缓解衰老差别Metformin-Induced MicroRNA-34a-3p对这些在人牙髓干细胞通过针对CAB39 AMPK / mTOR信号通路

文摘

牙髓干细胞(DPSCs)是理想的种子细胞再生的牙科组织。然而,DPSC衰老限制了其临床应用。二甲双胍(遇到),2型糖尿病的常见处方药,被认为是影响衰老过程。本研究旨在确定二甲双胍在DPSC衰老的影响。年轻和衰老DPSCs从新鲜人的牙齿中提取分离得到。流式细胞术证实DPSCs特征表面抗原表达间充质干细胞(msc)的标志。细胞计数Kit-8 (CCK-8)分析表明,100年的浓度μM二甲双胍生产的最高增加DPSCs扩散。二甲双胍抑制衰老在DPSCs senescence-associated就证明了这一点β牛乳糖(SA -β加)染色和senescence-associated蛋白质的表达水平。此外,二甲双胍显著抑制microRNA-34a-3p (miR-34a-3p)表达式,39 (CAB39)高钙结合蛋白表达,并激活活化蛋白激酶(AMPK) /哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)信号通路。Dual-luciferase记者化验证实CAB39 miR-34a-3p的直接目标。此外,转染miR-34a-3p模仿提升DPSCs的衰老,而二甲双胍治疗或Lenti-CAB39转染抑制细胞衰老。总之,这些结果表明,二甲双胍可以缓解衰老的DPSCs下调miR-34a-3p和移植CAB39通过AMPK / mTOR信号通路。本研究阐明了二甲双胍在DPSC衰老的抑制作用及其潜在治疗作为衰老的治疗目标。

1。介绍

干细胞用于修复受伤的组织,因为他们的自我更新,多功能分化,和旁分泌信号属性。干细胞来源于牙齿组织,如牙髓、牙胚,顶端的乳头,和牙周韧带,数量丰富和方便。他们被认为是有吸引力的候选人组织工程和再生医学1]。牙髓干细胞(DPSCs)是第一个人类牙间充质干细胞(msc)分离出髓组织(2]。这些细胞可以接受chondrogenic、成骨的脂肪形成的,神经源性,牙原性的分化3因此,),可以用于牙髓血管再生组织再生治疗,牙本质的形成,和牙周再生4]。

衰老被认为是一个不可避免的和不可逆转的状态,特征是特定的细胞形态学的变化,功能和基因表达(5),导致增加与年龄相关的疾病的发生。随着年龄的增加,数量,再生能力,生物活性,抗氧化应激的干细胞减少(6- - - - - -8]。有研究报道,衰老抑制DPSCs[的增殖能力和分化潜能9]。例如,衰老影响DPSCs影响矿化过程的能力和减少人类DPSCs岁的成骨的潜力10]。这表明DPSC衰老可能会产生消极的负面影响他们在细胞疗法的临床应用。因此,深入了解DPSC衰老的分子机制及其潜在的作为药物设计的目标是抑制衰老的一个重要研究方向。

二甲双胍(遇到),2型糖尿病的一线处方药,已被证明影响衰老过程(11]。临床前研究表明,二甲双胍prolongevity展出和健康span-extending属性秀丽隐杆线虫、老鼠和人类细胞系(12- - - - - -15]。二甲双胍也减少了人类衰老相关疾病的发病率(16),因此,被建议作为一个候选药物减缓衰老在人类17]。从力学上看,metformin-mediated gero-suppressive对新陈代谢的影响主要取决于活化蛋白激酶(AMPK)的激活,导致下游的抑制哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR) [18]。AMPK / mTOR信号通路已广泛应用并记录在当前的研究中来对抗衰老和被认为是至关重要的细胞内机制的二甲双胍在衰老的衰减特征19]。此外,钙结合蛋白39 (CAB39),肝脏的脚手架蛋白激酶B1 (LKB1)的磷酸化激活AMPK,因此,AMPK / mTOR的上游激酶信号通路(20.]。然而,它还没有建立二甲双胍是否介导DPSC衰老通过调节CAB39 / AMPK / mTOR信号。此外,潜在的潜在机制尚未阐明。

