il - 1受体拮抗剂保护Gingival-Derived干/祖细胞的成骨能力炎性微环境诱导下Porphyromonas gingivalis脂多糖

文摘

间充质干细胞(msc)一直被认为是未来治疗选择牙周炎由于其优良的再生能力。然而,这仍然是一个挑战,保护msc的生物学性质从多个局部炎症环境中细菌毒素。本研究旨在调查interleukin-1受体拮抗剂的治疗效果(IL-1ra)细胞增殖,迁移和成骨分化gingival-derived间充质干细胞(业务)炎症微环境诱导下Porphyromonas gingivalis脂多糖(p . gingivalis -有限合伙人)。业务来自Sprague-Dawley (SD)老鼠的免费治疗牙龈组织p . gingivalis -有限合伙人(10μg / mL)来创建在体外炎性环境。不同浓度的IL-1ra (0.01 - 1μg / mL)被用来对抗有限合伙人的负面影响。细胞行为包括增殖、克隆形成单位(CFU),细胞迁移,成骨分化,矿物沉积,细胞因子生产评估调查保护IL-1ra对业务的影响下炎症。toll样受体4 (TLR4) /核转录因子(NF -κBκB)通路激活有限合伙人被评估实时定量聚合酶链反应(rt - pcr)和免疫印迹。为了应对p . gingivalis -有限合伙人治疗,细胞数量、克隆形成率、细胞迁移率、炎性细胞因子的生产与成骨的differentiation-associated蛋白质/ mRNA表达以及矿化结节被压制时间的方式。这些负面影响是有效的减毒IL-1ra政府以时间和剂量依赖性的方式。此外,mRNA的表达TLR4和德国产业投资银行α急剧减少IL-1ra时加入LPS-induced媒介。IL-1ra也扭转了LPS-induced TLR4 / NF -κB活化的免疫印迹。目前的研究显示,IL-1ra降低炎性细胞因子的生产在上层清液,以保护业务的成骨能力和其他生物属性p . gingivalis -LPS-induced炎性环境。这可能是解释IL-1ra下调TLR4-mediated NF -κB信号通路激活。

1。介绍

高度流行的炎性疾病,牙周炎是由细菌和他们的产品并将牙槽骨的逐步解体。先前的研究已经表明,与牙周炎的发病和进展Porphyromonas gingivalis(p . gingivalis),一个本地的梯形口服革兰氏阴性病菌的侵入牙周组织(1,2]。脂多糖(LPS)的主要毒力因子p . gingivalis在炎症反应和牙周组织破坏3]。不同牙周治疗执行;不幸的是,仍然存在许多障碍逆转骨吸收和再生牙周组织(4]。

间充质干细胞(msc)发挥重要作用在骨再生分化成成骨的祖细胞;因此,他们可以作为有前途的干细胞治疗牙周炎的骨缺损。骨髓干细胞(bmsc)证明自己在下颌骨成骨的效果临界大小的缺陷当播种在minipigs猪骨块(4]。与适当的支架,人类牙髓干细胞(hDPSCs)可以提高体内骨形成5,6]。牙龈干细胞/祖细胞(业务),类似于bmsc, hDPSCs过程自我更新和多能干细胞分化的潜能。Zhang et al。7]孤立祖/基质细胞从人类首次牙龈组织,并演示了其表面标记表达谱和多分化能力。业务的特点是简单、微创隔离(8]。一个优雅的研究田et al。9]表明LPS-induced炎症干扰成骨分化和增殖的业务。在这种情况下,有必要探讨有效的治疗在炎症条件保护业务的能力。

