 0.1毫米不必要的氨基酸(Gibco), 0.1毫米β巯基乙醇(m3148 - 250、σ)和10 ng / ml白血病抑制因子(生活;Z03077 GenScript)。小鼠胚胎成纤维细胞(mef)和3 t3细胞保持在盘子里(703001年,巢生物技术)在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Hyclone)补充10%的边后卫,penicillin-streptomycin 2毫米谷酰胺,1%。细胞培养在37°C有限公司₂孵化器。

2我DMEM / F12培养基含有50% (BasalMedia), 50% Neurobasal媒体(Gibco), 1% N2补充,1% B27 (Gibco), 0.1毫米不必要的氨基酸(Gibco), 2毫米谷酰胺(Gibco), 1% penicillin-streptomycin (P1400 Solarbio), 0.1毫米β巯基乙醇(m3148 - 250,σ),1μM MEK抑制剂PD0325901 (T6189 TargetMol),和3μBioGems M GSK3抑制剂CHIR99021 (2520691)。10 ng / ml白血病抑制因子(生活;Z03077 GenScript)添加2 i /生活条件。

2.2。RNA提取、逆转录和定量PCR (qPCR)

总RNA提取与RNAiso试剂(B9109,豆类)所描述的15)和处理DNase我删除基因组DNA在DEPC水(B501005 Sangon生物技术)。RNase-free的互补脱氧核糖核酸的合成进行了管(401001年,巢生物技术)Transcriptor合成第一链cDNA工具包(4897030001,罗氏公司),根据制造商的指示。定量PCR (qPCR)反应进行使用Hieff qPCR SYBR绿色主人混合(H97410 Yeasen) QuantStudio 6实时PCR系统(技术)。引物序列qPCR分析表中列出1。

2.3。基因表达与成分的消耗

基因击倒,短发卡rna(成分)荧光素酶(控制)或目标基因设计的在线工具(http://sirna.wi.mit.edu/),合成了GENEWIZ公司。使用pSuper-puro shRNA质粒的构建系统和净化设备(1211 - 01,Biomiga)。制与DNA转染使用Polyjet (SL100688 SignaGen),根据制造商的协议。转染的ESCs选择1μ从转染后24 h g / ml嘌呤霉素。经过四天的嘌呤霉素选择、转染细胞收获。列出成分表的序列2。

2.4。5和3快速放大的cDNA结束(种族)分析

3种族、合成第一链cDNA发起在保利(A)总RNA的尾巴使用退火益生元(dT)包含RT适配器底漆(美联社)mRNA。Gene-specific底漆pF1设计基于已知的序列。3片段是由底漆pF1放大和通用底漆gR1一起,比赛PCR产品1.5%的琼脂糖凝胶上分离。

5比赛,总RNA的合成第一链cDNA使用gene-specific底漆(RT GSP1),根据设计3已知的序列。均聚物的尾巴随后添加到3 - - - - - -互补脱氧核糖核酸末端转移酶的使用的工具包(2230 a,豆类),根据制造商的指示。第一轮PCR进行基于聚(C)尾dG适配器设计引物合成双链的互补。然后,通用底漆gP1中和gene-specific底漆pR2被用于第二轮PCR扩增cDNA 5结束序列。比赛PCR产品1.5%琼脂糖凝胶上分离和克隆到pEASY-T1 Sanger测序(TransGen生物技术)。gene-specific竞赛引物用于映射两端被从Sangon生物技术和列在表中3。

2.5。Dual-Luciferase报告基因分析

鼠标的ESCs被播种密度 细胞每口井24-well板。如前所述(执行荧光素酶检测16]。总额200 ng lncRNA不同启动子的Lx8-SINE B2或pGL4.23空向量是转染到每个E14灯头ESC的24-well板连同10 ng pCMV-Renilla。转染后媒介改变了12 h。收集36 h,转染后细胞和细胞溶解1 x被动裂解缓冲。荧光素酶活性是由Dual-Luciferase记者分析系统(# E1910, Promega)根据制造商的指示。