小分子核糖核酸(microrna),一种内源性小分子非编码RNA,已报告在调节细胞衰老起着至关重要的作用。microRNA-34a (miR-34a)一直被视为一个潜在的传感器的衰老,以来表达增加几岁的组织和细胞,包括DPSCs [21- - - - - -24]。此外,二甲双胍对miR-34a监管效应,调节多个生物过程,或表达下调的表达miR-34a [25- - - - - -28]。一项研究表明,miR-34a展出鼠标微血管内皮细胞的抗血管新生作用,这可能是由二甲双胍(调制25]。在另一项研究中,发现二甲双胍减弱分子高纤维化和炎症大鼠系膜细胞的负调节miR-34a [26]。大量研究表明,miR-34a二甲双胍的直接目标。然而,二甲双胍之间更深入的见解和miR-34a仍缺乏DPSC衰老。

本研究旨在确定二甲双胍miR-34a-3p和调查的影响的分子机制miR-34a-3p功能,特别关注其目标基因CAB39 AMPK / mTOR信号通路,在调节DPSCs的衰老。

2。材料和方法

2.1。纸浆样品

是从12人牙髓组织健康的捐赠者进行拔牙治疗或矫正原因没有纸浆炎症,严重的牙周炎,或系统性疾病。样本分为两个年龄组(6捐助者/组):年轻组(18-27年)和衰老组(65 - 74年)。所有病人提供书面知情同意参与之前,和实验医学伦理委员会批准的协议是中国人民解放军(PLA)综合医院(伦理审批。s2018 - 094 - 01)。

2.2。细胞培养

DPSCs的主要文化是由酶消化方法。简单地说,牙髓组织得到皇冠和优越的根髓的三分之二。然后他们被切成小碎片和消化1 h在37°C的一个解决方案3毫克/毫升I型胶原酶(卫氏生化)和4毫克/毫升dispase(σ)。主要DPSCs保持完整αmem培养基补充20%胎牛血清(表达载体)和100 U /毫升青霉素和链霉素(表达载体)。文化是湿润5%孵化有限公司₂孵化器在37°C。媒体改变了每3天,细胞通过执行当细胞融合达到80 - 90%。年轻和衰老DPSCs的生长状态监测和记录在光学显微镜下观察(×100放大;奥林巴斯、日本)。DPSCs在第四段是用来进行了一系列实验。

2.3。流式细胞术分析

流式细胞仪进行检测人类DPSCs表面标记。年轻和衰老DPSCs收集,用磷酸盐(PBS)和固定在4%多聚甲醛(PFA)。固定30分钟后,这些细胞被permeabilized和孵化抗体1 h在4°C。使用以下特定人类表面抗原的抗体:CD44-FITC (Biolegend, 103005), CD90-FITC (Biolegend, 328107), CD105-PE (eBioscience, 4300023), CD11b-FITC (eBioscience, 4271325), CD14-FITC (Biolegend, 301803), CD34-PE (Biolegend, 119307),和CD45-FITC (Biolegend, 304005)。相应的isotype-matched抗体(免疫球蛋白)共轭PE和FITC -控制。数据分析使用FlowJo软件(美国FlowJo、亚什兰或)。

2.4。细胞增殖:二甲双胍剂量的识别

确定使用二甲双胍的浓度在后续实验中,年轻的扩散能力和衰老DPSCs处理各种二甲双胍的浓度(10、50、100、250和500μ米)是由细胞计数Kit-8 (CCK-8)试验(Dojindo、日本)。样品没有添加二甲双胍作为控制。细胞接种于96孔培养板的密度 细胞/ 24 h和更新与维护中含有二甲双胍在不同浓度为1到10天( )。中被移除,PBS的细胞被洗。每个好,110μl解决方案(100μlαmem和10μl CCK-8)了,盘子里是孵化1 h在37°C。吸光度是然后在450纳米波长测量enzyme-labeling仪器(Tecan无限200 Pro,瑞士)。