抗炎剂从天然来源可能是一个有前途的工具来恢复业务的功能。il - 1受体拮抗剂(IL-1ra),作为一个自然的il - 1拮抗剂,抑制il - 1β从绑定到il - 1受体和调节il - 1的活动(10]。Zhang et al。11解决,抗炎因子IL-1ra和TNF -α抑制剂(TNF-ai)可以促进成骨分化潜力的业务。事实上,il - 1α减少结缔组织附着丧失在实验性牙周炎支持认为IL-1ra可能在控制牙周炎症中扮演着重要的角色12]。前一个优雅的研究结论,结合IL-1ra-loaded哈水凝胶合成细胞外基质(HA-sECM),可以增强业务的再生能力在一个典型的牙周炎模型在小型猪13]。IL-1ra / G-MSCs / HA-sECM和G-MSCs / HA-sECM组显示更好的组织学、临床和放射学结果在牙周组织再生相比,比例和根独自滑行(SRP) (13]。与业务/ HA-sECM相比,IL-1ra /业务/ HA-sECM小组证明,牙周附着水平显著提高,交叉的上皮细胞的长度,结缔组织粘连,牙骨质再生,和骨再生(13]。然而,底层机制IL-1ra作为抗炎剂在体外没有调查业务。

目前的研究证明,过度IL-1ra可以阻止诱导核factor-kappa (NF - Bκ肠道上皮细胞(B)通路在Caco-214]。最近的一个试验的临床试验也表明IL-1ra可能会降低NF -κB信号血液白细胞,与乳腺癌预后相关(15]。NF -κB通路被定义为激活先天免疫的关键因素;与此同时,它开始破骨细胞分化和终端在牙周炎骨吸收16- - - - - -18]。然而,是否IL-1ra抑制活化的TLR4-mediated NF -κB通路业务仍不确定。

在我们目前的研究中,我们从Sprague-Dawley孤立的业务(SD)鼠牙龈组织为研究对象。有限合伙人的P.gingivalis被用来模拟一个体外炎症环境。多个浓度IL-1ra被添加到coculture模型对抗。这项研究的目的是阐明的贡献IL-1ra业务的集落形成、扩散、迁移和成骨分化能力和调查促炎细胞因子分泌的炎症和抗炎条件。此外,我们发现的潜在作用独特TLR4-mediated NF -κB信号通路的过程。

2。材料和方法

2.1。隔离和rGMSCs文化

本研究通过浙江大学的动物保健和使用委员会ZJU20200085数量。rGMSCs被隔绝6雄性SD大鼠自由牙龈组织的健康。简单地说,老鼠麻醉和安乐死臼齿周围的牙龈组织的集合。牙龈组织刷新了磷酸盐(PBS;美国HyClone)然后分离,deepithelized,碎成了碎片。组织碎片和dispase消化我(中性蛋白酶;4毫克/毫升;美国罗氏)和胶原酶(3毫克/毫升;美国Sigma-Aldrich),然后保持在2小时α最小的基本介质(αmem;HyClone)与10%胎牛血清(的边后卫;Gibco(16000 - 044),美国)和1% penicillin-streptomycin(美国ScienCell) 37°C在孵化器有限公司5%₂。每2 - 3天中被改变。有限稀释技术被用来获得单细胞殖民地(通道0)。细胞2通道5被用于后续的实验。

2.2。流仪rGMSC表型的分析

rMSC表面特异性抗原的表达被确定通过流式细胞术分析(流式细胞仪)。通道3 rGMSCs孵化在4°C在黑暗的房间里为30分钟FITC-conjugated单克隆抗体鼠STRO-1(美国eBioscience) CD34(英国Abcam)、CD105 (Abcam) CD146 (Abcam) CD73(美国正欲),和CD90(美国BioLegend),与FITC-conjugated鼠标anti-rat CD45 (becton dickinson)和FITC-conjugated兔子CD14(美国bios)。与PBS彻底清洗后,细胞进行流式细胞术分析评估表达式使用的比例FACScan流式细胞分析仪(正)。

