kartogenin预处理的髌下脂肪垫间充质干细胞的外泌体增强软骨细胞合成代谢和关节软骨再生

摘要

客观的．评价kartogenin预处理的髌下脂肪垫间充质干细胞外泌体对体外软骨细胞和体内关节软骨再生的影响。方法．促进胰蛋白酶脂肪垫间充质干细胞（IPFP-MSCs）与兔子分离成收获外泌体。在鉴定间充质干细胞和外泌体之后，将兔软骨细胞分为三组进行进一步处理：EXO基团（用外来肌肉分离的软骨细胞，从替代侵入型脂肪垫间充质干细胞分离），KGN-EXO组（用Excapatellar分离的外泌体处理的软骨细胞脂肪垫间充质干细胞用kgn预处理）和对照组。加工和增殖后，测量软骨细胞的表型变化。在体内研究中，用KGN-EXO，EXO，IPFP-MSC和对照治疗4组带有关节软骨损伤的兔子。制定了宏观评估和组织学评价，以弄清楚4组在体内软骨再生的不同效果。结果。EXO或KGN-EXO组软骨细胞增殖率显著高于对照组( ）.qRT-PCR结果显示，与EXO组和对照组相比，KGN-EXO组中Sox-9、Aggrecan和Col II的表达量最高( ）.Western blot结果与qRT-PCR结果一致。在体内，KGN-EXO组软骨缺损的大体外观和组织学评分较IPFP-MSC组、EXO组和对照组( ）.在12周时，KGN-EXO组的缺陷部位几乎完全由平坦和光滑的表面进行修复，而透明的透明软骨状结构且没有观察到明显的裂缝。结论．我们的研究表明，从经KGN预处理的髌下脂肪垫间充质干细胞中分离的外泌体具有诱导干细胞成软骨分化的能力，有效促进软骨细胞的增殖和成软骨蛋白和基因的表达。KGN-EXO还能更有效地促进关节软骨缺损的修复，是一种很有潜力的治疗方法。

1.介绍

骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是骨科领域最常见的疾病之一。骨关节炎是一种慢性退行性关节疾病，通常引起疼痛和活动受限。此外，与OA相关的治疗费用较高[1］．骨性关节炎的特征是细胞外基质的丢失和关节软骨的破坏[2那3.］．与骨关节炎相关的危险因素有很多，包括遗传因素、女性性别、外伤史、年龄和肥胖[4.］．目前，全球约有2.37亿人患有OA [5.那6.］．OA的主要病理变化是关节软骨病变。促进关节软骨修复或再生是防止OA进步的关键。然而，通过目前临床方法，例如药物，物理治疗，关节镜，微折衷或软骨移植，是促进关节软骨再生或修复的全球挑战[7.那8.］．

在过去的几年中，组织工程和再生医学领域取得了显著的进展。这些形式的生物治疗可能代表了一种新的和有前景的方式，以帮助再生关节软骨。多项研究表明，关节软骨病变可通过生物干预有效再生体外或在活的有机体内，包括间充质干细胞（MSCs），生物生长因子或其他组织工程方法[9.那10］．特别是，通过基本和临床研究的组合证明，已经证明了MSCs在关节软骨病变中的病变的修复特别有前途。虽然这些以前的一些研究报告了令人兴奋的结果，但如果我们要将MSC应用于OA的早期阶段的患者，包括不一致的数据，自体MSC的质量差，有关的道德问题异种MSC和肿瘤的风险或感染的风险[11］．集体，这些问题对MSC的临床治疗普遍施加了显着的局限性和一致地应用OA的临床治疗。

最近，Murphy等人提出，使用MSCs修复受损组织的机制主要与其促进MSCs分化的能力无关，而是通过与这些细胞相关的旁分泌通路[12］．通过与靶细胞结合，通过邻羟碱途径分泌的细胞外囊泡通过与靶细胞结合释放各种细胞因子。这些细胞因子随后调节组织再生[13那14］．现有研究表明外来肌瘤是这些细胞外囊中最重要的形式。外泌体的直径为40至120nm，含有大量蛋白质，核酸，脂质和细胞分泌的其他组分。通过不同细胞类型分泌的外来组分的大差异差异，甚至在不同条件下的相同细胞类型[15那16］．一些研究发现，从细胞中提取的外泌体经特定方法预处理后具有更靶向的效果[17］．Kartogenin (KGN)是一种小分子化合物，由Johnson等人在超过22,000个杂环药物分子中发现[18］．在他们的研究中，KGN可以有效地促进MSCs的分化为软骨细胞。因此，探索KGN预处理的MSC的帕拉克曲线变化非常有意思。因此，在该研究中，用Kgn预处理衍生自捕获兔的丙涂液脂肪垫的MSC，并萃取它们的外来体以与MSCs-Exosomes进行比较而不治疗。主要目的是探讨两种外来体在促进软骨修复方面的作用体外和在活的有机体内．

