本研究的所有动物程序进行批准的第二军医大学伦理委员会和符合机构的动物保健和使用委员会(IACUC),动物治疗遵循国际准则。

msc和软骨细胞是来自新西兰白兔(年龄小于6个月,重2公斤,2.5公斤)。从每一个兔子,我们删除了infrapatellar脂肪垫和膝关节软骨块。接下来,我们删除了血管和结缔组织和酶的使用方法来隔离infrapatellar脂肪垫间充质干细胞(IPFP-MSCs)和软骨细胞,如前所述[ 19]。msc被进行流式细胞术检测各种表面抗体(CD34、CD45 CD73, CD90、和CD105);IgG1-PE被用作荧光素负控制排除潜在的干涉。此外,msc分化培养的三个阶段:成骨、脂肪形成的,和chondrogenic阶段,以确定它们的相对潜在的区分在不同的方向。

西方墨点法进行了如前所述[ 20.]。总之,PMSF-RIPA裂解缓冲被加入到细胞和合成溶解产物在12000转离心5分钟允许上层清液的收集。每个蛋白质的浓度由BCA法和测量浓度调整通过sds - page分离。对于每个样本,我们装载15 μl (50 μg) /。分离后,蛋白质都被转移到硝酸纤维素。膜被孵化与初级抗体(anti-CD9、CBL162 Sigma-Aldrich;anti-TSG101、SAB2702167 Sigma-Aldrich;anti-GAPDH、G8795 Sigma-Aldrich;anti-PPAR γ、MAB3872 Sigma-Aldrich;anti-Col2、CP18 Sigma-Aldrich;anti-Runx2、AV36678 Sigma-Aldrich;anti-Sox9、AV37986 Sigma-Aldrich;,MABT83 anti-Aggrecan Sigma-Aldrich) 1: 1000和二次抗体1:5000(山羊anti-rabbit (ab6721 Abcam)或山羊anti-mouse (ab97023 Abcam)辣根过氧化物酶-(合)共轭二次抗体),和积极的绑定是可视化使用ChemiDoc™XRS成像系统(Bio-Rad,北京)。分析了免疫反应性的乐队与ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

从细胞总RNA提取使用试剂盒(英杰公司、上海、中国),按照制造商的指示。RNA被反向转录使用qScript cDNA SuperMix试剂(量子生物科学,北京),和相对基因表达是由存在和决定 2 − Δ Δ CT 方法。引物序列如下: SOX9(5 ′ -AGCAAGAACAAGCCCCACGTC-3 ′ ,5 ′ CCTGCCCATTCTTCACCGACT-3 ′ ); 能(5 ′ -CATCTGGAGTTCTTTTTGGGAG-3 ′ ,5 ′ -CAGGTCAGGGATTCTGTGTGTC-3 ′ ); COL2A1(5 ′ -GAAGACACCAAGGACTGCCTG-3 ′ ,5 ′ -GCACCCTTTTCGCCTTTGTCA-3 ′ ); PPARγ(5 ′ -TGCAGGAGCAGAGCAAAGAAG-3 ′ ,5 ′ -GAGGCCAGCATGGTGTAGATG-3 ′ );和 Runx-2(5 ′ -TGATGACACTGCCACCTGTG-3 ′ ,5 ′ -ACTCTGGCTTTGGGAAGAGC-3 ′ )。每个实验重复一式三份。

IPFP-MSCs从3通道选择和培养两组。一组正常培养的,而另一组是培养5 μl 10更易与l KGN 5毫升的媒介作为预处理。72小时的文化后,上层清液提取并存储在−80°C。液(MSC-EXOs)然后使用多次离心提取。第一次在300 g细胞离心10分钟。上层清液然后收集和离心机在2000克10分钟。上层清液的收集和离心机在10000 g 30分钟。收集上清液,然后recentrifuged 100000 g 70分钟。上层清液被丢弃,颗粒与磷酸盐resuspended (PBS);这是然后在100000克70分钟离心机。最后,上层清液被丢弃,沉淀于200年resuspended μl PBS和存储−80°C。分析,10 μl的外来体的解决方案是添加到铜网和电子显微镜检查。然后,我们用西方墨点法确定CD9的表达和TSG101表面的提取液。然后提取液的粒径分布是决定使用NanoSight NS300系统(英国莫尔文莫尔文Panalytical)。

接下来,我们选择软骨细胞表现出良好的增长率从通道3和将这些分成三组。挂式组软骨细胞治疗 1 × 10 8 IPFP-MSCs。KGN-EXO组软骨细胞治疗 1 × 10 8 IPFP-MSC液和KGN作为预处理。最后,软骨细胞与PBS对照组治疗作为一个空白的控制。CCK-8试剂随后被用来检测细胞增殖在每组连续7天。