2.3。评估rGMSC Multilineage分化潜能

(我)成骨诱导:rGMSCs从第二个段落被播种在six-well板块 细胞/好直到subconfluence大约24小时。对成骨细胞分化、细胞培养成骨诱导培养基中含有10更易/ Lβ甘油磷酸盐,50μg / mL维生素C 地塞米松(σ),然后每三天更新一次。rGMSCs也在基础培养基培养在同一浓度控制。文化增长后21天,茜素红(Leagene,中国)染色进行评估钙化沉积在两组。钙结节不同的井用照片记录(2)脂肪形成的感应:rGMSCs从第二个段落被播种在six-well板的密度 细胞/。当达到融合,脂肪形成的诱导培养基补充10 mg / L胰岛素,0.25μ0.5 mol / L地塞米松磷酸钠,更易与L异丁基methylxanthine, L和100更易与吲哚美辛(σ)添加,然后每3天更新。为控制,rGMSCs种植在同一浓度基本的媒介。油滴在细胞被沾油红O (Leagene)解决方案后21天。形成lipid-laden脂肪细胞被使用一个倒置显微镜观察,和图片(3)Chondrogenic感应:rGMSCs从第二个段落被安置在six-well板块的浓度 细胞/。细胞粘附后24小时内,chondrogenic感应介质包含10μg / L转化生长因子- (TGF)β1、50μg / mL维生素C, 地塞米松和0.22 g / L丙酮酸钠(所有从σ)添加,然后每3天更新。21天培养后,cartilage-specific蛋白多糖被阿尔新蓝评估(Solarbio)染色和记录照片

2.4。实验小组

第二段落的rGMSCs使胰蛋白酶化0.25%胰蛋白酶(Gibco), resuspended,培养在五个不同的媒体。所有的媒体都是每三天更换一次。实验分为5组:(我)阴性对照组(组1):基本的媒介(2)炎症组(组2):炎性介质组成的p . gingivalis有限合伙人(10μg / mL)(美国InvivoGen)在基础培养基(3)抗炎组(组3):补充与抗炎细胞因子IL-1ra (10 ng / mL)(美国PeproTech)炎性介质(iv)抗炎组(4)组:补充与抗炎细胞因子IL-1ra (100 ng / mL) (PeproTech)炎性介质(v)抗炎组(组5):与抗炎细胞因子IL-1ra补充(1μg / mL) (PeproTech)炎性介质

2.5。克隆形成单位(CFU)测定

评估rGMSCs的克隆形成潜在的炎症和抗炎的条件下,CFU化验。rGMSCs不同组的第二个段落被稀释,镀在100细胞/ 6-well板。14天的孵化后,细胞培养用PBS洗净,与4%多聚甲醛固定(Solarbio),然后沾染色(Solarbio) 10分钟。聚合50或更多的细胞被定义为一个殖民地。

2.6。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

CCK-8试验进行了测量细胞生存和增殖根据制造商的指示。rGMSCs从第二个段落被接种于96孔板的密度5000细胞/。细胞粘附,取代培养基后,分别根据集团分配上面列出。rGMSCs在正常孵化,炎症,抗炎介质可变时间间隔(1、3、7天)。文化的最后时期,CCK-8(美国SAB)单独的解决方案是添加和细胞培养在37°C的额外2 h。最后,光密度(OD)值在450 nm评估通过使用微型板块读者(PerkinElmer /设想,美国)。

2.7。伤口愈合划痕试验

rGMSCs来自不同团体被播种在文化板块和被允许增长到60% -80%的融合。孵化后,200年μL吸管提示被用来生成一个文化的差距在中间。分离细胞和PBS轻轻删除。新媒介与丝裂霉素(σ)被添加到每个盘子里。变量后时间间隔(24、48或72小时)的细胞迁移,抓伤口关闭与ImageJ倒置显微镜下测量和分析软件。rGMSCs开放地区发现的文化表达的结果。

2.8。刺激rGMSCs的成骨分化潜力在体外

评估炎症的影响和抗炎细胞因子在rGMSCs成骨的潜力,osteogenesis-related基因、蛋白质和矿物质沉积分别评估。rGMSC粘连后,介质被替换为不同的诱导成骨的媒体根据集团分配共有28天的培养。