2.6。统计分析

与学生的数据进行了分析 - - - - - -测试(双尾)。显著差异被定义为ns无意义的, ,和 。

3所示。结果

3.1。lncRNA的全长序列的映射Lx8-SINE B2

通过挖掘前出版17),结果表明:lincrna - 1282表达的ESCs的差别及其损耗导致对这些原癌基因(17),这是一个重要的改变因素。因此,我们开始着手执行种族的长篇lincrna - 1282 (17),这是一个部分的lncRNA序列Lx8-SINE B2。识别的全部长度Lx8-SINE B2,我们执行3种族和5种族与引物设计(数字1(一)和1 (b))。5的扩增子和3种族是可见作为一个单独的DNA带没有多个或非特定的乐队(数字1(一)和1 (b))。接下来,我们测序lncRNA的扩增子和确定序列Lx8-SINE B2(图1 (c))。与5和3结束的lncRNALx8-SINE B2发现,我们设计了引物放大lncRNA的全长Lx8-SINE B2和subcloned lncRNA TA克隆载体(图1 (d))。的lncRNALx8-SINE B2lncRNA变成了734个基点。

3.2。表达模式的lncRNALx8-SINE B2

我们搜查了lncRNA序列Lx8-SINE B2对老鼠的基因组(mm10)和发现lncRNALx8-SINE B2包含3个外显子,位于两者之间Adgrv1和Lysmd3基因(图2(一个))。外显子1的lncRNALx8-SINE B2重叠LINE1和家人Lx8及其第三外显子与正弦B2(图重叠2(一个));因此,我们这个lncRNA命名Lx8-SINE B2。我们设计了引物的nonrepeat地区外显子2和3检测lncRNA的表达Lx8-SINE B2。有趣的是,注意到lncRNALx8-SINE B2在ESC分化表达下调,类似于多能性基因Oct4,Sox2,Esrrb据qPCR结果(图2 (b))。我们还发现,lncRNALx8-SINE B2ESCs也表达而不是分化细胞如MEF(图2 (c))。此外,我们表明,lncRNA的表达Lx8-SINE B2不受变更影响的ESC文化条件。其表达略调节的i /生活或2我条件与血清(图/生活文化条件2 (d))。这些建议lncRNALx8-SINE B2ESC的标志。

3.3。启动子的结构lncRNALx8-SINE B2

在那之后,我们检查了lncRNA的具体表达式Lx8-SINE B2是实现。上游1 kb lncRNA的启动子区域Lx8-SINE B2包含ORR1D2和正弦B1(图3(一个))。学习如何Lx8-SINE B2ESCs的监管,我们克隆-623基点,至+ 327基点lncRNA呢Lx8-SINE B2基因植入荧光素酶记者(数字3(一个)和3 (b))。我们还创建了各种截断版本的这个区域识别的核心启动子Lx8-SINE B2(图3 (b))。ERV相应区域,origin-region重复1型D2 (ORR1D2, -157年英国石油公司bp + 3)进行最强的子活动与其他截断(图3 (c))。启动子的活性ORR1D2特定的ESCs但灭活在3 t3成纤维细胞(图3 (d))。这些结果支持lncRNALx8-SINE B2是由ERV ORR1D2暗示,te不仅有助于lncRNAs的外显子还lncRNAs的启动子。

3.4。转录调节lncRNALx8-SINE B2由Oct4 Sox2

转录因子激活lncRNA识别Lx8-SINE B2,我们耗尽三个核心多能性转录因子(Oct4、Sox2 Nanog)(数据4(一)- - - - - -4 (c))。损耗的Oct4或Sox2,但不Nanog强烈抑制lncRNALx8-SINE B2表达式(数据4(一)- - - - - -4 (c))。我们还研究了lncRNA的表达Lx8-SINE B2耗尽后Oct4,Sox2,Nanog(数据4(一)- - - - - -4 (c))。然而,损耗Sox2或Oct4,但不Nanog,影响启动子活性ORR1D2(数据4 (d)- - - - - -4 (f))。Sox2损耗比Oct4对ORR1D2强抑制,Nanog(数字4 (d)- - - - - -4 (f))。此外,我们研究了绑定Oct4、Sox2, Nanog lncRNA的启动子Lx8-SINE B2。与荧光素酶测定结果一致,只有Oct4和Sox2绑定到发起人根据我们的分析发表ChIP-seq数据(图4 (g))。这些结果表明,Sox2和Oct4直接绑定到ORR1D2激活Lx8-SINE B2在的ESCs(图4 (g))。