2.方法和材料

2．1.道德声明

该研究的所有动物程序都是通过批准第二军医大学的伦理委员会，并遵守机构动物护理和使用委员会（IACUC），以后进行国际动物治疗准则。

２.２.MSCs和软骨细胞的制备

MSCs和软骨细胞取自新西兰大白兔(年龄小于6个月，体重在2 - 2.5 kg之间)。我们从每只兔子身上取出髌下脂肪垫和膝关节软骨块。接下来，我们切除血管和结缔组织，采用酶法分离髌下脂肪垫间充质干细胞(IPFP-MSCs)和软骨细胞，如前所述[19］．流式细胞术检测多种表面抗体(CD34、CD45、CD73、CD90和CD105);IgG1-PE作为阴性对照，以排除荧光素的潜在干扰。此外，将MSCs分为成骨、成脂、成软骨三个分化阶段进行培养，以确定其向不同方向分化的相对潜力。

２.３.西方墨点法

如前所述进行蛋白质印迹[20.］．简而言之，将PMSF-RIPA裂解缓冲液加入细胞中，并将所得裂解物以12,000rpm离心5分钟以允许收集上清液。通过BCA方法测量每种蛋白质的浓度，并调节浓度以通过SDS-PAGE分离。对于每个样本，我们加载了15 μL（50. μg) /。分离后，蛋白质转移到硝化纤维素膜上。然后用一抗(anti-CD9, CBL162, Sigma-Aldrich;anti-TSG101、SAB2702167 Sigma-Aldrich;anti-GAPDH、G8795 Sigma-Aldrich;anti-PPARγ，MAB3872，Sigma-Aldrich;抗COL2，CP18，Sigma-Aldrich;Anti-Runx2，AV36678，Sigma-Aldrich;抗SOX9，AV37986，Sigma-Aldrich;和抗蛋白，MABT83，Sigma-Aldrich）在1：1,000和副抗体为1：5,000（山羊抗兔（AB6721，ABCAM）或山羊抗小鼠（AB97023，ABCAM）辛辣酶 - （HRP-）共轭使用ChemIDOC TM XRS成像系统（Bio-Rad，China）可视化二次抗体和阳性结合。用imagej软件（国家健康机构，Bethesda，MD，USA）分析免疫反应频段。

２.４.实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)

按照制造商的说明，使用TRIzol (Invitrogen公司，中国上海)从细胞中提取总RNA。利用qScript cDNA SuperMix试剂(Quanta BioSciences, Beijing, China)对RNA进行反转录，并通过qRT-PCR和rt - pcr检测基因的相对表达量方法。引物序列如下:SOX9（5. -agcaagaacaagccccccgtc-3 那5.CCTGCCCATTCTTCACCGACT-3 ）;能（5. -CATCTGGAGTTCTTTTTGGGAG-3 那5. -CAGGTCAGGGATTCTGTGTGTC-3 ）;COL2A1（5. -GaAgacaccaAggactgcctg-3. 那5. -gcaccctttcgcctttgtca-3 ）;PPARγ（5. -tgcaggagcagagcaaagaag-3 那5. -GAGGCCAGCATGGTGTAGATG-3 ）;和Runx-2（5. -TGATGACACTGCCACCTGTG-3 那5. -ACTCTGGCTTTGGGAAGAGC-3 ）.每个实验一式三份重复。

2.5。外泌体的提取，鉴定和测量

从通过3的IPFP-MSCs选择并在两组中培养。一组通常培养，而另一组培养了5 μ将10 mmol/ l KGN加入5 ml培养基中作为预处理。培养72h后，提取上清液，置于−80℃保存。然后使用多轮离心提取外泌体(MSC-EXOs)。第一个细胞在300 g离心10分钟。收集上清液，2000 g离心10分钟。再次收集上清，10000 g离心30分钟。收集上清，100,000 g重离心70分钟。弃上清，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬;然后用100000克离心70分钟。最后弃上清，200重悬沉淀μl PBS，−80°C保存。分析,10μ然后将外泌体溶液的L加入铜网中，用电子显微镜检查。然后我们使用Western blotting检测CD9和TSG101在提取的外泌体表面的表达。然后使用NanoSight NS300系统(Malvern Panalytical, Malvern, UK)确定提取的外泌体的大小分布。

