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Takenori日本须贺,不会被臼井仪人,Satoru Onizuka Kotaro佐野Tsuyoshi佐藤,Kohji Nakazawa, Wataru Ariyoshi, Tatsuji Nishihara,中岛美嘉圭佑, ”表征和研究人类牙周间充质干细胞的基因表达谱在球体文化通过转录组分析”,干细胞国际, 卷。2021年, 文章的ID5592804, 18 页面, 2021年。 https://doi.org/10.1155/2021/5592804
表征和研究人类牙周间充质干细胞的基因表达谱在球体文化通过转录组分析
Takenori日本须贺,1 不会被臼井仪人
,1
Satoru Onizuka,1
Kotaro佐,1
Tsuyoshi佐藤,2
Kohji Nakazawa,3
Wataru Ariyoshi,4
Tatsuji Nishihara,4
和
中岛美嘉圭佑1
1牙周病学分工、部门口腔功能,九州牙科大学2-6-1 Manazuru, Kokurakita-ku,北九州803 - 8580,日本
2口腔颌面外科、埼玉县医科大学,38 Moro-hongou, Moroyama-machi, Iruma-gun,埼玉县350 - 0495年,日本
3大学的生活与环境工程系,北九州,1:1 Hibikino, Wakamatsu-ku,北九州808 - 0135,日本
4感染与分子生物学、卫生改善,九州牙科大学2-6-1 Manazuru, Kokurakita-ku,北九州803 - 8580,日本
文摘
球体被称为一个三维的文化模式,更好的模拟生理条件的干细胞。本研究旨在识别特异表达基因在人类牙周韧带spheroid-cultured间充质干细胞(hPDLMSCs)使用RNA-seq分析来评估他们的功能。转录组分析使用球体和单层文化hPDLMSCs从四个病人。集群和基因本体分析显示,基因信息粘附以及G2 / M和有丝分裂细胞周期G1 / S转换强烈表达了在单层培养组。然而,基因的负调控细胞增殖,组蛋白脱乙酰作用和骨形态形成蛋白信号在球体文化强烈的表达。我们集中在转录因子核受体亚科4组2(一员NR4A2)强烈的基因表达中球体文化组织和分析其功能。确认的结果转录组分析,我们进行实时聚合酶链反应和免疫印迹分析。有趣的是,我们发现NR4A2 mRNA和蛋白表达的强烈表达spheroid-cultured hPDLMSCs。在成骨分化的条件下,我们用siRNA打倒NR4A2 spheroid-cultured hPDLMSCs来验证它在骨生成中的作用。我们发现NR4A2击倒osteogenesis-related基因的信使rna表达水平显著提高了碱性磷酸酶(高山),骨桥蛋白(OPN)和1型胶原蛋白(COL1)(学生的搭配 - - - - - -测试中, )。高山活动也是负对照组相比显著增加(学生的搭配 - - - - - -测试中, )。此外,spheroid-cultured hPDLMSCs转染与siNR4A2培养12天,导致明显的形成更大的钙化结节与负对照组(学生的搭配 - - - - - -测试中, )。另一方面,NR4A2击倒在hPDLMSC球体并不影响软骨形成和adipogenesis-related基因的水平下chondrogenic和脂肪形成的条件。这些结果表明,NR4A2负调节骨生成的球体hPDLMSCs文化。
1。介绍
牙周韧带间充质干细胞(PDLMSCs)是多功能的,可以分化为骨、软骨、脂肪组织(1]。这个属性使得其使用在治疗牙周组织的再生,输给了牙周炎(2]。岩田聪et al。2- - - - - -4)报道,细胞表由人类PDLMSCs (hPDLMSCs)可以在狗和人类牙周组织再生。我们之前也发现hPDLMSC文化球状体和hPDLMSC-human脐静脉内皮细胞(HUVECs) cocultured球状体增强牙周组织的再生疗法相比monolayer-cultured hPDLMSCs [5]。