2.8.1发布。定量实时聚合酶链反应(rt - pcr)检测成骨的基因表达

rt - pcr用于资格osteogenesis-related基因的信使rna表达水平包括碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、I型胶原蛋白(Col-I)和runt-related转录因子2 (Runx2)。变量后时间间隔(1、7和14天)的培养,从细胞中提取总RNA通过使用试剂盒试剂(美国表达载体)。然后,总RNA受到逆转录cDNA使用上标第一链合成装备(Fermentas、日本)后,制造商的协议。实时PCR分析进行SYBR绿色PCR设备(热费希尔科学、美国)的体积25μL反应混合物,12.5μL SYBR绿色的主结构,0.5μL的正向和反向引物2μ标本cDNA、L和9.5μL (ddH₂o .反应进行了10分钟95°C, 95°C和15秒的周期45秒60°C, 15秒95°C, 1分钟60°C,在95°C 15秒,15秒60°C。β肌动蛋白被选为内部控制。相对mRNA水平计算的表达式2^−ΔΔCt方法。表中列出使用的基因和引物1。

2.8.2。免疫印迹分析成骨的蛋白表达

免疫印迹分析采用的半定量的分析表达式的高山和OCN水平。总蛋白提取使用放射性免疫沉淀试验(里帕)(Solarbio)溶菌产物从rGMSCs曾培养7天,14天在不同的组。保证蛋白质的浓度从每个样本,bicinchoninic酸(BCA)方法(热)使用。样品被淹没在沸水中煮10分钟。蛋白质是由钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔)。随后,与三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶液渐变膜被封锁(TBST)(5%的脱脂牛奶,0.1%的Tween-20),然后一夜之间在4°C的环境中与主抗体包含高山(稀释至1:1000;美国AP13552a Abgent)、OCN(稀释至1:5000;美国ab133612 Abcam),β肌动蛋白(稀释至1:1000;美国60008 - 1 - ig Proteintech)。与TBST充分洗涤后,样本孵化与相应的二次抗体(HRP-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白,A0208;稀释至1:1000;Beyotime,中国)在室温下2 h。免疫反应是由一个可视化增强化学发光测定(美国PerkinElmer ECL)和蛋白质的灰值乐队被使用ImageJ量化。

2.8.3。细胞外基质矿化

茜素红染色(ARS)进行了确定矿物口供细胞因子的影响。后7、14和28天的感应,文化被固定在4%多聚甲醛(Solarbio) 30分钟,染色茜素红(Leagene) 30分钟,然后用氯化十六烷吡啶眠(阿拉丁,中国)和连续搅拌。560纳米的吸光度测量代表文化。

2.9。检测参与的NF -κB通路rGMSCs

2.9.1。rt - pcr NF -κB信号mRNA表达

rt - pcr用于资格TLR4的信使rna表达水平,抑制核转录因子kappa-Bα(我的人κBα)可变时间间隔(1、7和14天)。rt - pcr进行以类似的方式描述部分2.8。1。表列出相关基因和底漆使用1。

2.9.2。免疫印迹分析NF -κB通路

免疫印迹分析采用的半定量的分析表达水平的NF -κB p65, NF -κB磷酸化p65,我κBα,磷酸化κBα。孵化后1 h, rGMSCs不同组用冰冷的PBS洗净,然后用细胞刮刀和刮掉用近10秒钟在冰上。免疫印迹分析以类似的方式描述部分2.8。2。主要的抗体使用如下:NF -κB p65(稀释至1:2000;美国8242 t细胞信号),NF -κB磷酸化p65(稀释至1:2000;细胞信号,3033 t),我κBα亲和力AF5002(稀释1:2000年,美国),和磷酸化κBα(稀释1:2000年,亲和力AF2002)。

2.10。细胞因子释放的酶联免疫吸附试验(ELISA)

rGMSCs被播种在 每在six-well板块紧随其后的是变量的时间间隔(12、24、48小时)刺激按组分配。大量的细胞因子(il - 1β肿瘤坏死因子-α和IL-1ra)在上层清液测定使用酶联免疫试剂盒(Cusabio,中国)遵循制造商的建议。总之,上层的收集和离心机(1000 g在4°C 15分钟)。20μL(每个样本用移液器吸取到一个96孔板,混合着20μL抗体的鸡尾酒(检测器和捕获抗体),然后孵化2小时。洗涤和干燥后,100年μL衬底3,3 ,5、5 - - - - - -tetramethylbenzidine衬底链霉亲和素碱性磷酸酶(Genzyme)被添加到每个;然后,板块在黑暗中孵化30分钟在一盘瓶。最后,停止记录解决方案添加和吸光度的波长450 nm利用MCC 340多屏幕板读者(热费希尔科学Inc .,匹兹堡,PA)。