2.5。Senescence-Associatedβ牛乳糖(SA -β加)染色

SA -β使用SA -加进行染色β加染色工具包(Solarbio,北京)检测年轻和衰老DPSCs的衰老。短暂,细胞被固定在4% PFA在室温下15分钟,洗了三次与PBS和SA -孵化β一夜之间加染色溶液在37°C。完整的β加染色解决方案包含40毫米磷酸钠(pH值6.0),5毫米亚铁氰化钾,5毫米铁氰化钾,150毫米氯化钠,MgCl 2毫米₂和1毫克/毫升半乳糖苷。部分是用PBS,安装在甘油和可视化在奥林巴斯IX71显微镜下观察(奥林巴斯、日本)。SA -β-gal-positive细胞出现细胞中被随机成像。老化的百分比DPSCs被确定为积极DPSCs总数的比率DPSCs来自五个不同领域的观点。

2.6。转染的miR-34a-3p模仿

miR-34a-3p模仿和相应的负控制(NC)被综合化学合成生物技术解决方案(上海,中国)。miR-34a-3p模仿和miR-NC序列5 - - - - - -CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3和5 - - - - - -UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3 ,分别。Lipofectamine 2000转染试剂(英杰公司)是用于执行瞬时转染的寡核苷酸根据制造商的指示。老化DPSCs与miR-34a-3p pretransfected模仿或miR-NC最后孵化100海里的浓度48 h,在刺激与二甲双胍48 h。扭转了转染效率transcription-quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)。

2.7。Dual-Luciferase记者分析

野生型的片段(WT) 3UTR CAB39预测与miR-34a-3p和突变CAB39-3(狗)UTR (GenePharma、上海、中国)放大和subcloned pmirGLO向量(WI Promega公司麦迪逊,美国)。所构造的荧光素酶报告质粒是CAB39-3命名UTR WT及CAB39-3分别UTR无足轻重的人。dual-luciferase记者分析,hek - 293 t细胞被使用,因为他们的转染效率高(29日]。简而言之,hek - 293 t细胞被播种到24-well转染前板。confluency当细胞达到70 80%,cotransfection miR-34a-3p模仿或miR-NC和WT或狗记者质粒是使用Lipofectamine执行2000年。在37°C,转染48 h后收集细胞,荧光素酶活性进行了分析使用Dual-Luciferase记者分析系统(WI Promega公司麦迪逊,美国)。

2.8。慢病毒建设和转染

CAB39基因过表达,慢病毒质粒从SyngenTech购买(上海,中国)。慢病毒结构,CAB39的编码序列插入到pHS-AVC-LY027慢病毒载体。使用的引物序列如下:底漆,5 - - - - - -TAAGATCTACAGCTGCCTTG-3 ,和反向引物5 - - - - - -TGACATTTCGACATATCTGA-3 。慢病毒生产股hek - 293英尺的细胞(SyngenTech、上海、中国)根据制造商的指示。短暂,媒介“(分泌物)收集0.45转染48 h后,过滤μm过滤器。建立稳定的细胞系,慢病毒转染是由取代了媒介与媒介的“(分泌物)8μ克/毫升聚凝胺。在48 h posttransfection,转染效率是衡量RT-qPCR。

2.9。RT-qPCR

miR-34a-3p的表达水平和CAB39 RT-qPCR测定。总RNA隔绝DPSCs使用试剂盒试剂(表达载体,北京)和反向转录产生cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(TIANGEN生物技术,北京)根据制造商的指示。使用SYBR-Green RT-qPCR反应进行PCR反应混合液(TransGen生物技术,北京)ABI7500系统(应用生物系统公司;热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,美国马)。U6核内小rna的表达β肌动蛋白作为内部控制规范化microrna的信使rna表达水平,分别。的相对表达水平miR-34a-3p和CAB39计算使用2^{- - - - - -ΔΔCT}循环阈值方法。使用的引物序列如下:miR-34a-3p序列,5 - - - - - -CAATCAGCAAGTATACTGCCT-3 ,U6序列,5 - - - - - -CGCAAGGATGACACGCAAATTC-3 ,普遍的miR-34a-3p反向引物序列和U6, 5 - - - - - -GTGCAGGGTCCGAGGT-3 ;CAB39序列,5 - - - - - -AAATCTCCAGCAGACATTGTG-3 ,和反向序列,5 - - - - - -CAAGTCAATGAGCTGTAAATCA-3 ;和β肌动蛋白序列,5 - - - - - -CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 ,和反向序列,5 - - - - - -CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3 。