球体是三维聚合的细胞,因此被称为三维培养模型。球体文化被视为更多生理相关,细胞的特点是更好的保存6,干细胞的分化能力普遍增强在三维培养条件。例如,神经元分化的胚胎干细胞(ESCs)是提高胚状体的身体文化相比,二维单层细胞培养(7]。间充质干细胞(MSC)的另一个有趣的特性是他们形成球状体在体外扩展了msc的复制寿命和延迟细胞衰老6]。多项研究表明,多能性标记基因的表达水平(NANOG,SOX2,OCT4)增加msc (8,9]。我们还发现,NANOG和OCT4 mRNA和蛋白水平的表达hPDLMSC球状体;值得注意的是,这个表达式是高于单层文化,这与先前的研究一致(10]。最近,我们也表明hPDLMSC球状体成骨和牙周组织再生能力优于monolayer-cultured hPDLMSCs [6,10]。然而,这些hPDLMSC球体文化属性的机制还没有完全理解。
核受体亚科4组一员2 (NR4A2)是一个孤儿核受体和转录因子属于NR4A家庭。它显示了高度的相似NR4A家族的其他成员(NR4A1和NR4A3),特别是在dna结合域(11]。NR4A2也称为NURR1, TINUR, NGFI-Bβ。NR4A2表达式快速诱导针对各种因素,如脂肪酸、前列腺素、钙、生长因子,和肽激素(12,13]。此外,NR4A2已经知道识别特定的DNA序列,如NGFI-B响应元素(资金占用),ligand-independent方式诱导下游基因表达(14]。NR4A2也被发现在亚细胞的大脑区域表达;NR4A2-deficient小鼠有明显的缺陷在中脑制造多巴胺的神经细胞和死后不久出生(15]。它也表明,基因突变NR4A2发现在某些情况下,家族性帕金森病(16]。最近,据报道,NR4A2还参与肿瘤发生[17),以及NR4A2表达式在prostatospheroids调节[18]。然而,在MSC NR4A2的行为和作用目前未知的球状体。
在这项研究中,我们进行基因组分析(转录组分析)hPDLMSC球体的文化,相比二维单层文化。这是第一个研究进行转录组分析hPDLMSC球状体和单层文化。我们假设基因通过转录组分析发现可能参与的性质hPDLMSC球状体。我们专注于NR4A2,被发现hPDLMSC球体中高度表达的文化,并分析了其在骨诱导作用。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
hPDLMSCs得到从提取的智齿没有受到牙周疾病的影响。提取这些智齿九州牙科大学医院。提取后,智齿是洗五次磷酸盐(PBS)(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)含有抗生素青霉素(100 U /毫升和100年μg / mL链霉素;日本大阪,Wako)。牙周韧带(PDL)被从中间三分之一的牙根表面和消化在1毫克/毫升溶液1型胶原酶和光)(kouichi和1200 pU /毫升dispase和光)(kouichiαmem(最低基本培养基)(热费希尔科学)1 h在37°C而颤抖。单细胞悬浮体获得通过的细胞通过一个70μm过滤器(美国纽约康宁)。细胞培养在100毫米文化菜(磐、静冈市、日本)α含10%胎牛血清(mem的边后卫;Biocera、Nuaille、法国),100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在湿润的气氛中有5%的公司2在37°C。12小时后,新媒体添加删除独立的细胞。每4 - 5 d直到通道5亚文化进行。确认分化能力的细胞,成骨、软骨形成和脂肪生成化验进行(数据没有显示)。此外,流式细胞术分析证实这些细胞表达CD29, 44岁,73年,90年、105年和106年,也没有表达CD34和45(数据未显示)。hPDLMSCs获得批准的九州牙科大学伦理委员会(协议#的程度)。所有患者捐赠的牙齿收获自由人民党给他们同意在本研究中使用的牙齿。hPDLMSCs从四个病人((1)28从25岁的男性,(2)从26岁男,18(3)从30岁男,18岁,(4)28从25岁女性)被用于转录组分析和NR4A2成骨的功能分析,chondrogenic,脂肪形成的条件。
2.2。球体形成