2.6。外泌体对细胞增殖的影响

接下来，我们选择了软骨细胞，显示出良好的增长率3，并将这些分为三组。exo组中的软骨细胞被治疗 IPFP-MSCs。对KGN-EXO组软骨细胞进行处理 IPFP-MSC外泌体和KGN作为预处理。最后，对照组软骨细胞以PBS作为空白对照组。随后用CCK-8试剂检测各组细胞增殖情况，连续7天。

2.7。外泌体对软骨细胞表型的影响

选取第3代软骨细胞，按上述方法分为相同的3组，在37℃下培养14天。然后从三组中分别收集软骨细胞。然后测定了Sox-9、Aggrecan、Col-II、PPAR的相对表达量γ和runx-2，通过蛋白质印迹和QRT-PCR。

2.8。建立兔关节软骨损伤模型

在体内研究中使用了四十八个健康的新西兰白兔（5-6岁，介于2和2.5千克之间）。所有动物始终均疗养治疗，所有实验程序都被道德委员会批准，并严格按照管理动物实验的道德规划进行。为了一致性，选择右膝部作为实验手术部位，以创造膝关节软骨损伤的兔模型。48只兔子随机分为4组。对照组接受关节内注射0.5mL PBS，IPFP-MSC组接受了含有关节内注射的细胞悬浮液 IPFP-MSCs, EXO组关节内注射含 KGN-EXO组关节内注射含悬浮液 kgn-exos。膝关节软骨损伤的兔模型是如下创建的。首先，通过将戊巴比妥钠注入耳静脉来麻醉所有兔子。然后，缓慢施用青霉素以防止感染。然后将兔子置于仰卧位，使用内侧帕拉特犬方法来打开关节胶囊。然后髌骨横向拉动以暴露股骨Trochlea。然后使用无菌电钻将软骨缺陷（直径为4mm和1.5mm的深度）钻入股骨龙骨的中心。此后，每天注射青霉素钠，以预防手术后前3天的感染。在此期间，兔子没有受到限制，并且被允许活跃。在手术后4和12周处处死来自每组的六只实验动物进行分析。

2.9。宏观评价

通过静脉注射戊巴比妥钠钠而牺牲了兔子。然后暴露并收获手术部位。然后按照国际软骨修复社会（ICRS）评分系统以盲化方式拍摄和评估软骨缺陷网站（表1）.评分由三名调查员独立进行。

2.10。组织学评价

将标本固定在4％多聚甲醛中36小时，然后在室温下用20％EDTA溶液脱钙4-6周。然后每2周通过针刺测量样品，直到针可以容易地插入骨组织中，从而表明脱钙完成。然后将样品用梯度系列的醇脱水，嵌入在石蜡中，并切断以产生4个组织学部分 μ米厚。切片用HE和藏红花素O/Fast Green染色。为了获得一致和客观的结果，然后使用修改的O’driscoll组织学评分评估切片2)[21］．

结果

3．1.表征IPFP-MSCs

使用上述方法提取伯型IPFP-MSCs，并每天通过显微镜评估。24小时后，我们观察到少量的粘附细胞生长。2周后，细胞已达到80％汇合。然后将细胞以1：3的比例传代;这使得MSC在亚栽培后迅速增殖，显示出梭形成纤维细胞状外观（图1（a））.由于多次传代后细胞衰老，我们选择第3代(P3)细胞进行实验。流式细胞术结果显示，99%的细胞表达CD73、CD90、CD105， <1%的细胞表达CD34、CD45(图)1（b））.这些结果表明，提取的MSCs与先前的出版标准一致[22］．成骨诱导培养4周后进行三系分化实验，茜素红染色。显微镜观察可见散在的钙结节和钙化基质。成脂诱导培养4周后，进行油红O染色;这表明脂滴已经形成并融合成一片薄片。软骨诱导培养4周后，观察软骨颗粒的形成。阿利新蓝染色后，我们可以看到细胞周围的软骨基质和大量的粘多糖(图)1（c））.总的来说，这些结果表明，提取的细胞表达了特异于MSC的表面蛋白质，并以多种方式表现出潜力。因此，证明这些细胞是衍生自IPFP（IPFP-MSCs）的MSC。