2.10。西方墨点法

CAB39的蛋白质含量,磷酸化(p -) AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p53、p21和p16蛋白免疫印迹测定。短暂,总蛋白提取DPSCs使用里帕缓冲区(Beyotime、上海、中国)。蛋白质浓度测定使用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包(Beyotime、上海、中国)。总共30μg等于蛋白质样本解决10%钠dodecyl-sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔,达姆施塔特,德国)。5%脱脂牛奶是用来阻止TBST的膜在室温下2 h。细胞膜在一夜之间被孵化在4°C以下主要抗体:anti-CAB39 (Abcam ab51132) anti-p-AMPK (CST, 2535年代),anti-AMPK (Proteintech 66536 - 1 - ig), anti-p-mTOR (Abcam ab109268) anti-mTOR (Abcam ab32028) anti-p53 (Proteintech, 10442 - 1 - ap), anti-p21 (Proteintech, 10355 - 1 - ap), anti-p16 (Proteintech, 10883 - 1 - ap)和反β肌动蛋白(Proteintech, 20536 - 1 - ap)。随后,膜清洗三次TBST孵化和二次抗体(Beyotime 1: 1000年,中国上海)1 h在37°C。β肌动蛋白是作为内部控制。蛋白质印迹都是chemiluminated使用增强化学发光(ECL)检测设备(High-sig ECL免疫印迹基质;中国上海Tanon)。

2.11。统计分析

所有的实验都重复至少三个独立的时期。数据分析使用GraphPad Prism 5.0统计程序(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)和呈现 (SD)。对比两组被学生的评估 - - - - - -测试,而多组对比分析了单向方差分析其次是图基的多重比较检验。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。隔离、文化和DPSCs的识别

人类从新鲜果肉组织分离提取牙齿的年轻和衰老捐助者(图1(一))。主要DPSCs使用酶消化培养法。wall-adherent细胞的形态是长纺锤形或多边形倒置光学显微镜(图下1 (b))。流式细胞术证明年轻和衰老DPSCs积极表达了人类MSC表面标记CD44 (99.9%, 99.9%), CD90(99.9%, 100%),和CD105(99.4%, 99.5%),而负面表达造血细胞标记CD11b (0%, 0.61%), CD14 (1.33%, 0.82%), CD34(0.12%, 0.035%),和CD45(0.49%、0.87%)(图1 (c))。这些结果表明,DPSCs符合msc的特点。

3.2。二甲双胍治疗DPSC扩散的影响

二甲双胍对细胞增殖的影响评估,并建立了一个合适的治疗浓度。增殖能力评估CCK-8显示非线性二甲双胍存在剂量依赖的相关性曲线。与对照组相比,100年μM二甲双胍显著提升年轻的扩散DPSCs DPSCs老化的前三天,在第三天( ,数据2(一个)和2 (b))。然而,250年μM二甲双胍显著抑制衰老的扩散DPSCs第九和第十天( ,图2 (b))。此外,在高浓度二甲双胍(500μ米)的核扩散活动减少年轻DPSCs第九和第十天,衰老的DPSCs后第五天( ,数据2(一个)和2 (b))。基于这些发现,100年μM二甲双胍浓度被选为用于后续实验。