2.11。统计分析

总结数据表示为 (SD)和所有测量进行了一式三份。Kolmogorov-Smirnov(钴)执行测试来评估变量的正态分布。单向方差分析(方差分析)其次是费舍尔至少显著差异(LSD)方法进行测试的意义差异负对照组和所有实验群体。所有通过使用SPSS分析软件(SPSS 19.0版,芝加哥,美国),和照片被使用GraphPad棱镜7软件生成(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。隔离和rGMSCs的识别

从鼠牙龈组织增长后,rGMSCs假定呈集群形态(图1(一))。茜素红、油红O和阿尔新蓝染色证明rGMSCs拥有分化成成骨细胞(图的能力1 (b)),脂肪细胞(图1 (c)),和软骨细胞(图1 (d))。同时,钙化沉积物形成于osteogenically诱导rGMSCs,脂滴发现rGMSCs脂肪形成的分化,细胞外粘多糖沉积在chondrogenic-induced rGMSCs。流式细胞术是rGMSCs用于分析表面标记。如图2rGMSCs显示,积极表达间充质干细胞标记STRO-1 CD73, CD90、CD105, CD14和CD146和消极的表情,CD34、CD45。

3.2。集落形成、扩散和迁移rGMSCs炎症/抗炎环境下

经过14天的孵化、集落形成效率在炎症组织和抗炎组抑制(数字3和4)。p . gingivalis有限合伙人显著抑制rGMSCs集落形成效率( )。这种抑制作用可以部分逆转与抗炎细胞因子IL-1ra coculturing之后。抗炎组显示集落形成剂量依赖性的方式的效率明显高于炎症组( )。但是,没有统计上的显著差异被发现之间的较低的抗炎组IL-1ra (10 ng / mL)和炎症组。所有组相比表现出减少水平的集落形成控制。

如图5,一个类似的趋势是由CCK-8试验中观察到的细胞生存能力。rGMSCs的OD值降低p . gingivalis有限合伙人的待遇,而他们用增加IL-1ra浓度逐渐提高。培养24小时后,发现类似的增殖率在5组。经过3天的治疗,只有高的抗炎组IL-1ra (10 ng / mL)显示高水平相比,炎症组( )。经过7天的培养,所有IL-1ra-treated rGMSCs表现显著增殖能力更强剂量依赖性的方式比rGMSCs炎症组( )。所有组相比表现出减少水平的细胞数量控制。

伤口愈合划痕试验(图6(一)),细胞迁移率在不同时间点图所示6 (b)。对于所有的时间间隔(24、48和72小时),伤口覆盖的百分比与IL-1ra rGMSCs治疗明显高于rGMSCsp . gingivalis有限合伙人治疗剂量依赖性的方式( )。在划痕试验72小时后,rGMSCs刺激与100 ng / mL或1μg / mL IL-1ra完全填充伤口面积。所有组表现出减少水平的细胞迁移速度在24和48小时相比,控制。

3.3。rGMSCs成骨的潜在的炎性环境/抗炎环境下

mRNA的表达成骨的标记包括高山,COL-I, OPN, OCN, RNX2通过rt - pcr(图7)。没有统计学差异只有1天的成骨诱导后不同的群体。OCN表达抗炎组和10 ng / mL IL-1ra没有显示统计的价格相比增加炎症组。其他osteogenic-related基因的mRNA表达明显增强浓度的方式在IL-1ra相比,炎症组( )。除了COL-I(7天)抗炎组与高IL-1ra (1μg / mL),其他组显示减少osteogenic-related基因的mRNA水平在7天,14天比控制。

对成骨分化取决于这些非凡的影响p . gingivalis有限合伙人和IL-1ra剂量进一步证实了高山和OCN蛋白质(图的测量8(一个))。与mRNA表达一致,这表明成骨诱导后7天,14天,高山和OCN大幅下调p . gingivalis-LPS-stimulated集团( )和显著增加剂量依赖性的方式与IL-1ra孵化后( )。

