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干细胞国际
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干细胞国际/2021年/文章

研究文章|开放获取

体积 2021年 |文章的ID 6655372 | https://doi.org/10.1155/2021/6655372

杰弗里·j . Yu丹尼尔·b·阿赞玛丽莲Chwa,凯文•施耐德Jang-Hyeon曹,Chinhui香,亨利·克拉森,m .克里斯蒂娜•肯尼京阳, ”年龄相关性黄斑变性(AMD) Transmitochondrial胞质杂种防止细胞损伤和死亡由人类视网膜祖细胞(hRPCs)”,干细胞国际, 卷。2021年, 文章的ID6655372, 15 页面, 2021年。 https://doi.org/10.1155/2021/6655372

年龄相关性黄斑变性(AMD) Transmitochondrial胞质杂种防止细胞损伤和死亡由人类视网膜祖细胞(hRPCs)

杰弗里·j·余,1 丹尼尔·b·阿扎,1 玛丽莲Chwa,1 凯文·施耐德,1 Jang-Hyeon曹,1 Chinhui香,1 亨利克拉森,1 m·克里斯蒂娜•肯尼,1,2 和 杨京1

1眼科、加文·赫伯特眼科研究所,加州大学欧文,欧文,CA 92697,美国

2病理学和实验室医学部门,加州大学欧文,欧文CA 92697,美国

学术编辑器:瓦Sorrenti
收到了 2020年12月10
修改后的 2021年1月20日
接受 2021年1月25日
发表 09年2月2021年

文摘

目的。全世界不可逆致盲的主要原因之一,年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种进步的障碍导致视网膜变性。虽然存在一些治疗方案渗出型AMD,目前没有fda批准的治疗更常见nonexudative(萎缩)形式。越来越多的证据表明,线粒体损伤和视网膜色素上皮(RPE)细胞死亡与AMD的发病机制有关。人类视网膜祖细胞(hRPCs)研究了作为一个潜在的恢复性治疗视网膜退行性条件;然而,在AMD hRPC治疗对视网膜细胞生存的影响尚未阐明。方法。在这项研究中,我们使用一个细胞coculture hRPCs组成的系统和AMD或年龄的正常胞质杂种细胞特征的影响hRPCs保护AMD的胞质杂种细胞和线粒体损伤和死亡。结果。AMD胞质杂种cocultured hRPCs显示(1)增加细胞生存能力;(2)降低基因表达与细胞凋亡有关,自噬,内质网(ER)压力,和抗氧化途径;和线粒体的差别(3)对这些基因的复制基因相比,AMD胞质杂种不hRPC治疗。此外,hRPCs cocultured与AMD胞质杂种显示upregulation(1)神经元和神经胶质的标记,以及(2)假定的神经因素,反应与年龄没有找到hRPCs cocultured时正常胞质杂种。结论。目前的研究提供了第一个证据,疗效可能获得使用萎缩性AMD的祖细胞的方法。hRPCs之间存在我们的研究结果表明,双向交互和AMD等胞质杂种hRPCs释放保护营养因素对细胞的胞质杂种和线粒体的变化参与AMD的发病机理,相反,AMD胞质杂种移植这些神经保护因子的释放hRPCs同时促进hRPC分化。这些在体外数据提供的证据表明,hRPCs可能治疗萎缩性AMD的潜能。

1。介绍

年龄相关性黄斑变性(AMD)、病情进行性视网膜,是一个全世界的原则不可逆致盲的原因(1,2]。流行病学研究估计,有1000万美国人患有AMD,堪比1200万年癌症,超过了500万年,阿尔茨海默病(3- - - - - -6]。AMD的发病机制涉及两个分类,萎缩性(“干”)形式和渗出性(“湿”)的形式。干AMD是一种慢性的、进步的状态,开始无症状地与不溶性的细胞外沉积点聚集布鲁赫膜与视网膜色素上皮(RPE) [1,3,7]。在其晚期,然后这个条件发展地理萎缩,表现与RPE的退化和损失的感光细胞,可引起严重的失明(1,8]。AMD的不太常见的湿形式出现,经常在严重程度迅速进展。这种形式分类的脉络膜新生血管形成,血管不成熟导致视网膜下出血和液体泄漏,造成突然丧失中央视力的3]。超过80%的AMD患者分为有干燥的形式,然而,这些患者可能发展为湿性AMD,导致更严重的视力丧失(9]。理解AMD的发病机理是复杂的,因为它不仅涉及到遗传倾向,也至少有四个贡献流程,包括lipofuscinogenesis drusogenesis,局部炎症,和脉络膜新生血管形成9]。

治疗湿性AMD包括火鸟配方和几个fda批准的有效的抗血管治疗1,10,11]。另一方面,虽然吃绿叶蔬菜富含抗氧化剂被广泛推荐干AMD,没有fda批准的治疗这种情况(1,12]。

视网膜是需氧组织在体内最高的国家之一,在很大程度上依赖于线粒体ATP通过氧化代谢的生产(1,13]。根据线粒体内共生理论,是一种细胞器,是从细菌的祖先进化而来,包含自己的基因组只转移通过女性生殖系(14,15]。线粒体DNA (mtDNA)是圆形和双链编码各种关键蛋白质的氧化磷酸化(1,15]。由于其DNA修复能力差,mtDNA非常容易受到氧化损伤,导致能量代谢的中断。这是氧化应激的结果,减少抗氧化剂,并最终RPE细胞死亡。异常的线粒体功能和顺向RPE细胞死亡与各种眼部条件,包括AMD、糖尿病视网膜病变、青光眼(16- - - - - -19]。