3.3。在DPSCs二甲双胍抑制衰老

SA -β加染色进行识别的影响在年轻的衰老和衰老DPSCs二甲双胍。结果表明,SA -的百分比β-gal-positive细胞衰老DPSCs明显高于年轻DPSCs ( ,数据3(一个)和3 (b))。然而,当使用二甲双胍治疗,SA -的百分比β-gal-positive细胞显著减少年轻和衰老组( ,数据3(一个)和3 (b)),这表明二甲双胍可以在DPSCs抑制衰老。

蛋白质p53、p21, p16被西方墨点法评估。结果表明,二甲双胍刺激抑制p53的水平,p21和p16在年轻和衰老DPSCs ( ,数据3 (c)和3 (d)),这表明二甲双胍抑制衰老的DPSCs通过抑制senescence-associated蛋白质的表达。

3.4。二甲双胍抑制miR-34a-3p表达和激活AMPK / mTOR DPSCs信号通路

探讨二甲双胍对miR-34a-3p的表达的影响和下游信号通路分子的表达miR-34a-3p CAB39由RT-qPCR决定,虽然p-AMPK的表达,AMPK, p-mTOR, mTOR取决于西方墨点法。RT-qPCR结果表明,老化DPSCs, miR-34a-3p显著调节而CAB39显著下调相比年轻DPSCs ( ,数据4(一)和4 (b)),这表明miR-34a-3p和CAB39可能与DPSC衰老有关。miR-34a-3p的表达明显减少二甲双胍治疗后 ,数据4(一)和4 (b)),而CAB39的表达显著增加年轻和衰老DPSCs ( ,数据4(一)和4 (b))。这些结果清楚地表明二甲双胍抑制miR-34a-3p表达和诱导CAB39表达式。

免疫印迹分析表明,p-AMPK的表达明显下调,而p-mTOR明显的表达调节衰老DPSCs相比年轻DPSCs ( ,数据4 (c)和4 (d)),这表明AMPK / mTOR信号DPSCs的衰老有关。同样,在metformin-treated细胞,p-AMPK表达水平显著升高,而p-mTOR表达水平显著抑制( ,数据4 (c)和4 (d)),这表明二甲双胍的管理导致激活AMPK / mTOR的信号通路。

3.5。miR-34a-3p会使CAB39表达式

核实miR-34a-3p和CAB39之间的潜在关系,老化DPSCs服用二甲双胍或miR-34a-3p模仿和表达水平miR-34a-3p和CAB39确定。发现miR-34a-3p的表达水平明显增加与miR-34a-3p转染后模仿并显著减少二甲双胍治疗后 ,图5(一个)),确认miR-34a-3p模仿的成功转染。此外,miR-34a-3p转染的模仿导致CAB39表达水平明显降低,而metformin-induced upregulation CAB39的减毒mRNA和蛋白水平( ,数据5 (b)- - - - - -5 (d)),这表明miR-34a-3p下调CAB39的表达。

进一步检查的作用miR-34a-3p CAB39监管,dual-luciferase记者分析。潜在的CAB39-3 miR-34a-3p结合位点预测了UTR TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/(图),生物信息学预测工具5 (e))。相对荧光素酶活性显著下调当CAB39 WT与miR-34a-3p cotransfected模仿相比miR-NC cotransfection ( ),而当CAB39-3抑制作用被废除UTR突变( ,图5 (f)),这表明miR-34a-3p专门绑定到CAB39-3预测UTR。