不同组中的所有rGMSCs似乎产生钙化结节沾ARS时间的方式(图8 (b))。然而,rGMSC矿化治疗似乎表达下调p . gingivalis有限合伙人的控制(相比 )。经过14、21和28天的培养,形成钙化结节受损p . gingivalis有限合伙人IL-1ra显著提高了以时间和剂量依赖性的方式( )。所有组表现出减少水平的钙化结节与控制。

3.4。激活的NF -κB信号通路在rGMSCs炎性环境/抗炎的环境在体外

调查是否NF -κB在rGMSCs通路被激活p . gingivalislps刺激,我们首先研究了NF - mRNA的表达κ我pathway-related基因κBα1、7、14天(图9(一个))。信使rna表达的地承认有限合伙人也评估。这两个我κBα当处理和显著地升高p . gingivalis有限合伙人和控制( )时间间隔。相反,rGMSCs孵化与IL-1ra明显减毒TLR4和我κBα以剂量依赖性的方式表达。

进一步确认的激活和抑制NF -κB通路,免疫印迹进行评估我的磷酸化κBα,我κBα、p65的磷酸化和p65(图9 (b))。我们的研究结果表明,我的磷酸化κBα和p65显著增加p . gingivalis-LPS-stimulated rGMSCs, IL-1ra抑制NF -的磷酸化κb - 65。提出了图9 (c)导出的比率κBα/我κBα和p-p65 / p65明显增强p . gingivalis-LPS-stimulated集团,它们随IL-1ra浓度增加而降低。这些发现表明IL-1ra演示的抑制剂p . gingivalis-LPS-induced TLR4 / NF -κB通路。

3.5。细胞因子释放炎性环境下rGMSCs /抗炎环境在体外

如图10,本研究确定关键细胞因子释放包括il - 1β肿瘤坏死因子-α,IL-1ra 12、24、48小时。il - 1β和肿瘤坏死因子-α后显著增加p . gingivalislps刺激和控制( ),而与IL-1ra预处理细胞因子抑制il - 1β和肿瘤坏死因子-α释放剂量依赖性的方式(数字10 ()和10 (b))。最重要的影响p . gingivalis有限合伙人和细胞因子释放IL-1ra培养24小时后显示。我们没有观察到不同群体之间的任何差异IL-1ra水平(图10 (c))。

4所示。讨论

最近,保护业务的成骨的能力在当地炎症条件引起了巨大的利益。本研究的结果表明,IL-1ra,作为抗炎细胞因子的负面影响抵消p . gingivalis -有限合伙人,保护业务的细胞生存能力和成骨的能力和调节炎症细胞因子的分泌。底层机制被发现是IL-1ra扰乱TLR-4-mediated NF -κB信号通路激活p . gingivalis有限合伙人的业务。

的微环境管理msc的再生作用。在这里,在我们的文章中,所有的证据表明相结合p . gingivalis有限合伙人受损集落形成,细胞增殖,迁移,rGMSCs和骨生成能力,从而导致有害的影响他们的组织和骨再生属性,而IL-1ra被认为发挥保护作用p . gingivalis有限合伙人通过逆转其负面影响。与预处理IL-1ra,业务的原始细胞炎性环境下的生存能力和成骨的能力可以保持时间和剂量依赖性的方式。符合我们的结果,目前的研究表明LPS抑制成骨分化和增殖能力在业务9]。也表明,会同IL-1ra-loaded哈水凝胶合成细胞外基质(HA-sECM),可以增强业务的再生能力在一个典型的牙周炎模型在小型猪13体外),这与我们的研究结果是一致的。

此外,我们强调了inflammatory-resistant IL-1ra的属性p . gingivalis-LPS-stimulated rGMSC炎症。我们的研究结果表明,p . gingivalis有限合伙人可以激活一个积极的反馈循环,TLR4-mediated NF -κB信号,证明了TLR4的增加和我κBα信使rna表达和飙升的磷酸化的我κBα/我κBα比和磷酸化P65 / P65比率。NF -κB信号通路是指出作为战略的球员在调节炎性反应。周et al。19)透露,通过NF -κB信号通路,p . gingivalis业务有限合伙人调节增殖潜力,这是符合我们的数据。