各种细胞——和基于基因疗法已成为可能的恢复性治疗视网膜退行性条件,涉及光感受器的损失(20.]。基于单元的方法感兴趣的一个原因与穷人先天哺乳动物中枢神经系统的再生能力,其后果之一是,光感受器的损失是不可逆转的21]。干细胞移植有公认的潜力不仅作为视网膜细胞替换的方法,也是一种手段,为主机提供营养支持神经元,包括光感受器(22]。例如,人类胚胎干细胞在干AMD RPE细胞经历了临床试验施瓦茨et al。23,24),而不同的细胞类型,即hRPCs,显示潜在的光感受器神经保护的设置和相关保护视网膜变性的临床前模型的视觉功能25]。在后者的例子中,视觉的好处与移植hRPCs释放营养因素。另外,通过感光替代rpc可能提供好处。这些替代策略导致了早期临床试验的hRPCs视网膜色素变性(RP) jCyte (1/2a阶段NCT02320812第二阶段bNCT030737331/2a)和ReNeuron(阶段NCT02464436)。

据我们所知,没有先前的研究调查的角色hRPCs保护AMD transmitochondrial ARPE-19胞质杂种细胞或AMD线粒体。为了更好地理解hRPCs与RPE交互的机制,我们创建transmitochondrial胞质杂种通过线粒体ARPE-19的融合Rho0与血小板细胞,含有大量的线粒体,从AMD或分离的同龄正常患者。以前,我们已经表明,RNA和蛋白质的表达水平明显不同的AMD胞质杂种正常胞质杂种相比,尽管拥有相同的原子核在所有细胞系(26]。这些表情的变化是由于mtDNA的差异。此外,我们已经表明,AMD胞质杂种显示增加mtDNA碎片,受损的mt /复制转录基因的表达水平,调节基因和蛋白质proapoptotic, mtROS水平,增加和减少细胞生存能力相比正常胞质杂种(1]。我们最近的研究显示,mitochondrial-derived肽Humanin G,此外,抗氧化化合物白藜芦醇保护AMD ARPE-19胞质杂种从死亡1,10]。

目前的研究方法使用一个细胞coculture hRPCs和AMD胞质杂种细胞组成的系统来测试假设hRPCs会抑制有害基因的表达与AMD的发病机理有关。我们发现的coculture hRPCs与AMD胞质杂种导致增加细胞生存能力和减少细胞凋亡的RNA的表达水平,自噬,内质网(ER)压力,抗氧化途径。此外,coculture导致线粒体基因复制和生物起源的表达下降。重要的是,在hRPCs检查AMD胞质杂种的影响,我们发现hRPCs应对疾病AMD与增加表达神经保护因子和胞质杂种upregulation胶质和神经元标记。时没有发现此响应cocultured与同龄正常胞质杂种。我们的研究结果表明,双向交互之间发生hRPCs和AMD等胞质杂种hRPCs释放保护RPE细胞营养因素对细胞的变化参与AMD的发病机理,而AMD胞质杂种(AMD与受损的线粒体)促进神经保护因子的表达式hRPCs以及多能祖细胞的分化。总之,这些在体外数据导致越来越多的迹象显示,hRPC移植携带潜在候选人治疗萎缩性AMD。

2。材料和方法

2.1。道德声明

涉及人体受试者的研究是根据表达的原则进行的《赫尔辛基宣言》。告知获得书面同意,所有研究机构审查委员会批准的加州大学欧文(UCI IRB # 2003 - 3131)和加州大学欧文分校的人类干细胞研究监督委员会(UCI hSCRO # 2007 - 5935)。

2.2。创建AMD Transmitochondrial胞质杂种

如前所述(创建Transmitochondrial胞质杂种19]。聚乙二醇的线粒体融合ARPE-19 (Rho0)细胞和血小板mitochondria-rich隔绝AMD患者或年龄的正常(AMD, , 年;正常的, , 年; )执行创建AMD和控制胞质杂种(图1)。这些患者的流行病学信息如表所示1。成功融合的确认与验证mtDNA haplogroup简介,相比原来的血液样本到新创建的胞质杂种细胞系。通过5 transmitochondrial胞质杂种是用于所有实验。


图1
系统设计。(a)过程的示意图为创建AMD和正常胞质杂种利用聚乙二醇线粒体融合ARPE-19 (Rho0)细胞和mitochondria-rich血小板分离外周血AMD患者或年龄相当正常的病人。(b)的示意图说明了双向信号通路介导的coculture hRPCs与AMD胞质杂种。(c)过程的示意图隔离人类视网膜祖细胞从人类胎儿的眼睛。一个人类胎儿的眼睛(17 - 20周胎龄)获得的治疗终止怀孕。
AMD 正常的
胞质杂种 Haplogroup 年龄 性 种族 胞质杂种 Haplogroup 年龄 性 种族
14.139 H17b 81年 F 高加索人 14.132 H3an 78年 米 高加索人
14.141 H11a2a1 82年 F 高加索人 14.135 H 75年 F 高加索人
14.144 H14a2 86年 F 高加索人 17.193 H 89年 米 高加索人
14.146 H7c6 75年 F 高加索人
15.155 H5a1 76年 米 高加索人
胞质杂种中列出AMD和正常组织的类似mtDNA haplogroup,年龄和种族被用于实验。AMD的平均年龄比正常胞质杂种不明显不同, 。
表1
人口的AMD和正常胞质杂种细胞生存能力和基因表达的实验中使用。
2.3。人类视网膜祖细胞的隔离

隔离和hRPCs文化进行如前所述[27- - - - - -29日]。人类胎儿的眼睛(17 - 20周胎龄)获得治疗终止怀孕。Neuroretina组织被TrypLE切割机械和保持酶的分离(生活技术,大岛,纽约,美国)。这些细胞和细胞集群被清洗,镀,扩大在体外。在每个通道隔离,用台盼蓝细胞数量和生存能力测定。