3.6。抑制衰老差别Metformin-Induced miR-34a-3p对这些在DPSCs AMPK / mTOR信号通路

探索的角色miR-34a-3p metformin-mediated抑制衰老,衰老DPSCs服用二甲双胍或miR-34a-3p模仿。SA -β加染色结果显示转染的miR-34a-3p模仿显著调节SA -的比率β-gal-positive细胞( ,数据6(一)和6 (b))。此外,二甲双胍抑制作用的衰老DPSCs miR-34a-3p被过度扭转( ,数据6(一)和6 (b))。免疫印迹分析表明,miR-34a-3p模拟取得了显著增加的转染senescence-associated蛋白质p53的表达水平,相对于那些miR-NC p21, p16集团( ,数据6 (c)和6 (d))。此外,二甲双胍抑制影响senescence-associated蛋白表达是减毒在miR-34a-3p过度老化DPSCs ( ,数据6 (c)和6 (d))。此外,p-AMPK被缩减后的表达使转染miR-34a-3p模仿,当p-mTOR的表达升高,表明激活AMPK / mTOR信号通路( ,数据6 (e)和6 (f))。同样重要的是要注意,miR-34a-3p超表达显著废除metformin-mediated p-AMPK / AMPK比率增加和减少p-mTOR / mTOR比( ,数据6 (e)和6 (f))。总的来说,这项研究表明,miR-34a-3p激活AMPK加重DPSC衰老/ mTOR信号通路,抑制衰老通过抑制miR-34a-3p而二甲双胍治疗。

3.7。CAB39减轻miR-34a-3p-Induced衰老在DPSCs AMPK / mTOR信号通路

探讨CAB39对miR-34a-3p-induced DPSC衰老,CAB39缺乏miR-34a-3p目标站点在老化DPSCs过表达,与miR-34a-3p模仿细胞治疗。与Lenti-CAB39转染后,miR-34a-3p-induced增加积极的SA -β加染色明显下降( ),而没有观察到的统计差异vehicle-treated对照组( ,数据7(一)和7 (b))。此外,免疫印迹结果证实Lenti-CAB39治疗显著逆转变更的几个关键senescence-associated miR-34a-3p模仿引起的蛋白质,包括增加p53的表达水平,p21, p16, p-mTOR和减少p-AMPK的表达( ,数据7 (c)- - - - - -7 (f))。整体而言,这些结果表明CAB39可以挽救miR-34a-3p-induced衰老在DPSCs调制AMPK / mTOR信号通路。

4所示。讨论

细胞衰老是一个不可避免的生理现象,与年龄或长期文化相关联在体外。它的特点是一般在生理功能退化。干细胞衰老被认为是一个组织和器官功能下降的主要原因,并有可能影响干细胞疗法的疗效[30.]。在这项研究中,二甲双胍治疗,第一次显示移植CAB39和激活AMPK / mTOR信号通路的表达下调miR-34a-3p,缓解DPSC衰老。本研究阐明了二甲双胍DPSC衰老和抑制作用的提供了一个基础的潜在临床应用二甲双胍在延缓衰老。

在这项研究中,人类DPSCs被成功分离出新鲜的牙髓组织中提取的牙齿。培养DPSCs显示呈纺锤状形态。年轻和衰老DPSCs积极表达典型的间叶细胞表面标记(CD29, CD90、CD105),而仅仅表达造血标记(CD11b、CD34、CD45和CD14)。细胞表面抗原的表达与msc(标准是一致的31日]。这些结果表明,孤立的年轻和衰老DPSCs被确认为msc。

先前的研究已经报道,二甲双胍在剂量依赖性的方式介导细胞增殖;因此,确定一个合适的药物剂量使用在体外研究是极其重要的获得预期的效果(32,33]。据报道,100年和200年μM二甲双胍施加的最大proproliferative影响osteoblast-like细胞(34]。同样,另一项研究发现,100年μM二甲双胍增强DPSCs的增殖活动(35]。在目前的研究中,100年μM二甲双胍被发现有最好的提高影响DPSCs扩散。然而,结果表明,高浓度的500μM二甲双胍对DPSCs施加抗增殖效果,因此限制了其应用。

二甲双胍在各种衰老过程的抑制作用已经在多个模型阐明生物体和人类细胞系。二甲双胍已发现gero-therapeutic影响干细胞,包括针对干细胞疲惫,延迟细胞消耗,维持细胞功能,防止过早衰老。之前报道,二甲双胍抑制了肠道干细胞的衰老(isc)果蝇和增强人类的寿命msc (15,36]。最近,二甲双胍发现部分扭转失调的复兴和分化能力的年龄少突细胞祖细胞(信息公开化,进一步恢复remyelination能力(37]。这项研究集中在二甲双胍对年轻和衰老的影响DPSCs,结果证实gero-suppressive效应显著减小SA -即可见一斑β加活动和senescence-associated蛋白质的表达水平。