hPDLMSC球状体形成与microwell芯片,准备如前所述[10,19,20.]。在这项研究中,与500年microwell芯片μ直径和500μ米深度的设计。microwell结构芯片的制作由铣削系统(PMT Corp .)、福冈、日本)。microwell芯片的表面涂上一层铂用离子溅射装置(日立高科技科学系统公司、茨城、日本)。芯片是沉浸在5毫米乙醇溶液中聚乙二醇和超纯水洗,其次是冲洗50%乙醇对切除的聚乙二醇和灭菌。microwell芯片都沉浸在媒介使用前细胞培养。hPDLMSCs与每在microwell 2.000细胞培养芯片αmem培养基含有10%的边后卫。每隔一天中被改变。
2.3。转录组分析
四种类型的hPDLMSCs收集提取智齿的四个病人,和这些都是培养microwell芯片3天准备球状体。hPDLMSCs从相同的四个病人在单层培养3天准备作为对照组。RNA是来自两组使用一个RNeasy迷你包(热费希尔科学),根据制造商的指示。RNA-seq执行使用Illumina公司HiSeq系统(美国圣地亚哥,CA)。适配器序列和低质量的基地fastq文件被Trimmomatic修剪(v . 0.35)。人类参考基因组测序读是一致的(hg38)使用HISAT2(诉魅惑)软件。袖扣(2.2.1)用于规范化独特映射读取每千碱基的外显子片段每百万读取映射(FPKM)。检测两组之间的差异表达基因(度),我们使用Cuffcompare, Cuffquant,和Cuffdiff工具,计算每一个基因,褶皱的变化价值,错误发现率(罗斯福)使用Benjamini-Hochberg校正(袖扣包值)。度被定义时值< 0.05,褶皱的变化FPKM≥2.0。hg38参考和Refseq注释从UCSC基因组浏览器(https://genome.ucsc.edu/)。丰富基因本体论(去)条款进行了分析使用数据库注释、可视化、发现和集成(大卫;https://david.ncifcrf.gov/)与注释数据集的生物过程。具体条款得到从NCBI数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/)。大部分的情节和图表RNA-seq分析可视化使用ggplot2(诉3.0.0)和其他R包。聚类分析是使用R的函数hclust执行包。
2.4。定量实时聚合酶链反应测定
验证mRNA表达的变化,定量实时聚合酶链反应(存在)进行使用StepOne™实时系统(热费希尔科学)如前所述21]。总RNA提取从单层和spheroid-cultured hPDLMSCs使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国),根据制造商的指示。逆转录反应进行的高容量cDNA逆转录工具包(热费希尔科学)在37°C 60分钟和5分钟95°C。PCR产品检测到使用快速SYBR®绿色主人混合(热费希尔科学)各自的引物序列见表1基因表达的相对变化使用比较CT方法计算。总样本之间的互补脱氧核糖核酸丰富规范化使用特定的引物GAPDH基因。
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退火温度60°C,周期数40。 |
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2.5。RNA干扰
小干扰rna (siRNAs) NR4A2 (s9787)和不属预定目标的控制(4390843)从热费希尔科学购买。四万hPDLMSCs被镀成six-well盘子和microwell芯片单层组和球体组,分别培养3天。每个核被用来使转染hPDLMSC文化通过Lipofectamine RNAiMAX试剂(热费希尔科学)。这些细胞被培养为RNA和全细胞溶解产物制备实验和收获。
2.6。碱性磷酸酶(ALP)测定的活动