2.4。与hRPCs Coculture Transmitochondrial的胞质杂种

在每个试验中,AMD胞质杂种细胞培养有或没有hRPCs。030万hRPCs镀在fibronectin-coated Transwell细胞培养与1插入μ米孔隙大小(美国NH费舍尔科学、汉普顿)和生长在先进的DMEM / F12培养基补充与N2 Glutamax, EGF (20 ng / ml), bFGF (20 ng / ml)(美国纽约生活技术,大岛屿)在37°C。同时,050万年six-well镀AMD胞质杂种的盘子和细胞生长在DMEM / F12培养基含有10%的边后卫在37°C 24小时恢复。分离培养24小时后,媒体hRPCs和胞质杂种都新鲜hRPC媒体所取代。细胞培养插入包含hRPCs都被转移到cybrid-containing six-well板块开始coculture孵化的37°C。后48小时coculture Transwell插入包含hRPCs被移除,hRPCs和胞质杂种使胰蛋白酶化需要进一步的实验。研究hRPC的反应,hRPCs镀单独或与胞质杂种cocultured来源于健康的个人或AMD患者。

2.5。细胞计数和可行性分析

48小时后文化,使胰蛋白酶化样品cocultured和控制胞质杂种暴露在台盼蓝染料和转移到幻灯片与伯爵夫人自动细胞计数细胞计数器(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。活的平均数字的治疗和控制细胞克隆组相比,使用一个未配对参数 - - - - - -测试。

2.6。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

RNA提取从coculture和控制使用RNeasy胞质杂种的迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)后,制造商的协议。RNA量化后使用NanoDrop 1000分光光度计(美国马热科学、沃尔瑟姆),互补脱氧核糖核酸数据库是由逆转录使用上标很掌握混合(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)或Omniscript RT工具包(试剂盒Inc .,瓦伦西亚,CA)。互补脱氧核糖核酸是稀释和储存在-20°C。