排除的可能性Oct4 lncRNA Sox2激活邻近基因Lx8-SINE B2一起,我们检查的表达Lysmd3和Adgrv1在ESC分化。不同于lncRNALx8-SINE B2,两个Lysmd3和Adgrv1被生活影响撤军(图5(一个))。此外,的表达Lysmd3和Adgrv1被激活的损耗Oct4或Sox2,这表明它们是不同于监管Lx8-SINE B2(数据5 (b)和5 (c))。此外,LINE1和正弦B2的表达没有影响Oct4或Sox2损耗(图5 (d)),确认Oct4的特异性和Sox2在激活lncRNA的表达Lx8-SINE B2。

4所示。讨论

总之,我们发现了一个新的lncRNA多能性标志Lx8-SINE B2的表达式是由绑定Oct4 ORR1D2 Sox2。Oct4和Sox2 ESCs的核心多能性监管机构(18,19]。Oct4 Sox2可以驱动lncRNAs在癌细胞和ESCs的表达20.- - - - - -22]。绑定的OCT4是不同的在人类和小鼠的ESCs [23),可以解释为其绑定不同种特异的te (23]。在这里,我们发现Oct4和Sox2目标鼠标TE ORR1D2开车ESC-specific lncRNA表达式(图4),进一步支持测试的重要作用在推动物种特异性lncRNAs的表达。有许多多能性标记;然而,我们提供Lx8-SINE B2作为一个额外的小说多能性的标志。它位于下游的关键多能性基因Oct4和Sox2(图4)。它组成的te和有别于传统的多能性的标志。相比其他ESC标记,Lx8-SINE B2是独一无二的作为ORR1D2-driven多能性标记,表明转座的元素可以作为细胞特定类型lncRNA和启动子,类似于蛋白质编码的基因。最后,它消耗的差别,对这些基因相关联Myc在的ESCs [17];因此,Lx8-SINE B2表达式也反映出Myc表达式的ESCs的地位。Myc压制原始内胚层分化(24]。Myc还维护ESC多能性和自我更新25]。因此,我们推测,lncRNA的损耗Lx8-SINE B2可能导致表型相似。差别Myc对这些

我们的研究表明,不同类型的测试工程师结合形成lncRNA和驱动lncRNA表达式(数据2和3),暗示te lncRNA的重要组成部分。te lncRNAs工作作为一项重要的RNA域(26,27]。te lncRNAs调节组织内的表达lncRNAs [4,28]。在人类,lncRNAs包含HERVH专门表达在人类的ESCs [3,4,7]。内te lncRNAs也有助于他们的功能。例如,正弦的反义lncRNA B2Uchl1与Uchl1信使rna,促进翻译Uchl1通过加强协会的信使rna多核糖体(29日]。这些研究表明,te是lncRNAs的表达和功能的关键。鉴于lncRNALx8-SINE B2由TE Lx8和正弦B2,这将是有趣的调查是否ORR1D2驱动其他lncRNAs Lx8的功能的表达和正弦B2 lncRNAs未来的研究。

5。结论

总之,我们绘制了长篇lncRNA序列Lx8-SINE B2并发现它作为ESC-specific lncRNA。我们还发现,它是由ORR1D2受Sox2及其转录Oct4开车。这些发现支持te lncRNA的重要组成和启动子。

数据可用性

芯片数据分析发表Cistrome [30.在这项研究中对Sox2 GSE54103 [31日),GSE78073 Oct4 [32),GSE56312 Nanog [33]。

的利益冲突

我们声明,没有利益冲突,在这项研究中。

作者的贡献

陆x的构思和设计研究。足球俱乐部,M.Z., and X. Li performed most experiments. X.F. and H.S. did bioinformatics analysis. F.C., M.Z., and X. Lu wrote the manuscript.

确认

支持这项工作由中国国家自然科学基金(31871488,31871488),中国国家重点研发项目(2018 yfa0107000)和基础研究基金为中央大学(63151113,63161150)。我们感谢Ruiqing陈他的技术援助。

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