高山的活动球体hPDLMSCs测量使用LabAssay™系统和光)(kouichi高山,遵循制造商的协议。hPDLMSC球状体或monolayer-cultured hPDLMSCs siNR4A2处理和不属预定目标的控制或NR4A2超表达向量和控制向量在hMSC成骨分化培养基培养(Lonza、巴塞尔、瑞士)作为论述媒介(OIM) 7天。细胞被洗PBS和使用细胞裂解缓冲和光)(kouichi细胞溶解。样本添加到p在37°C -nitrophenyl磷酸盐和孵化15分钟;然后,反应停止的解决方案是添加,光学密度p硝基酚测定的吸光度在405 nm使用标(分子设备有限责任公司、联盟城市、钙、美国)。
2.7。免疫印迹分析
西方墨点法进行如前所述[21]。细胞单层和球体文化与PBS冷却,清洗和全细胞溶解产物是准备通过增加细胞裂解缓冲M和光)(kouichi补充原钒酸钠(V)和光)(kouichi phenylmethylsulfonyl氟化物(Nacalai Tesque,京都,日本),并停止™蛋白酶抑制剂鸡尾酒(热费希尔科学)。蛋白质浓度测定用直流™试验装备(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。等量的蛋白质分离使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到一个Immun-Blot PVDF膜(Bio-Rad)。非特异性结合位点被浸泡膜阻碍一个缓冲(Nacalai Tesque) 30分钟20°C。一夜之间,膜被孵化与稀释主要抗体NR4A2 (pa5 - 13416;卡尔斯巴德,表达载体、钙、美国),1:1000和GAPDH (G8795;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),1:20000年在4°C。然后反应膜和KPL抗体和配合Anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L)抗体,人类血清吸附,Peroxidase-Labeled(美国Seracare,米尔福德,MA)二级抗体1 H在20°C。洗膜后,化学发光检测使用ImmunoStar LD和光)(kouichi和ChemiDoc™XRS +系统(Bio-Rad)。
2.8。结节的形成分析
hPDLMSC为期3天的文化后形成球状体microwell芯片。转染后siNR4A2或不属预定目标的控制,调整培养基hMSC成骨分化培养基(Lonza) 12天诱导矿化。细胞被固定为99.5%甲醇和光)(kouichi 10分钟和彩色钙化结节染色装备(Cosmo生物、东京、日本)根据制造商的指示。量化成矿,茜素红色区域hPDLMSC球体的hPDLMSC球体和区域内测量使用ImageJ(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。茜素红的积极性hPDLMSC球体染色计算使用计算,茜素红色区域内hPDLMSC球体/ hPDLMSC球体。
2.9。细胞增殖实验
hPDLMSC为期3天的文化后形成球状体microwell芯片。转染后siNR4A2或不属预定目标的控制,这些球状体培养3和7天。可行性评估使用CellTiter 96水一个解细胞增殖试验装备(Promega corp .)根据制造商的指示。CellTiter96®水添加了一个解决方案(20μL /)和孵化为另一个4 h在37°C和5%的公司2;然后,25μ信用证的10% SDS补充道。板当时读490海里。
2.10。超表达分析
核苷酸序列编码人类NR4A2(加入。NM_006186)放大的质粒福莱希ORF克隆FXC21198 (Kazusa DNA本月>,千叶,日本)通过标准PCR技术使用PrimeSTAR马克斯DNA聚合酶(豆类、Ohtsu、日本)。该核苷酸序列插入到pcDNA3.1 / V5-His向量(表达载体)。hPDLMSCs被转染人类NR4A2矢量或控制使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。这些细胞被培养为RNA和全细胞溶解产物制备实验和收获。
2.11。软骨形成和脂肪生成分析