2.7。定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

使用StepOnePlus RT-qPCR进行实时PCR系统和QuantStudio 6 Flex(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)。QuantiTect底漆化验(试剂盒)和电力SYBR绿色PCR反应混合液(生活技术,大岛,纽约,美国)。表2详细列出了引物信息与细胞凋亡相关的基因(伯灵顿,CASP3,CASP7,CASP9),自噬(ATG5,ATG12,LAMP2,LC3B,PARK2)、内质网应激(DDIT3和XBP1)、氧化剂(GPX3,SOD2,NQO1)和线粒体复制(POLG,POLRMT,TFAM)。TaqMan试验系统用于hRPC标记:胶质血统(GFAP),神经元血统(MAP2)和神经保护(MDK,PTN,FGF2)。样本运行一式三份hmb和GAPDH,用作看家基因。的ΔΔCt方法用于计算表达式褶皱变化之间的每个胞质杂种的治疗组和对照组。
象征 基因名字 加入基因库。 函数
细胞凋亡
伯灵顿 BCL2-associated X NM_001291428
NM_001291429
NM_001291430
NM_001291431
NM_004324
NM_138761
NM_138763
NM_138764		 这个基因编码一个本地化的线粒体蛋白质与守恒的b细胞淋巴瘤2同源性主题。编码的蛋白表达降低的凋亡。
CASP3 半胱天冬酶3 apoptosis-related半胱氨酸肽酶 NM_004346
NM_032991		 编码蛋白作为cysteine-aspartic酸性蛋白酶在细胞凋亡的执行阶段中扮演了中心角色。
CASP7 半胱天冬酶7,apoptosis-related半胱氨酸肽酶 NM_145248
XM_006725153
XM_006725154
XM_005268295
XM_006725155
XM_005268294
XM_006719962		 这个基因编码的一员cysteine-aspartic酸性蛋白酶(半胱天冬酶)的家庭。还起着核心作用的顺序激活细胞凋亡的执行阶段。
CASP9 半胱天冬酶9日apoptosis-related半胱氨酸肽酶 NM_001229
NM_032996		 编码的一员cysteine-aspartic酸性蛋白酶(半胱天冬酶)的家庭,这是参与细胞凋亡的执行阶段。
自噬
ATG5 Autophagy-related 5 NM_001286106.1
NM_001286107.1
NM_001286108.1
NM_001286111.1
NM_004849.4		 由这个基因编码的蛋白质,结合自噬蛋白12函数作为一个E1-like激活酶在ubiquitin-like共扼体系。编码的蛋白质参与了几个细胞过程,包括自噬泡形成、氧化损伤后线粒体质量控制,负监管的天生的抗病毒免疫反应,淋巴细胞的发展和扩散,MHC II抗原,脂肪细胞的分化和凋亡。几个成绩单变体编码不同蛋白亚型已经发现了这种基因。
ATG12 Autophagy-related 12 NM_001277783.2
NM_004707.4		 自噬是一个过程的大部分蛋白质降解细胞质组件,包括细胞器,封闭的双层膜结构被称为自噬小体和交付为降解溶酶体、液泡。ATG12是人类同族体自噬相关蛋白的酵母。
LAMP2 Lysosomal-associated膜蛋白2 NM_001122606.1
NM_002294.3
NM_013995.2		 由这个基因编码的蛋白质是膜糖蛋白家族的一员。这糖蛋白为selectins提供碳水化合物配体。它可能在肿瘤细胞转移中发挥作用。它也可能功能保护、维护和溶酶体的粘附。可变剪接基因导致多个记录变体编码不同的蛋白质。
LC3B Microtubule-associated蛋白质1轻链3β NM_022818.5 这个基因的产物是一个亚基的神经microtubule-associated MAP1A MAP1B蛋白质,参与微管装配和重要的神经发生。研究老鼠同族体暗示这种基因的作用在自噬,这一过程涉及到大量降解的细胞质成分。
PARK2 帕金RBR E3泛素蛋白连接酶 NM_004562.3
NM_013987.3
NM_013988.3		 这个基因的确切功能尚不清楚;然而,编码的蛋白质是multiprotein E3泛素连接酶的一个组件复杂,协调目标底物蛋白的蛋白酶体降解。这种基因突变所导致帕金森疾病和常染色体隐性青少年帕金森病。这个基因的选择性剪接产生多个记录变体编码不同的亚型。这种额外的拼接基因型的描述,但目前缺乏记录支持。
ER应激
DDIT3 DNA损伤诱导转录3 NM_001195053.1
NM_001195054.1
NM_001195055.1
NM_001195056.1
NM_001195057.1
NM_004083.5		 这个基因编码的一员CCAAT / enhancer-binding蛋白(C / EBP)转录因子家族。蛋白质功能作为显性负抑制剂通过形成与其他形成C / EBP成员,如C / EBP和圈(肝激活蛋白),防止他们的DNA结合活性。蛋白质与脂肪形成和红细胞生成,激活内质网压力,并促进细胞凋亡。融合基因和付16号染色体上或EWSR1引起的22号染色体易位产生嵌合体蛋白黏液样脂肪肉瘤和尤因肉瘤。多个或者拼接成绩单变体编码两个亚型不同长度已确定。
XBP1 x - box结合蛋白1 NM_001079539.1
NM_005080.3		 这个基因编码转录因子调节MHC II级基因通过绑定到子元素称为X盒子。这个基因产物是一种bZIP蛋白,也被确定为一个细胞转录因子结合的增强启动子的T细胞白血病病毒1型启动子。它可能会增加病毒蛋白的表达作为病毒反式激活因子的DNA结合的伴侣。人们已经发现,在积累的蛋白质在内质网(ER),这种基因的mRNA加工一个活跃的形式由一个非传统的剪接机制介导的酶inositol-requiring酶1 (IRE1)。由此产生的损失的26元拼接mRNA原因框移和同种型XBP1 (S),这是转录因子功能活跃。同种型编码unspliced mRNA, XBP1 (U),表达起来从而认为函数作为XBP1的负面反馈调节器(S),期间关闭了目标基因的转录ER应激的复苏阶段。XBP1已被确认和本地化的假基因染色体5。
抗氧化剂
GPX3 谷胱甘肽过氧化物酶3 NM_002084 由这个基因编码的蛋白质属于谷胱甘肽过氧化物酶家族,成员的催化还原有机氢过氧化物和过氧化氢(H2O2谷胱甘肽),从而保护细胞免受氧化损伤。几个同功酶的基因家族存在于脊椎动物、细胞位置和不同底物特异性。
SOD2 超氧化物歧化酶2 NM_000636 这个基因是一个铁/锰超氧化物歧化酶家族的成员。它编码一个线粒体蛋白质形成homotetramer和绑定一个每个亚基锰离子。这种蛋白质结合的超氧化物副产品氧化磷酸化,并将它们转换成过氧化氢和双原子氧。
NQO1 NAD (P) H醌脱氢酶1 NM_000903.3
NM_001025433.2
NM_001025434.2
NM_001286137.2		 这个基因属于NAD (P) H脱氢酶(醌)家庭和编码胞质电子还原酶。这个FAD-binding蛋白质形式为对苯二酚和减少醌类。这种蛋白质的酶活性可以防止醌类的一个电子还原,结果生产激进的物种。这个基因的突变与迟发性运动障碍(TD)的风险增加hematotoxicity暴露于苯后,并对各种形式的癌症。改变了这种蛋白质的表达出现在许多肿瘤,也是与阿尔茨海默病(AD)。备用转录剪接变异体,编码不同的亚型,特点。
线粒体的复制
POLG DNA聚合酶γ,催化亚基 NM_001126131.2 这个基因编码线粒体DNA聚合酶的催化亚基。这个基因缺陷改变线粒体DNA的复制和线粒体DNA缺失可能导致进步的外部眼肌麻痹1 (PEOA1),以及其他疾病。
POLRMT RNA聚合酶线粒体 NM_005035.4 由这个基因编码的多肽是一种线粒体DNA-directed RNA聚合酶。基因产物的作用是线粒体基因表达和提供RNA引物启动线粒体基因组的复制。
TFAM 转录因子,线粒体 NM_001270782.1 这个基因编码一个重要线粒体转录因子。这个编码的蛋白在线粒体DNA复制和修复中也扮演了重要的角色。阿尔茨海默病和帕金森疾病已经与这个基因序列多态性有关。
神经胶质的标志
GFAP 胶质原纤维酸性蛋白 NM_001131019.3 由这个基因编码的蛋白质是一个主要的中间丝蛋白的成熟的星形胶质细胞。这种蛋白质是在开发过程中用作标记来区分从其他胶质细胞星形胶质细胞。基因突变导致疾病叫做亚历山大疾病,从而影响星形胶质细胞在中枢神经系统。可变剪接的结果是截然不同的亚型编码由多个记录变体。
神经元标记
MAP2 Microtubule-associated蛋白2 NM_001039538.2 由这个基因编码的蛋白质属于microtubule-associated蛋白质家族。蛋白质在这个家庭参与微管装配,神经发生必不可少的一步。相似的基因在大鼠和小鼠编码特异性神经元树突细胞骨架蛋白,建议在确定神经元的树突形态在开发。几个不同的亚型由或者拼接变体编码也被描述。
神经保护因素
MDK Midkine NM_001012333.2 由这个基因编码的蛋白质是小户型的一部分的分泌生长因子结合肝素的能力和应对视黄酸。这个编码蛋白质功能,促进细胞生长、迁移、血管生成,在肿瘤发生中是最重要的。这个基因已经被研究过各种疾病的治疗目标。多个亚型由或者拼接编码转录变异已被描述。
PTN Pleiotrophin NM_001321386.2 这个基因编码heparin-binding分泌生长因子。编码蛋白质功能在细胞生长和存活和迁移,以及血管生成和肿瘤发生。多个记录由于可变剪接变体和替代促进剂。
FGF2 纤维母细胞生长因子2 NM_001361665.2 这个基因编码一种蛋白质,它是家庭的一部分纤维母细胞生长因子(FGF)。FGF家族成员结合肝素和功能广泛的促有丝分裂的血管生成活动。基因产物已经涉及一系列不同的生物过程,包括肢体和神经系统的发展,肿瘤的生长,伤口愈合。这个基因的信使rna多聚腺苷酸化网站和结果在五个不同的亚型由于non-AUG替代翻译(CUG)和8月起始密码子。亚型由CUG定位在细胞核和intracrine效应发挥作用,而形式由8月通常是在胞液和扮演一个角色在这个FGF的旁分泌和自分泌的影响。
管家基因
hmb Hydroxymethylbilane合酶 NM_000190.4 由这个基因编码的蛋白质是hydroxymethylbilane合酶家族的一部分。基因产物是第三血红素生物合成途径中的酶作为催化剂四分子的头尾间凝结的胆色素原线性hydroxymethylbilane。基因突变与常染色体显性疾病急性间歇性卟啉病。
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶 NM_001256799.3 由这个基因编码的蛋白质是glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶家族的一部分。基因产物的催化碳水化合物的新陈代谢的重要一步,氧化磷酸化的glyceraldehyde-3-phosphate在场时的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和无机磷酸盐。
MT-ND2 线粒体编码NADH脱氢酶2 NC_012920.1 基因产物是一个核心单元的NADH脱氢酶复杂线粒体膜呼吸链。这个复杂的扮演的角色从NADH的呼吸链电子传递。泛醌被认为是这种酶的直接的电子受体。疾病与基因包括Leber视神经萎缩。
RNA18SN5 18 s核糖体RNA,它们 NR_003286.4 45 s核糖体DNA (rDNA)集群指定为RNR1通过RNR5染色体13日,14日,15日,21日和22日分别。445 s rDNA重复单元编码一个45 s rRNA前体,加工生产18岁,5.8年代,28 s rRNA。因此,这个基因是一个代表18 s rRNA,副本的染色体位置是未知的。
表2
信息与细胞凋亡相关的基因、自噬、压力,和抗氧化剂在AMD胞质杂种基因分析。基因分析hRPCs代表胶质和神经元的神经保护因子和标记血统。
2.8。线粒体DNA拷贝数