软骨细胞从通道3选择同样分为三组如上所述,在37°C的温度培养14天。软骨细胞被收集到的每个三组。然后我们决定Sox-9的相对表达水平,Aggrecan, Col-II, PPAR γRunx-2,通过免疫印迹和存在。

48健康新西兰白兔(年龄在5 - 6个月,体重2 - 2.5公斤)被用于体内研究。小心所有的动物治疗,和所有实验程序经伦理委员会批准,严格按照伦理规则进行动物实验。一致性,右膝被选为实验手术部位,以创建一个兔膝关节软骨损伤的模型。48兔子随机被分成4组。对照组收到0.5毫升PBS的关节内注射,IPFP-MSC组内注入的细胞悬液包含 1 × 10 7 挂式集团IPFP-MSCs收到悬挂含有的关节内注射 1 × 10 10 挂式,KGN-EXO组悬挂含有的关节内注射 1 × 10 10 KGN-Exos。膝关节软骨损伤的兔子模型创建如下。首先,所有的兔子耳朵被慢慢注入戊巴比妥钠麻醉静脉。然后,青霉素被慢慢地管理,以防止感染。兔子被放置在仰卧位和内侧parapatellar方法被用来打开关节囊。髌骨是把横向暴露股骨滑车。软骨缺陷深度(直径4毫米和1.5毫米)然后钻入股骨滑车的中心使用的电钻。此后,青霉素钠注射每日到臀大肌手术后预防感染的3天。在这段时间里,兔子没有限制,可以是活动的。6从每组实验动物牺牲4和12周手术后进行分析。

兔子被静脉注射戊巴比妥钠的牺牲。手术部位暴露和收获。软骨缺损网站被蒙蔽的方式拍摄和评估按照国际软骨修复协会(icr)评分系统(表 1)。得分是由三个独立调查。

36小时标本在4%多聚甲醛固定,然后用20% EDTA脱钙溶液在室温下4 - 6周。样本然后用针冲压每2周,直到针可以很容易地插入到骨组织,从而表明脱钙作用完成。样本然后用一系列梯度酒精脱水,石蜡嵌入式,分段建立组织学4部分 μ米厚。部分被沾染了他和红色染料O /快速绿色。为了达到一致的和客观的结果,部分被评估使用修改后的奥德利组织学评分(表 2)[ 21]。

主要IPFP-MSCs提取使用上面描述的方法和评估之后每天显微镜。24小时后,我们观察到少量的贴壁细胞的增长。2周后,细胞confluency已经达到80%。细胞被通过的比率1:3;这使得msc增殖迅速亚文化后,显示梭状呈外观(图 1(一))。自细胞老化后多个段落,我们选择细胞通道3 (P3)实验。流式细胞术结果显示,99%的细胞表达CD73, CD90、和CD105,而< 1%的细胞表达CD34、CD45(图 1 (b))。这些结果表明,提取的msc与先前的出版标准是一致的( 22]。三系分化实验然后进行茜素红染色进行成骨诱导培养后4周。显微观察发现散落的存在钙结节和钙化的矩阵。经过4周的脂肪形成的诱导文化,油红O染色进行;这表明,脂滴形成和融合成一片。4周后cartilage-induced文化,我们观察软骨的形成颗粒。阿尔新蓝染色后,我们能够想象周围的软骨基质细胞和大量的粘多糖(图 1 (c))。总的来说,这些结果表明,提取的细胞表面蛋白表达,特定于msc和表现出的潜力以多种方式来区分。因此,这些细胞被证明是msc源自IPFP (IPFP-MSCs)。

液被收集和超离心机分离msc的上层清液收集在文化。透射电子显微镜显示,这些液持平和盘形双面凹结构。这些细胞的直径是40 - 120纳米(图 2(一个)),因此液的并存与预期的形状特征。免疫印迹显示这些液阳性exosome-specific表面蛋白CD9和TSG101(图 2 (b))。NTA进一步表明,粒子的大小在沉淀主要是直径40 - 100纳米(图 2 (c))。这些结果表明,液我们孤立表现出液的特点,可用于后续实验。

CCK-8化验表明,软骨细胞的增殖挂式组和KGN-Exo组与对照组相比显著增加。有统计差异KGN-EXO组和对照组( P < 0.01 )和外挂式组和对照组之间也。没有统计学差异KGN-EXO组和挂式集团( P > 0.05 )(图 3)。这些结果表明,液增强软骨细胞的增殖有或没有KGN预处理。