hPDLMSC为期3天的文化后形成球状体microwell芯片。转染后siNR4A2或不属预定目标的控制,二十球状体(40000细胞)被转移到一个15毫升管和培养hMSC Chondrogenic分化培养基(Lonza)诱导软骨形成。7天文化后,样本收集测量水平的2型胶原蛋白(COL2)和10型胶原蛋白(COL10实时PCR)表达式,chondrogenic标记。另一方面,对于脂肪形成,二十球状体(40.000细胞)被转移到一个48-well板和培养hMSC脂肪形成的分化培养基(Lonza)。7天文化后,样本收集测量CCAAT / enhancer-binding蛋白质的水平α(CEBPα)和过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ实时PCR)表达式,脂肪形成的标志。
2.12。统计分析
NR4A2功能分析的统计实验提出的 12个样品的细胞收集从四个病人。所有实验进行至少三次。统计分析了使用Excel软件(美国微软,微软,佤邦),使用成对的学生的 - - - - - -测试进行比较;值< 0.05被认为是具有统计学意义。权力分析证实,所有统计的统计力量大于0.8测试在这个研究。RNA-seq的统计数据,详细描述了转录组分析。
3所示。结果
3.1。基因档案Spheroid-Cultured hPDLMSCs RNA-seq
测序读是与人类使用HISAT2参考基因组(hg38),然后,每个样本的基因表达水平被量化为FPKM使用袖扣包。删除两组之间的低表达的基因,只有RefSeq基因表达的至少一个的团体 被用于这项研究中,由12137个基因。这些基因被分成三个不同的基因簇(图表现出不同的表达模式1(一))。集群1组成的5292个基因调节在单层培养与球体文化;相反,集群3组成的4932个基因,在球体调节文化相比,单层培养。集群2由1913个基因,不受文化影响的条件。基因在每个集群明显丰富具体的条款。基因集群1拥有特定的条件,如信息附着力,G2 / M有丝分裂细胞周期的过渡,和有丝分裂细胞周期G1 / S过渡。另一方面,基因集群3拥有特定的条件,如负调控细胞增殖、组蛋白脱乙酰作用,骨形成蛋白(BMP)信号(图1(一))。GO术语分析表明,球体培养系统可以诱导表观遗传变化,如组蛋白脱乙酰作用,可能会引起细胞周期阻滞。此外,我们RNA-sequencing全基因表达谱的分析表明,单层培养的球体文化是截然不同的配置文件(图1 (b))。
(一)
(b)
检测与球体文化相关联的潜在的主要监管机构,我们分析了度 )球体和单层之间的文化,成功地识别其中的2196个基因(图2(一个))。调查球体和单层文化之间的差异,去词浓缩使用调节度分析单层和球体的文化。前20名大大丰富生物过程的条件(值< 0.05)被确定(图2 (b))。大部分的前20名去条款被识别从单层的调节度文化参与细胞周期。有趣的是,调节度在球体文化拥有与成骨细胞的分化,如积极调节成骨细胞分化和骨形态发生蛋白信号通路。图2 (c)显示,前20名的表达水平,或者表达下调度观察为每个单独的样本。先前的研究表明球体文化增强hPDLMSCs具备干细胞(10),我们专注于stemness-related基因。图2 (d)表明,大多数的基因分类下GO术语干细胞群维护调节在球体的文化。在球体之间的度和单层培养组,我们提取的基因 , 值< 0.05, 在球体文化集团(表中2)。转录因子调节多种基因的表达,可能参与的多元化功能干细胞球状体。然后我们集中在转录因子NR4A2功能分析来寻找因素可能是主基因干细胞分化,如Runx2和osterix成骨细胞分化和NFATc1破骨细胞分化。
(一)
(b)
(c)
(d)
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3.2。NR4A2表达hPDLMSC球状体
NR4A2信使rna表达hPDLMSC实时PCR分析证实了球状体。的水平NR4A2信使rna表达spheroid-cultured hPDLMSCs高出约100倍比monolayer-cultured hPDLMSCs,与转录组分析的结果一致(图3(一个))。我们还进行了免疫印迹分析确认NR4A2的蛋白表达。NR4A2蛋白表达hPDLMSCs单层文化中不存在;然而,它可以明确确定的球体文化hPDLMSC(图3 (b))。我们还研究了NR4A1 NR4A3表达式NR4A2因为他们属于同一家族。类似于NR4A2的信使rna表达水平NR4A1和NR4A3在hPDLMSC更高比球状体monolayer-cultured hPDLMSCs(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。角色的NR4A2 hPDLMSC在骨生成球状体