AMD胞质杂种( )镀在six-well盘子,和总DNA分离后48 h coculture使用DNA提取工具包(PUREGENE试剂盒,瓦伦西亚,CA)。为了确定mtDNA复制数字有或没有hRPC治疗,qPCR执行使用TaqMan基因表达分析(猫。# 4369016)18 s基因代表核DNA和mt-ND2代表mtDNA(猫。# 4331182,热费希尔科学)。相对mtDNA副本人数决定使用ΔΔCt方法。

2.9。统计分析

结果分析了治疗和控制组织之间的差异通过执行一个示例 - - - - - -测试表达式褶皱变化值为每个基因胞质杂种的五行,比较值和一个假设的值1(代表一个假设coculture和对照组之间没有区别)。折叠变化计算表达式 。因此,褶皱值高于1表明upregulation的基因与控制相比,基因的差别,而褶皱值小于1表明对这些比控制。确定统计学意义 值< 0.05。褶皱的变化和 基因差异表达的值比较,线粒体拷贝数,和细胞生存能力如表所示3。
AMD胞质杂种+ hRPCs (Tx)和AMD胞质杂种(CTRL) hRPCs + AMD胞质杂种(Tx)与hRPC +正常胞质杂种(CTRL)
基因 函数 Tx和CTRL褶皱 Tx和CTRL 价值 基因 函数 hRPC只 hRPC +正常胞质杂种 hRPC + AMD胞质杂种 Tx和CTRL褶皱 Tx和CTRL 价值
伯灵顿 细胞凋亡 0.78 0.023 MAP2 神经。标记 2.08 0.0015
CASP3 细胞凋亡 0.95 0.400 GFAP 神经胶质的标志 7.93 < 0.0001
CASP7 细胞凋亡 0.73 0.0001 MDK Neuroprotect。 3.53 < 0.0001
CASP9 细胞凋亡 0.97 0.686 PTN Neuroprotect。 2.71 < 0.0001
ATG5 自噬 0.88 0.042 FGF2 Neuroprotect。 2.16 < 0.0001
ATG12 自噬 0.78 0.068
LAMP2 自噬 0.75 0.029
LC3B 自噬 0.78 0.014
PARK2 自噬 0.74 0.001
DDIT3 ER应激 0.54 0.003
XBP1 ER应激 0.72 0.0001
GPX 抗氧化剂 0.74 0.001
SOD2 抗氧化剂 0.86 0.047
NQO1 抗氧化剂 1.29 0.389
POLG 水户。repl。 0.73 0.015
POLRMT 水户。repl。 0.79 0.107
TFAM 水户。repl。 0.73 0.025
水户。复制# 1.34 0.361
细胞生存能力 1.27 0.0019
以10为每个样本值。 。褶皱值高于1表明upregulation相比基因的控制。褶皱值低于1的基因相比,差别表明对这些控制。控件赋值为1。比较是通过使用一个示例 - - - - - -测试。AMD:年龄相关性黄斑变性;hRPC:人类视网膜祖细胞;Tx:治疗;控制:控制。
表3
存在基因差异表达分析,线粒体拷贝数,和细胞生存能力为AMD / hRPC与AMD和hRPC / AMD与hRPC /正常胞质杂种。