AMPK函数作为一个关键营养和能量传感器,这是参与多种病理生理过程(38]。有研究报道,二甲双胍间接诱发AMPK防止细胞衰老AMPK活性下降引起的老化msc (39]。此外,AMPK被认为是一个关键因素参与阻塞mTOR信号,衰老的重要调节器。激活mTOR导致自噬的减少,从而促进细胞衰老(40]。越来越多的证据表明,AMPK / mTOR的控制信号通路参与衰老(41),和二甲双胍展览mTOR的磷酸化的抑制作用通过激活AMPK [19]。此外,CAB39组件的三聚物的LKB1-STRAD-CAB39复杂,导致LKB1的稳定副绑定和公认的上游激活AMPK是因为它在通过磷酸化的AMPK激活AMPK信号中的作用α1残留刺- 172 [42]。据报道,CAB39与MSC衰老有关,这发生在一个AMPK-dependent方式(43]。在最近的研究中,我们的结果显示一个下降的表达CAB39 p-AMPK和增加p-mTOR的表达在老化DPSCs年轻DPSCs相比。值得注意的是,二甲双胍治疗后,CAB39和p-AMPK表达水平的调节在年轻和衰老DPSCs,虽然p-mTOR表达下调。总的来说,这些结果暗示的信号活动CAB39 / AMPK / mTOR与metformin-mediated gero-suppressive效果。

近年来,miR-34a,守恒miR-34家族的一员,一直深入研究。先前的研究文档,miR-34a参与多个生物过程,包括细胞周期、发展、分化、凋亡、衰老(44- - - - - -46]。抑制miR-34a减少衰老在人类脂肪间充质干细胞(超导公司)46]。在先前的研究中,微阵列分析显示,miR-34a老化DPSCs显著升高,表明它可能是一个重要的与年龄相关的microrna DPSCs [24]。我们的结果与先前的结果是一致的,miR-34a-3p DPSCs衰老过程中高度表达。此外,二甲双胍可以发挥重要作用的规定miR-34a表达式(25- - - - - -28]。在这项研究中,二甲双胍对miR-34a-3p的表达表现出抑制的影响。进一步的研究表明,过度的老化DPSCs miR-34a-3p提升细胞衰老,而二甲双胍显著减毒miR-34a-3p-mediated衰老通过激活AMPK / mTOR的信号通路。此外,miR-34a-3p下游目标识别,发现CAB39 miR-34a-3p的直接目标基因。miR-34a-3p模仿治疗显著降低CAB39的表达和减毒metformin-induced upregulation CAB39。值得注意的是,增强衰老在DPSCs miR-34a-3p模仿被Lenti-CAB39转染部分逆转。此外,参与AMPK / mTOR的信号通路也证实了这一过程。集体,我们建立了metformin-induced减轻DPSC差别miR-34a-3p对这些衰老通过针对CAB39 AMPK / mTOR信号通路。然而,AMPK / mTOR拥有各种旁路信号级联,调节其功能;除了CAB39之外,我们也不能排除miR-34a-3p调节激活AMPK / mTOR的信号通路通过其他分子或途径。

5。结论

总之,我们发现二甲双胍抑制DPSC衰老的表达下调miR-34a-3p,导致CAB39 upregulation和激活AMPK / mTOR的信号通路。这些结果表明,二甲双胍可以用来缓解DPSCs细胞衰老,和miR-34a-3p-CAB39 / AMPK / mTOR轴可能是小说的二甲双胍治疗目标可以减缓衰老。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

深圳,RZ,米歇尔和HCL的构思和设计研究。深圳,PYQ XCM, RJL进行了实验。深圳和RZ写手稿。深圳,FFW CJL分析数据并进行统计分析。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项研究得到了北京自然科学基金(批准号7194320)和中国国家自然科学基金(格兰特数字81771102,81771102)。

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