检查函数的NR4A2 hPDLMSC球状体,我们执行一个siRNA可拆卸的测定。首先,我们检查核的可拆卸的功效。NR4A2 mRNA表达的水平在hPDLMSCs siNR4A2对待相比下降了约70%,在负控制核(图4(一))。免疫印迹分析显示,NR4A2蛋白表达在siNR4A2-treated hPDLMSC球状体的价格相比也减少了控制(图4 (b))。我们还研究了siNR4A2在mRNA的表达的影响NANOG和OCT4具备干细胞标记,和SOD2氧化应激的标记,在spheroid-cultured hPDLMSCs。NR4A2击倒的mRNA水平显著下降NANOG,OCT4,SOD2而在负控制(图4 (c))。这些数据表明,NR4A2击倒减少具备干细胞在spheroid-cultured hPDLMSCs。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
接下来,我们进行了一个结节形成试验与hPDLMSC澄清球状体小说NR4A2在骨生成的作用。我们培养的球状体hPDLMSCs对待不属预定目标的控制核或siNR4A2 OIM 12天。在成骨的条件下,hPDLMSCs对待这两个核向量形成茜素red-positive钙沉积。的区域茜素red-positive结节从spheroid-derived hPDLMSCs siNR4A2明显大于消极的控制siRNA-treated细胞(图4 (d))。
调查是否诱导成骨的基因在球体hPDLMSCs对siNR4A2 OIM条件的表达RUNX2,高山,OPN,COL1信使rna是通过实时PCR来衡量的。的表达高山,OPN,COL1信使rna在spheroid-cultured hPDLMSCs目标与siNR4A2后显著增加7天的文化相比,消极的控制。然而,mRNA的表达RUNX2在成骨细胞分化的早期阶段,相媲美,在消极的控制(图4 (e))。我们还研究了影响siNR4A2-treated hPDLMSCs OIM的高山活动。的高山活动hPDLMSCs球体文化中对待siNR4A2显著增加的价格相比负控制vector-treated球体文化(图4 (f))。另一方面,siNR4A2 hPDLMSC扩散(图没有影响4(h))。这些数据表明,NR4A2负调节骨生成的hPDLMSCs球体的文化。
进一步阐明NR4A2在hPDLMSC球状体骨生成期间,我们执行NR4A2过度化验。首先,我们检查的效果NR4A2超表达向量。免疫印迹分析表明,NR4A2蛋白表达在monolayer-cultured hPDLMSCs对待NR4A2超表达载体相比,在提高控制向量(图5(一个))。转染后NR4A2过度或控制向量,hPDLMSCs培养在microwell芯片球体形成OIM 7天。NR4A2蛋白表达在hPDLMSC球状体处理NR4A2超表达向量与那些接受控制向量(图5 (b))。实时PCR分析表明的表达Runx2,OPN,COL1信使rna在spheroid-cultured hPDLMSCs对待NR4A2超表达载体后与7天的文化相比,负控制(图5 (c))。此外,高山活动hPDLMSCs球体文化中对待NR4A2超表达载体也与消极控制vector-treated球体文化(图5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。角色的NR4A2 hPDLMSC在Monolayer-Cultured在脂肪形成和软骨形成和球状体hPDLMSC在骨生成