评估hRPC应对病AMD胞质杂种与健康的同龄正常胞质杂种,相对量化( )是利用。图基 - - - - - -测试和学生 - - - - - -用于测试(未配对) 两组之间的价值观,决定意义 。所有统计分析使用棱镜,版本7.0 (GraphPad软件Inc .)(数据2- - - - - -4)或JMP(图5)。


图2
AMD胞质杂种cocultured hRPCs显示增加细胞的可行性。用台盼蓝染料排斥试验,AMD胞质杂种的细胞生存能力与hRPCs cocultured 48小时显著增加( , )而AMD没有hRPCs胞质杂种。捕获的数据的平均数量的活细胞治疗和控制组织使用一个未配对参数相互比较 - - - - - -测试的样品 。
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图3
AMD胞质杂种cocultured hRPCs显示细胞凋亡的表达水平下降,自噬,ER压力,抗氧化基因在48小时。为了检查hRPCs的作用在保护AMD从mtDNA-mediated胞质杂种细胞损伤,我们使用中存在的差异基因表达谱分析细胞凋亡、自噬、ER应激和抗氧化基因在AMD胞质杂种hRPCs而没有hRPCs AMD胞质杂种。(模拟)AMD胞质杂种,hRPCs显著下调细胞凋亡基因(一):伯灵顿( , ), CASP3( , ), CASP7( , ),和CASP9( , ); 自噬基因(b):ATG5( , ), ATG12( , ), LAMP2( , ), LC3B( , ),和PARK2( , ); ER应激基因(c):DDIT3( , ),和XBP1( , );和抗氧化基因(d):GPX( , ), SOD2( , ),和NQO1( , )而未经处理的AMD胞质杂种。数据被表示为 标准化控制,正常胞质杂种的赋值1(虚线)。治疗和控制组织之间的数据被执行一次采样分析的差异 - - - - - -测试表达式褶皱变化值为每个基因(胞质杂种的五行 ),比较1的值和一个假设的价值。
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图4
在AMD胞质杂种,hRPCs mtDNA复制基因的表达减少。(一)AMD胞质杂种cocultured与hRPCs显示显著降低mtDNA复制基因的表达。AMD胞质杂种的hRPC治疗的表达水平较低POLG( , )和TFAM( , ),但不是POLRMT( , )相比,控制和未经处理的AMD胞质杂种(赋值1,虚线)。(b) AMD胞质杂种hRPCs处理并没有表现出显著差异mtDNA拷贝数与AMD胞质杂种(拷贝数相对于控制 , )。治疗和控制组织之间的数据被执行一次采样分析的差异 - - - - - -测试表达式褶皱变化值为每个基因(从胞质杂种的五行 )或线粒体DNA拷贝数( ),比较1的值和一个假设的价值。
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图5
增加神经元/胶质血统和神经保护基因的表达在hRPCs coculture与AMD胞质杂种。在hRPCs coculture与AMD胞质杂种的表达明显增加(a)的标记神经元(MAP2, , )和(b)胶质血统(GFAP, , )和神经保护因子(c)MDK( , ),(d)PTN( , ),和(e)FGF2( , )相比hRPCs与同龄正常胞质杂种。相对量化( )利用数据,图基 - - - - - -测试和学生 - - - - - -用于测试(未配对) 两组之间的价值观,决定意义 。见表3。

3所示。结果

3.1。比较AMD胞质杂种Cocultured hRPCs(治疗)和AMD胞质杂种不hRPCs(控制)
3.1.1。AMD胞质杂种Cocultured hRPCs展览增加细胞的可行性

在48 h, AMD胞质杂种cocultured与hRPCs相比表现出显著增加生存能力控制AMD胞质杂种(图2)。胞质杂种细胞收获生活的平均数量每在hRPC coculture组 ,而AMD控制胞质杂种 ( )。

3.1.2。Coculture AMD胞质杂种的hRPCs减少细胞凋亡的基因表达,自噬,ER压力,抗氧化基因在AMD胞质杂种

执行中存在确定的影响hRPC coculture在基因的表达参与了细胞损伤和死亡通路在AMD胞质杂种。细胞凋亡、自噬、ER应激和抗氧化基因表达下调在AMD胞质杂种cocultured hRPCs而控制AMD胞质杂种的种植过程中没有使用hRPC coculture。两个四个细胞凋亡基因测量相比,治疗组明显下降,治疗控制AMD胞质杂种(分配的值1和表示为图中的虚线:伯灵顿( , ),CASP3( , ),CASP7( , ),和CASP9( , ))(图3(一个))。四个五个自噬基因表达水平明显降低测量显示治疗组相比,控制:ATG5( , ),ATG12( , ),LAMP2( , ),LC3B( , ),和PARK2( , )(图3 (b))。两个两个ER应激基因测量在治疗组相比显著降低控制:DDIT3( , )和XBP1( , )(图3 (c))。两个测量三种抗氧化基因表达显著减少的治疗组相比,控制:GPX( , ),SOD2( , ),和NQO1( , )(图3 (d))。