３．２．表征MSC-EXOs

外泌体通过收集和超离心MSCs培养过程中收集的上清分离。透射电镜显示这些外泌体呈扁平圆盘状，具有双面凹面结构。这些细胞的直径为40-120 nm2（a）），因此同时具有外来的预期形状特征。蛋白质印迹表明，这些外泌体对于外侧细胞组表面蛋白CD9和TSG101是阳性的阳性（图2（b））.NTA进一步表明，沉淀物内颗粒的尺寸主要为40-100 nm(图)2（c））.这些结果表明，我们分离的外泌体具有外泌体的特征，可用于后续实验。

3.3。外泌体促进了软骨细胞的增殖

CCK-8检测显示，与对照组相比，Exo组和KGN-Exo组软骨细胞增殖明显增加。KGN-EXO组与对照组比较差异有统计学意义( ）EXO组和对照组之间也是如此。KGN-EXO组与EXO组无统计学差异( ）（数字3.）.这些结果表明，无论KGN预处理与否，外泌体均可促进软骨细胞增殖。

3．4．外泌体诱导软骨细胞表型改变在体外

为了验证外泌体是否能影响与软骨相关的细胞内蛋白和基因的表达，我们进行了几项研究体外实验。Western印迹表明，与对照组相比，在用EXO和KGN-EXO治疗后，SOX-9，Excrecan和Col II的表达水平显着增加。此外，KGN-EXO治疗比单独的EXO治疗更有效（ 那数字4.）.qRT-PCR显示SOX-9.那Aggrecan， 和坳二世KGN-EXO和EXO治疗后显著升高(图5.）.对于所有三个基因，KGN-EXO组与对照组之间存在统计学差异( ）KGN-EXO组与EXO组的统计学差异( ）.虽然与对照组相比，EXO组3个基因的表达水平均有所提高，但两组间无统计学差异( ）.qRT-PCR检测未发现差异有统计学意义PPARγ和Runx-2与三组相比。Western Blotting还表明PPAR的表达水平γ和runx-2蛋白在三组上相似。总的来说，这些结果表明，KGN-EXO和EXO没有改善与成骨或脂肪发生相关的基因或蛋白质的表达。

3.5。宏观和组织学评估

术后4周，对照组和IPFP-MSC组几乎没有修复组织;与周围正常软骨组织边界明显。缺损区域极不均匀，未形成新的软骨。EXO组缺损区形成少量软骨样结构;这与周围的正常关节软骨组织形成了连接，并向中心聚集。KGN-EXO组形成较多软骨组织;表面相对平坦，与周围正常关节软骨连接良好，显示良好的修复水平(图)6(一)）.H&E染色显示，对照组和IPFP-MSC组几乎未形成软骨样结构。EXO组缺损部位底部仅形成少量软骨样组织;再生组织的厚度小于周围正常软骨的50%。KGN-EXO组形成透明软骨;再生组织厚度明显大于其他三组。S&F染色显示，只有KGN-EXO组再生组织中Safranin O染色较强、阳性、均匀，说明KGN-EXO组再生组织中蛋白多糖含量与正常软骨相似(图)6(一)）.

术后12周，对照组软骨组织几乎无再生，缺损区域明显。表面不均匀，与周围正常关节软骨组织融合程度较差。IPFP-MSC组缺损区域主要充满纤维结缔组织;缺损边缘有少量软骨组织形成，表面不平整。修复后的组织部分与周围正常关节软骨组织相连。在EXO组中，缺损区域被大面积再生的软骨样组织所填充。缺损部位被修补组织中明显的小裂纹所填满。再生组织表面相对平坦，修复组织与周围正常关节软骨融合，但边界仍然明显。KGN-EXO组缺损部位表面光滑平整，几乎被再生软骨组织覆盖。修复组织极少有明显裂纹，与周围正常软骨结合良好; it was difficult to determine the boundary (Figure6 (b)）.KGN-EXO集团的ICRS分数（ ）明显高于其他三组的那些（ ;数字6 (c)）.EXO组的ICRS评分( ）显着高于对照组（ ）和IPFP-MSC组（ ）（ ）.IPFP-MSC组的ICRS分数高于对照组的分数，尽管差异没有统计学意义（ ）.这些结果表明，KGN-EXO治疗具有最强的修复软骨缺陷的能力在活的有机体内明显优于其他三组H&E染色显示对照组有少量非软骨样组织形成。修复后的组织中只有极少量的透明软骨结构，Safranin O染色无显著阳性。再生组织中可见大量裂纹，与周围正常软骨结合不佳。在IPFP-MSC组，我们观察到中度组织再生;再生不均匀，透明软骨结构较KGN-EXO组薄;组织中有许多明显的裂缝。番红花素O染色少，未与周围正常软骨完全结合。EXO组外植体组织再生明显增多;缺损面积的70%以上得到了填充。 Hyaline cartilage tissue was visible inside the defect area and there were few cracks. Safranin O staining was very prominent, indicating that this tissue contained a significant proportion of proteoglycans. The regenerated tissue was well integrated with the surrounding normal cartilage, and a clear boundary was evident. In the KGN-EXO group, the defect site had been almost completely repaired; the surface was flat and smooth. We also observed a notable proportion of hyaline cartilage-like tissue with no obvious cracks. Safranin O staining showed uniform and strong positive staining, suggesting that this tissue contained a large proportion of proteoglycans. Furthermore, the repaired tissue was fully integrated with surrounding normal cartilage and it was difficult to visualize the boundaries. Histological scoring (Figure6 (c)术后12周，KGN-EXO组( ）显著高于其他三组( ）.EXO组的组织学评分( ）也明显高于对照组( ）和IPFP-MSC组（ ）（ ）.IPFP-MSC组的得分高于对照组，但这并不统计学意义（ ）.综上所述，经KGN预处理的IPFP-MSCs衍生的外泌体具有很强的促进软骨缺损修复的能力体内。