检查的作用在hPDLMSC NR4A2球状体脂肪形成和软骨形成,siNR4A2和控制siRNA-treated hPDLMSC球状体脂肪形成的和chondrogenic条件下培养7天。mRNA的表达CEBPα和PPARγ脂肪形成的标志,和mRNA的表达COL2和COL10软骨形成的标志,是衡量实时PCR。的表达CEBPα和PPARγ先生ΝΑ在spheroid-cultured hPDLMSCs目标与siNR4A2与消极控制脂肪形成的文化(图7天后6(一))。类似于脂肪形成的水平COL2和COL10信使rna表达siNR4A2-treated hPDLMSC球体也可比小干扰rna(图来控制6 (b))。这些数据表明,NR4A2并不影响脂肪形成和软骨形成球体hPDLMSCs的文化。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
最后,阐明NR4A2在单层培养的功能hPDLMSCs,我们执行一个siRNA可拆卸的测定。NR4A2 mRNA表达的水平monolayer-cultured hPDLMSCs siNR4A2处理相比,在减少消极控制核(图6 (c))。与球体文化,NR4A2击倒并不影响Nanog和Oct4 mRNA表达monolayer-cultured hPDLMSCs(图6 (d))。我们还研究了影响siNR4A2-treated hPDLMSCs OIM的高山单层培养的活动。的高山活动monolayer-cultured hPDLMSCs siNR4A2处理相当的-控制(图6 (e))。这些数据表明NR4A2是特定的效果hPDLMSC成骨的条件下球体。
4所示。讨论
我们进行转录组分析,识别度与球体之间monolayer-cultured hPDLMSCs使用下一代测序。我们确定了NR4A2等在hPDLMSCs基因高表达。弗里斯et al。22)也进行了微阵列分析使用骨骨髓来源培养的msc球体和单层文化,发现排名前50的调节基因在每种类型的文化。一些50基因调节骨组包括来源于MSC球体的文化SLC16A6,沙土荒漠,NR4A2,PTHLH,这也显示在表1。然而,STC1,CXCL8,PTGS2,FAM20A并不在其中。35的前50名基因也显著升高我们的分析相比,在单层培养组。同样,在单层培养组,36岁的前50名的基因调节相比,在球体文化集团也显著调节在我们的分析22]。这些数据表明,不同msc球状体的基因资料一致。在我们先前的转录组分析骨骨髓来源msc和PDL-derived msc、表达式的HOX两国msc(基因不同23]。换句话说,msc源自不同的解剖网站有显著差异基因表达和位置记忆,尽管他们满足相同的一般特征标准。这可能是为什么我们的结果不完全一致的弗里斯与et al。22]。
虽然有几个度获得单层和spheroid-cultured hPDLMSCs,我们专注于NR4A2,多才多艺的孤儿受体,强烈表达hPDLMSC球状体。NR4A家族是已知的功能在细胞内稳态24]。NR4A2击倒显著增加钙化的spheroid-cultured hPDLMSCs(图4 (d))。我们的数据表明,NR4A2负调节成骨细胞的分化spheroid-cultured hPDLMSCs。然而,一些研究表明相反的NR4A2在成骨细胞分化的影响。第一个显示,ALP的活性减少NR4A2 siRNA-treated MC3T3-E1细胞,小鼠成骨细胞细胞系(25]。第二表明NR4A2 transactivates骨钙素启动子和诱发骨钙素mRNA表达(26]。这些报告表明NR4A2促进成骨细胞分化。然而,这种相反的效果之间的差异可能是由于msc和成骨细胞。关于我们的假设,NR4A2-silenced文化牙髓的msc收获相比显著提高矿化控制(27]。进一步研究利用干细胞来自其他组织,如骨骨髓来源msc、需要充分阐明差异化的NR4A2 msc的角色。hPDLMSCs是众所周知的分化成成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞(1),而NR4A2击倒后,的表达NANOG和OCT4部分降低(图4 (c))。这个结果表明具备干细胞的损失和增加骨分化成骨的条件下。然而,基因在hPDLMSCs的multilineage分化能力和成骨细胞的分化过程目前尚不清楚;因此,进一步的研究是必需的,因为骨是受许多因素的影响。尽管NR4A2击倒显著增加钙化的spheroid-cultured hPDLMSCs, NR4A2过度hPDLMSCs球体没有减少osteogenesis-related基因的mRNA水平和高山活动意外。NR4A2 mRNA和蛋白表达水平spheroid-cultured hPDLMSC最初远高于在monolayer-cultured hPDLMSCs,和超表达NR4A2也许不会影响骨因为hPDLMSC球体表达并产生足够的NR4A2。