3.1.3。hRPCs对AMD胞质杂种的影响线粒体

两三个线粒体的复制基因的表达水平有显著降低AMD胞质杂种cocultured hRPC细胞相比,控制和未经处理的AMD胞质杂种(图4(一)):POLG( , ),POLRMT( , ),和TFAM( , )。线粒体DNA拷贝数(拷贝数相对于 , ,图4 (b)hRPC之间)没有明显不同的治疗和控制组织(分配的值为1,图中虚线)。

3.2。比较hRPCs Cocultured与AMD胞质杂种(治疗)与hRPCs Cocultured正常胞质杂种(控制)
3.2.1之上。hRPC反应病变AMD胞质杂种与健康正常的胞质杂种

执行中存在确定的差异基因表达hRPCs cocultured AMD时胞质杂种coculture相比与同龄正常胞质杂种。hRPCs回应病变AMD通过upregulation标记的神经元胞质杂种(MAP2, , ,图5(一个))和胶质血统(GFAP, , ,图5 (b))。此外,hRPCs回应的AMD胞质杂种的表达水平升高的神经因素:MDK( , ,图5 (c)),PTN( , ,图5 (d)),FGF2( , ,图5 (e))。另一方面,hRPCs回应健康胞质杂种以最小的变化并不显著。

4所示。讨论

细胞疗法是一个新兴的治疗策略,各种形式的视网膜变性,目前无法治疗,近年来,一些早期临床试验启动(30.,31日]。与更传统的方法相比,细胞疗法面临的挑战之一是描绘行动的机制,它可以是复杂和困难的评估使用成熟的技术。尤其如此的设定cytoprotection由天生的旁分泌作用,如视网膜神经保护引起的rpc。在这项研究中,我们使用一个小说在体外coculture hRPCs系统结合transmitochondrial ARPE-19 AMD的胞质杂种模型研究人类视网膜祖细胞基因表达的影响变化和细胞损伤在AMD。通过细胞分析和分子生物学技术,我们发现hRPCs抑制基因表达变化在AMD发病机理和保护AMD的胞质杂种细胞损伤和死亡。此外,我们的数据表明,hRPCs应对AMD胞质杂种通过细胞分化和增加假定的神经保护因子的表达式。这些发现揭示的存在之间的双向信号hRPCs和AMD胞质杂种具有潜在的治疗意义,特别是对使用hRPCs干AMD。

之前的研究使用mtDNA-deficientRho0ARPE-19细胞表明,线粒体功能障碍起着作用,改变相关的核基因表达点沉积,炎症,脂质受体,和细胞外基质蛋白(1,32]。这表明氧化损伤在AMD mtDNA涉及疾病发病机理。当前的研究利用同一宿主细胞的线粒体Rho0创建transmitochondrial ARPE-19细胞胞质杂种含有线粒体隔绝AMD患者或与正常的病人。我们组之前发现AMD transmitochondrial胞质杂种显示细胞生存能力下降,降低mtDNA复制数据,减少线粒体转录/复制基因的表达,和调节基因和蛋白质表达的自噬,细胞凋亡,ER应激与胞质杂种具有与正常的线粒体(1]。因此,这些基因表达变化与RPE细胞损伤和死亡在AMD胞质杂种归因于病变AMD线粒体自核是相同的在所有的胞质杂种细胞系。我们之前显示这些胞质杂种是可靠的、个性化的模型为每个病人对于鼓励了线粒体靶向药物筛选(很有用1]。各种研究已经检查了各种治疗方法的角色作为AMD的治疗靶点,包括抗甲状腺药物,自噬调节、色素epithelium-derived因素(PEDF)和抗氧化化合物,如七叶亭[33- - - - - -36]。我们最近的研究显示,mitochondrial-derived肽Humanin G,此外,抗氧化化合物白藜芦醇保护AMD ARPE-19胞质杂种从死亡1,10]。

4.1。hRPCs在防止AMD胞质杂种细胞损伤和死亡

为了防止细胞和线粒体损伤在AMD,我们假设coculturing transmitochondrial AMD胞质杂种与hRPCs保护的胞质杂种细胞损伤和死亡。在这方面,AMD和正常胞质杂种与hRPCs cocultured,和细胞生存能力测量。据猜测,coculture AMD胞质杂种的hRPCs导致的可行的细胞数量显著增加( ),确认hRPCs AMD胞质杂种免受mitochondria-driven RPE细胞死亡。这些结果与先前的结果是一致的,媒体从hRPCs抑制RPE细胞死亡在体外,这表明hRPCs分泌凋亡分子救援RPE细胞氧化损伤(37]。此外,罗等人发现hRPCs移植到RCS大鼠的眼睛有所改善视力和更高的相比,外核层细胞计数vehicle-treated控制眼睛(28]。

确认后cytoprotective hRPCs对AMD胞质杂种的影响,然后,我们使用中存在调查的角色hRPCs基因表达变化与这些胞质杂种的RPE细胞死亡有关。基因表达水平的凋亡、自噬、ER压力,抗氧化基因显著下调AMD胞质杂种cocultured hRPCs而控制AMD胞质杂种不hRPC coculture。这些发现表明coculture hRPCs防止upregulation基因参与细胞损伤和死亡通路的AMD胞质杂种。我们的研究结果是一致的保护作用其他干细胞在视网膜退化,如诱导多功能干细胞RPE细胞(38]。