4.讨论

在本研究中，我们使用KGN预处理IPFP-MSCs，然后通过超离心法从MSCs上清中成功分离出外泌体。然后，我们通过透射电镜、表面蛋白鉴定和NTA分析评估了分离的外泌体的特征。体外实验表明，间充质干细胞衍生的外泌体能显著促进软骨细胞增殖，但KGN预处理方法不能额外增加间充质干细胞外泌体促进增殖的能力。与未经KGN预处理的外泌体相比，经KGN预处理的MSC外泌体能显著促进软骨相关蛋白和基因的表达。在在活的有机体内结果显示，KGN-EXO治疗组软骨修复效果较好，缺损部位出现大量透明软骨样组织再生。修复组织表面光滑平整，与周围正常软骨结合良好。未见明显边界，Safranin O染色较强，呈阳性。宏观评价和组织学评分也证明，在我们的兔模型中，KGN-EXO组修复软骨缺损的整体效果最好。

MSCs通常用于关节软骨中的病变再生。实际上，来自基础科学和临床研究的结果报道了使用这种技术的有希望的结果[23］．早期研究中最常用的MSCs有骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)、脂肪源干细胞(AD-MSCs)、滑膜间充质干细胞(SMSCs)和脐带间充质干细胞(UC-MSCs)。髌下脂肪垫是一种位于膝盖内髌骨下方和后方的脂肪，传统上被认为是关节内缓冲力的缓冲垫。然而，越来越多的证据表明，间充质干细胞可以从髌下脂肪垫中提取，并且比其他形式的间充质干细胞表现出更好的成软骨能力[24］．Koh和Choi是第一个使用替代替代脂肪垫衍生的间充质干细胞疗法治疗膝关节骨关节炎;在短期内，这项研究的结果令人鼓舞并证明了IPFP-MSCs的注射是安全的，可以减轻疼痛，改善膝关节功能[25］．在另一项研究中，Dragoo和Chang利用关节镜技术获取了IPFP，并成功分离了脂肪来源的MSCs，使得IPFP-MSCs在临床上的应用更加容易。Neri等人随后使用体外实验证明，来自OA患者的IPFP-MSCs仍然符合MSCs的标准，适合且安全的软骨再生[26］．起初，人们认为细胞替代疗法将是应用MSCs修复软骨病变的最佳方案。这个概念是基于这些细胞进行软骨分化和分泌PGs和胶原II的能力，这是组织的基本成分[12那27］．它还表明MSCs具有免疫调节性质，可能有助于降低软骨丧失[28］．然而，最近的研究表明，在关节内移植MSC的情况下，修复组织的主要来源来自内源细胞，因此暗示旁静脉效应可能主要负责MSC诱导软骨再生的方式[27那29］．