在这项研究中,转录组分析显示,NR4A2在hPDLMSCs培养更强烈地表达了在单层膜比球状体。此外,我们发现通过实时PCR不仅NR4A2 NR4A1 NR4A3和强烈的调节在球状体hPDLMSCs培养。击倒的NR4A2只能部分地抑制的表达NANOG和OCT4,具备干细胞标记spheroid-cultured hPDLMSCs,可能因为它是补偿NR4A1的表达和NR4A3属于同一个NR4A家庭。在未来,我们打算调查NR4A2的影响,NR4A1, NR4A3具备干细胞的spheroid-cultured hPDLMSCs。我们执行一个在体外只研究;因此,NR4A2的生理意义还不清楚。使用基因敲除小鼠体内分析澄清NR4A2的生理意义是必要的。然而,众所周知,NR4A2-deficient小鼠有明显的缺陷在中脑和产生多巴胺的神经细胞死亡后不久出生(15]。因为NR4A2-deficient老鼠非常难以维护长期在出生后出现,很少有分析障碍的成年人。NR4A2-deficient老鼠骨头和牙周组织的表型是未知的。澄清的作用NR4A2 msc,分析使用条件缺乏的老鼠是必要的。
NR4A2蛋白形成一个复杂的分子与几个协会和诱发目标基因的表达通过识别特定的序列,如核受体结合元素(NRBE),已知的序列一个AAGGTCA,努尔响应元件(NurRE) [28- - - - - -32]。NR4A2击倒增强OIM-induced骨在spheroid-cultured hPDLMSCs upregulation介导的高山和COL1(图4)。我们搜查启动子/增强子地区的高山和1型胶原蛋白数据库分析。我们发现几个候选人NR4A2结合位点的基因的启动子和增强子区域。这表明NR4A2可能直接监管高山和COL1基因的表达。然而,NR4A2形成的异质二聚体视黄X受体(24]。综上所述,我们建议NR4A2可以调节高山基因表达以间接的方式,形成一个复杂的视黄酸受体。在未来,我们计划进行突变分析使用高山启动子详细阐明这种机制。
我们已经识别出NR4A2,孤儿受体和转录因子,作为蛋白高表达spheroid-cultured hPDLMSCs通过转录组分析。这是第一个研究表明NR4A2负调节骨在spheroid-cultured hPDLMSCs。进一步验证hPDLMSC球体的生理意义,我们计划进行功能分析的研究在本研究中确定的其他基因。
5。结论
RNA-seq的基因表达谱分析表明hPDLMSCs球体和单层培养组明显不同。聚类分析和词分析显示,基因信息粘附G1和G2 / M / S转换的有丝分裂细胞周期强烈表达了在单层培养组,而基因的负调控细胞增殖,组蛋白脱乙酰作用,BMP信号强烈表达了球体文化团体。NR4A2功能分析,球体文化组织中高度表达,暗示NR4A2消极监管的骨spheroid-cultured hPDLMSCs。
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者,M.U.在合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突与此相关的手稿。
确认
我们感谢教授Takanori岩田聪和Kokabu丰田章一郎有益的讨论,徐怀钰博士Moritani的球体文化的建议,和牙周病学的Div.成员,九州牙科大学。这项研究受到了jsp KAKENHI格兰特数字19 k10133 M.U.和19 k19056 S.O.
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