为了验证液是否会影响胞内蛋白和基因的表达与软骨,我们进行了数次 在体外实验。免疫印迹显示Sox-9的表达水平,Aggrecan,坳二世显著增加治疗后挂式和KGN-EXO与对照组相比。此外,KGN-EXO单独治疗比房屋更有效治疗( P < 0.05 ,图 4)。存在显示的表达水平 Sox-9, Aggrecan, 坳二世在治疗后显著增加KGN-EXO和挂式(图 5)。为所有三个基因,有统计差异KGN-EXO组和对照组( P < 0.05 )和统计差异KGN-EXO组和挂式集团( P < 0.05 )。虽然三个基因的表达水平增加挂式组与对照组相比,两组之间没有统计学差异( P > 0.05 )。存在发现的基因表达无显著差异 PPARγ和 Runx-2在三组相比。西方墨点法还显示,PPAR的表达水平 γ三组和Runx-2蛋白质相似。总的来说,这些结果表明,KGN-EXO和挂式没有改善骨相关基因或蛋白质的表达或脂肪形成。

手术后4周,几乎没有修复组织对照组或IPFP-MSC组;边界与周围正常软骨组织是显而易见的。缺陷面积非常不均匀,没有新的软骨已经形成。少数cartilage-like结构形成的缺陷区域挂式组;这形成了一个连接与周围正常关节软骨组织,向中心聚集。更多的软骨组织成立了KGN-EXO组;表面是相对平坦,与周围正常关节软骨因此表现出良好的修复水平(图 6(一))。)染色表明,几乎没有cartilage-like结构形成了对照组和IPFP-MSC组。只有少量的cartilage-like组织成立了底部的缺陷网站挂式组;再生组织的厚度小于50%比正常软骨周围的区域。透明软骨形成KGN-EXO组;再生组织的厚度明显大于其他三组。S&F染色显示,只有再生组织KGN-EXO组显示强,积极,和统一的红色染料染色,从而表明蛋白多糖含量的再生组织KGN-EXO组与正常软骨相似(图 6(一))。

12周后手术,对照组显示几乎没有再生的软骨组织和缺陷区域是显而易见的。表面是不均匀的低水平的集成与周围的正常关节软骨组织。IPFP-MSC组主要缺陷区域充满纤维结缔组织;少量的软骨组织形成的边缘缺陷,表面凹凸不平。修复组织部分与周围正常关节软骨组织。挂式组,缺陷面积是由大面积的再生cartilage-like组织。缺陷的网站已经充满了小裂缝明显修复组织。这个再生组织是相对平坦的表面和修复组织与周围正常的关节软骨,集成尽管边界仍然明显。表面的缺陷网站KGN-EXO组光滑平坦,几乎覆盖了再生软骨组织。很少有明显的裂缝修复组织,显示良好的集成与周围正常软骨; it was difficult to determine the boundary (Figure 6 (b))。的icr分数KGN-EXO集团( 9.94 ± 0.87 )显著高于其它三组( P < 0.01 ;图 6 (c))。挂式的icr分数组( 6.56 ± 1.10 )明显高于对照组( 1.33 ± 0.84 )和IPFP-MSC集团( 3.00 ± 0.69 )( P < 0.01 )。的icr分数IPFP-MSC组高于对照组,但差异无统计学意义( P > 0.05 )。这些结果表明,KGN-EXO修复软骨缺损治疗最强的能力 在活的有机体内和明显比其他三组。)染色显示,少量的nonchondroid组织成立了对照组。只有很少量的透明软骨结构修复组织和红色染料O染色没有明显积极的。大量的裂缝观察再生组织显示可怜的集成与周围正常的软骨。IPFP-MSC组中,我们观察到温和的组织再生;再生发生不均匀的透明软骨结构薄比KGN-EXO组;在这个组织中许多裂缝明显。番红精O染色还小的时候并没有完全结合周围正常的软骨。更多的外植体组织再生是挂式组明显;缺陷超过70%的面积被填满。 Hyaline cartilage tissue was visible inside the defect area and there were few cracks. Safranin O staining was very prominent, indicating that this tissue contained a significant proportion of proteoglycans. The regenerated tissue was well integrated with the surrounding normal cartilage, and a clear boundary was evident. In the KGN-EXO group, the defect site had been almost completely repaired; the surface was flat and smooth. We also observed a notable proportion of hyaline cartilage-like tissue with no obvious cracks. Safranin O staining showed uniform and strong positive staining, suggesting that this tissue contained a large proportion of proteoglycans. Furthermore, the repaired tissue was fully integrated with surrounding normal cartilage and it was difficult to visualize the boundaries. Histological scoring (Figure 6 (c))在手术后12周的组织学评分显示KGN-EXO集团( 20.56 ± 1.91 )明显高于其他3组( P < 0.01 )。挂式的组织学得分集团( 15.44 ± 1.79 )也显著高于对照组( 3.94 ± 1.43 )和IPFP-MSC集团( 6.89 ± 1.49 )( P < 0.01 )。的分数IPFP-MSC组高于对照组,但这不是统计学意义( P > 0.05 )。总的来说,这些结果表明,液源自IPFP-MSCs已经使用KGN拥有强大的促进软骨缺损的修复能力 体内。