MSCs的旁分泌作用主要包括可溶性因子和细胞外囊泡。特别是，MSCs释放的外泌体已被证明影响软骨再生[13那30.那31］．鉴于仍有许多与使用MSCS在诊所使用的局限性，以治疗软骨病变，例如道德问题和政策限制，我们继续寻求无细胞待遇以促进软骨修复，这是非常必要和重要的可以更容易转化为临床应用[11］．因此，外泌体是一种很有前途的基于msc的无细胞诱导软骨再生的方法。在之前的研究中，Wang等报道UC-MSCs分泌因子可以调节MSCs的分化[32］．在后续纸上，黄等人。提出衍生自MSCs的外泌体可以代表一种基于细胞的组织工程战略形式的软骨修复的替代治疗方法[33］．Zhang等人随后证实，来自ESCs的外泌体可以促进骨软骨再生[30.[Cosenza等人。表明来自BM-MSCs的外来肌肉可以保护软骨和骨免于OA的降解[34］．Tao等人随后的一项研究发现，smsc的外泌体具有显著的防止OA进展的潜力，而miR-140-5p在smsc中过表达可显著增强这项技术的有效性[35］．在另一篇论文中，Wu等认为富含mir -100-5p的IPFP-MSC-EXOs可以通过抑制OA中的mTOR来保护关节软骨[36］．Qi等人。事实证明，BMSCs的外虫剂可以通过P38，ERK和AKT途径抑制细胞内功能障碍诱导的软骨细胞中的细胞凋亡[37］．因此，许多研究已经证明了MSC-EXOS用于软骨修复和防止OA的优点。然而，外泌体的组分和功能对于变异性非常敏感，并且当在不同条件下从不同的细胞类型或相同的细胞类型中提取时可以不同[13那29］．这种不一致使得难以考虑以前研究产生的结果，而且还使我们有机会预处理原始细胞以增强外来肌肉的后续功能。例如，Kato等人。二手IL-1刺激滑膜成纤维细胞，发现从IL-1刺激的滑膜成纤维细胞中分离的外泌体可以诱导特性软骨细胞的更加骨性接伤变化，而不是没有IL-1刺激的骨质细胞，因此证明外泌体的功能可以通过预处理来调节外来的功能[38］．KGN是一种小的杂环化合物，其表现出诱导MSCs分化为软骨细胞的强能力[18那39］．在本研究中，我们使用kgn预处理的IPFP-MSCs来研究这种作用是否影响外泌体诱导软骨细胞分化的能力。我们发现IPFP-MSCs的外泌体可以显著促进软骨细胞的增殖，与之前的报道一致[40］．IPFP-MSCs是否经KGN预处理均无明显变化。我们还发现，IPFP-MSCs衍生的外泌体可以通过增加SOX-9、Aggrecan和COL-2的表达以及减少MMPs的表达来增强软骨细胞的合成代谢作用，并降低分解代谢作用，这也与之前的研究一致[34那40那41］．此外，与未经预处理的IPFP-MSCs衍生的外泌体相比，kgn预处理的IPFP-MSCs衍生的外泌体可以显著增强合成代谢效应，降低分解代谢效应。这表明kgn预处理的间充质干细胞衍生的外泌体可能更有利于软骨修复。我们还执行在活的有机体内实验进一步验证我们的假设。

本研究存在一些需要考虑的局限性。我们观察到KGN预处理可以增强MSC-EXO对软骨再生的功能，但我们无法阐明这种作用的具体机制。需要进一步的研究来确定这种机制。以往的研究结果表明，microRNA的变化可能是最可能的机制[35那36那42］．此外，我们不需要载体直接注入MSC-EXO。未来的研究需要确定一种可靠的EXO载体，以促进其持续释放，尽管外泌体可能是一种很有前途的无细胞疗法，在临床实践中使用，没有许多政策限制，如细胞治疗。然而，外泌体相关研究仍主要停留在实验室。在外泌体的安全性和有效性在临床试验中得到验证之前，不应在临床实践中使用。此外，外泌体治疗的成本甚至超过了细胞治疗的成本，这可能是外泌体方法应用于临床实践的潜在限制。

结论

我们的研究首次证明了从促进替代型脂肪垫间充质干细胞中分离的外来体可以用KGN预处理，以诱导更强的软骨形成能力。这些外来体有效地促进了软骨细胞中有软骨菌蛋白质和基因的增殖和表达。这些外来物也能够以非常有效的方式促进关节软骨缺陷的修复。我们提出这些外来体可以在未来用作潜在的治疗方法。

数据可用性

所有数据均由通讯作者YZ (drzhouyiqin@163.com当请求)。

的利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

邵家华、朱军、陈毅等对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

我们真诚地感谢EditSprings (http://www.editsprings.com)，感谢您对这份手稿的英文润色。国家自然科学基金项目(no . 81972087);国家重点研发计划项目(no . 2017YFC1103404)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性

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