我们首次展示获救IL-1ra业务p . gingivalis通过阻断TLR4-mediated NF - -LPS-challenged环境κB通路。炎性细胞因子TNF -α和il - 1βLPS引起的下游TLR4-mediated NF -κB通路,这都是参与磷酸化NF -κB (20.]。在我们目前的研究中,炎症因子的上调合成TNF -α和il - 1β24小时后达到了顶峰p . gingivalislps刺激,而预处理IL-1ra upregulation部分消除。IL-1ra的衰减作用呈现剂量依赖性的方式,和最大的TNF -崩溃α和il - 1β发生在24小时。衰减影响炎症细胞因子的生产可能会给IL-1ra保护rGMSCs的生物属性和成骨能力。我们的结果表明,p . gingivalis有限合伙人不诱导IL-1ra的分泌。观察与数据发布的三泽et al。21),p . gingivalis总蛋白提取(PgPE -)治疗PDLSCs显著调节多种炎症标记和趋化因子的分泌,包括单核细胞chemoattractantprotein-1 1 (MCP),干扰素-γil - 6,引发,IL-1ra。各种类型的msc、刺激因素、时间和负载可能会对这些有争议的结果负部分责任。

然而,我们目前的研究也有一些局限性。例如,本研究只使用所选的病原体p . gingivalis有限合伙人模仿牙周炎细胞模型,它不同于复杂牙周病原体在体内生物膜状态。有多种方法来模拟牙周炎体外微环境。p . gingivalis(22,23和其他牙周病原体包括Tannerella连翘(t .连翘)[24),梅毒denticola(t . denticola)[24),而Aggregatibacter actinomycetemcomitans(答:actinomycetemcomitans)[22在一些研究中)与宿主细胞。类似于我们的工作,一些来自其他研究使用p . gingivalis或其他periodontopathogenic细菌与宿主细胞孵化描述炎症条件(25- - - - - -28]。除此之外,一些研究分析牙周局部组织来源于病人诊断为牙周炎(29日,30.]。因此,直到现在,牙周炎体外模型仍然是不一致的。我们的结果从炎症牙周细胞体外模型应采取谨慎当翻译一个体内模型。由于体内的微环境多样性牙周炎的背景下,进一步研究显然是需要确定IL-1ra可以减弱骨质流失,导致人类牙周炎病变组织再生。除此之外,本研究中使用的业务从老鼠而不是孤立的人类。msc从不同的物种可能自己的内在差异,导致不同的再生性能31日,32]。因此,仍有需要业务来自人类来测试我们的结论。

总之,基于目前的研究的成果,我们的研究结果进一步支持,rGMSC行为和成骨分化潜能受损p . gingivalis有限合伙人在IL-1ra治疗可以逆转。我们首次透露,底层机制可能IL-1ra TLR4-mediated NF -表达下调κB通路激活p . gingivalis有限合伙人。因此,我们的工作可能会提供一些有利的证据之前的研究和未来的临床前研究实践。

5。结论

目前,本研究强调在rGMSCs IL-1ra的保护作用p . gingivalis-LPS-challenged炎症状态。IL-1ra促进细胞增殖和迁移能力和增强成骨分化rGMSCs通过抑制TLR4过度和NF -磷酸化κB在p . gingivalislps刺激条件。随着浓度增加,IL-1ra救援rGMSCs从通过下调炎性细胞因子分泌障碍。总之,我们的研究指出一个积极的态度对IL-1ra将扩散和骨生成业务受到影响p . gingivalis有限合伙人。这项研究可能提供有价值的理论依据牙周再生和小说在牙周炎的治疗策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

作者的贡献

宇新赵进行了实验,分析数据,并起草了手稿。波波Cai参加了实验。Weijun朱镕基解释数据和数据准备的部分。王爵史和Yu导致了数据分析和解释。斯米斯本研究设计并监督和批判性思维修订手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81800934号,81801024,和81600838)和浙江省卫生部门(2017号ky449)。

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