我们下一个检查的影响hRPC coculture AMD胞质杂种线粒体。AMD胞质杂种cocultured hRPCs显示的差别明显对这些POLG和TFAM基因,参与mtDNA复制。此外,mtDNA副本人数相似hRPC-treated AMD胞质杂种和未经处理的AMD胞质杂种。这些发现表明,AMD的有利影响,hRPCs胞质杂种不涉及增加mtDNA复制和/或线粒体生物起源。很可能hRPCs可以调节AMD线粒体通过其他已知函数,包括氧化磷酸化的变化和生物能疗法,或逆行信号(线粒体核)调节细胞凋亡和炎症通路和钙稳态。需要进一步的研究来确定潜在的机制(s) hRPCs救援胞质杂种的拥有AMD线粒体受损。其他研究已经报道的逆转在视网膜缺血大鼠线粒体功能障碍和RPE细胞通过静脉注射间充质干细胞(msc)和coculture msc、分别(39]。Mansergh等人视网膜祖细胞作为细胞疗法成功地保护视网膜功能雷伯氏世袭视神经病变,最常见的原发性线粒体紊乱(40]。我们的研究结果表明,hRPCs能够保护包含线粒体功能失调的AMD的胞质杂种细胞系,但作用机制尚不清楚。

4.2。AMD在hRPC神经元胞质杂种的作用/胶质分化和神经保护

在确认恢复hRPCs对AMD胞质杂种的影响,然后我们发现hRPCs回应AMD与增加表达假定的神经保护因子和胞质杂种upregulation胶质和神经元标记。重要的是,与正常胞质杂种不能够刺激视网膜祖细胞以类似的方式。因此,从AMD线粒体的存在似乎是足够的招募hRPCs保护。我们的数据表明,至少有一些干细胞样细胞能够拯救RPE细胞,这种效应可以诱导靶细胞或放大信号。除了神经保护,对于细胞替代rpc可能有用。这种方法的一个应用程序是由馆长等人从他们发现视网膜下过早视网膜细胞的移植不仅融入外核层也分化成成熟的光感受器(41]。我们的结果显示hRPC upregulation胶质和神经元标记表明这些细胞开始失去multipotency当cocultured AMD胞质杂种。虽然这些数据并没有解决可能分化成细胞,诱导分化看到可以提供好处的治疗安全严格神经保护方法通过限制移植hRPCs扩散。

在神经保护方面,基本的纤维母细胞生长因子(bFGF)是一种细胞因子与已知的营养效应在视网膜上,包括救援RCS大鼠模型中的感光细胞(42]。Midkine (MDK)是一种细胞因子在视网膜的发展发挥重要作用[43]。MDK也被报道救援感光细胞(44),似乎发挥了作用在调节视网膜损伤的局部组织反应45]。Pleiotrophin (PTN)是高度相关的细胞因子表达的人类神经祖细胞,包括hRPCs [46]。

综上所述,这些数据表明,hRPCs之间存在双向互动和AMD等胞质杂种hRPCs释放营养因素预防细胞改变参与AMD的发病机理,而AMD胞质杂种提供信号,导致hRPC分化和营养因子的高表达。

4.3。新范式为萎缩性AMD使用干细胞的方法

的作用机理hRPC coculture施加cytoprotective影响AMD胞质杂种还有待阐明。一个可能的机制可能是通过提高保护线粒体的数量。AMD之前的研究表明,线粒体和线粒体主要RPE与mitochondrial-derived肽可以通过预处理获救Humanin [1,47]。然而,我们的研究表明,hRPC coculture没有上调mtDNA复制基因或增加mtDNA复制数据。另一个可能的机制与早期的干细胞理论移植网站基于干细胞的分化,导致更换受损组织(40]。行动的热情追求这种模式近年来趋于衰落的一种替代机制涉及旁分泌作用方式(48- - - - - -50]。旁分泌理论的前提是,阻止细胞分泌治疗受伤的营养因素提供好处通过增强宿主组织的自然修复过程,通过身体接触结构修复,发挥cytoprotective效应(如基因表达降低的建议RPE细胞死亡),和细胞因子的分泌,其他细胞外蛋白质,或液。值得注意的是,从目前的研究结果提供了第一个证据,therapeutic-like好处可以获得在萎缩性AMD使用一个基于干细胞的方法。结合hRPC-secreted营养因素可能帮助恢复从AMD mitochondria-induced RPE损害,因此可能会提供一个候选治疗萎缩性AMD。识别这样的旁分泌因子将允许测试疗效独立于细胞移植,可以绕过细胞来源和各种与细胞移植有关的其他问题。

总之,这项研究表明hRPCs的保护作用与细胞死亡在AMD transmitochondrial胞质杂种。同时,AMD胞质杂种促进hRPCs的分化和移植假定的神经保护因子的表达式。我们的研究结果支持假设hRPCs提供一个重要的细胞生存的影响具有高潜在候选人疗法治疗萎缩性AMD。这些结果也强调hRPCs之间的双向互动和AMD胞质杂种通过分泌特定的营养因素,其潜在的有益的属性应该在未来的研究调查。此外,这种类型的coculture方法可能有更广泛的使用设定的试验开发,不仅为表征的旁分泌作用和细胞治疗产品测试,而且个性化医学,例如,预测个体对特定细胞药物产品的反应。除了hRPCs,该方法可能适应一系列药/细胞产品的测试以及细胞模型的疾病迹象,不限于视网膜或眼疾。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

杰弗里·j . Yu和丹尼尔·b·阿赞了同样的工作。

确认

这项工作是支持的发现眼睛的基础;波利和迈克尔·史密斯;伊迪丝和罗伊·卡佛;虹膜和b .杰拉尔德·康托尔基金会;蜜丝佛陀家庭基金会;和NEI R01 EY0127363 (MCK)。这项工作的部分支持由一个无限制的部门拨款的研究,以防止失明。我们承认的支持临床与转化科学研究所(ict)加州大学欧文。j。j Yu是阿诺德Mabei贝克曼的视网膜变性。

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