给与L-Myc-Immortalized人类神经干细胞迁移到损伤后的主要和远端站点皮质影响和提高空间学习

文摘

干细胞疗法的成功是取决于有效的细胞交付受损区域,神经干细胞(nsc)有前途的治疗潜力,因为他们本质上迁移到中枢神经系统(CNS)损伤的网站。探索的可能性NSC-based治疗创伤性脑损伤(TBI)后,isoflurane-anesthetized成年雄性老鼠收到控制皮质影响(CCI)温和的严重性(2.8毫米变形在4 m / s)或虚假的伤害(即。,没有皮质的影响)。具有抑制受损,延伸开始1周老鼠免疫抑制 人类nsc (LM-NS008.GFP.fLuc)或车辆(阿明费)(2%人血清蛋白)鼻内接种(在)术后7天、9、11、13、15和17。评估的空间分布LM-NSC008细胞,一半的老鼠安乐死25天,一天之后完成认知任务,在46天,另一半被安乐死。1毫米厚的大脑部分光被清除(清晰),和卷被共焦显微成像。此外,通过免疫组织化学方法LM-NSC008细胞迁移到创伤性脑损伤的站点为人类巢蛋白39天。收购在莫里斯的水迷宫空间学习评估任务连续6天开始具有抑制受损天延伸在18岁。在政府LM-NSC008细胞在创伤性脑损伤( )显著促进空间学习相对 大鼠( )并没有影响 老鼠。总的来说,这些数据表明IN-administered LM-NSC008的创伤性脑损伤的损伤和细胞迁移到网站他们的存在与认知的改善。未来的研究将扩大在这些初步研究结果通过评估其它LM-NSC008细胞计量模式和评估机制LM-NSC008细胞有助于认知复苏。

1。介绍

创伤性脑损伤(TBI)往往导致长期的神经障碍(1- - - - - -3和每年在全世界影响一千万人4]。在美国,每年的发病率为280万(5]。虽然运动机能是负面影响,临床前和临床证据表明,认知障碍更为明显,长时间(6- - - - - -12和生活质量产生负面影响13,14]。急性医疗和随后的康复的经济成本,以及损失的生产力由于无法重返全职工作,每年数十亿美元(3]。创伤性脑损伤是一个重要的卫生保健问题,因此,许多药理干预已经评估(15- - - - - -18]。尽管各种方法显示的好处在实验室里,成功的临床翻译已经基本上不存在(19,20.]。这种低迷的形势,其他替代治疗策略的发展。

神经干细胞(nsc)是有吸引力的候选人创伤性脑损伤后恢复大脑功能他们固有的网站迁移到受损神经营养因子有助于抑制炎症,防止进一步的神经损失,促进恢复现有的神经元受损,可能取代丢失的神经元和其他细胞(21- - - - - -24]。成功NSC-based治疗最主要的挑战是确保足够数量的细胞达到阴道受损区域。为了解决这个问题,我们和其他人探讨交付nsc的中枢神经系统(CNS)静脉注射(IV)和颅内注射(IC)和鼻内(在)吸入25- - - - - -27]。尽管IV-injected nsc本地化受损组织,他们显示有限的积累(即。,只有不到1%的注射nsc)在大脑中27,28]。第四nsc管理也可以触发不良免疫反应和其他系统性的并发症。IC nsc管理避免潜在的系统性反应(27),但它是侵入性的,低效的,昂贵的,而且可能会损害正常的大脑和地方患者更大的风险。四世固有的局限性和IC政府支持交付的评估,这是微创和可以重复执行23]。

当前研究的目的是确定是否IN-administered L-MYC-immortalized人类nsc (LM-NSC008细胞)积累在大脑受损的组织和促进认知的复苏大鼠创伤性脑损伤模型(6,29日- - - - - -31日]。为了实现这一目标,六个剂量的LM-NSC008细胞接种一次每隔一天开始一周后受伤或虚假手术成年鼠大脑皮层的影响,和模式的早期和晚期NSC迁移被评为收购验证莫里斯水迷宫空间学习的任务。研究结果表明,IN-delivered nsc迁移到小学和遥远的创伤性脑损伤的网站和促进空间学习的收购。NSC-based疗法可以交付,这是一个潜在的创伤性脑损伤后认知恢复的几种可行的替代品。如果这种治疗方法能够成功地翻译到诊所,将允许扩展,成本效益,相对无创性治疗创伤性脑损伤的患者。

2。材料和方法

2.1。主题

48成年男性Sprague-Dawley老鼠(Envigo,印第安纳波利斯)重300 - 350克当天手术成对被安置在树脂玻璃的笼子里随意食物和水,保持在一个温度( )和光-(0700 - 1900)控制环境。经过一个星期的适应环境,四个实验的老鼠被随机分配到一个组: ( ), (人血清白蛋白; ), ( ),和 ( )。额外10成年雌性大鼠体重250 - 275克当天手术包括使用反Nestin-specific抗体,可视化LM-NSC008包含IHC染色细胞在创伤性脑损伤的站点39天 ( ), ( ), ( ),和 ( )。创伤性脑损伤和虚假的手术程序,政府,和认知评估匹兹堡大学的机构批准的动物保健和使用委员会和生物安全委员会制度。

2.2。手术

控制大脑皮层的影响(CCI)损伤是如前所述6,8,9,29日,31日- - - - - -33]。简单地说,老鼠完全与启发异氟烷麻醉(4%的感应和2%的维护与2:1的比例N₂O, O₂),气管插管,机械地固定在一个立体框架,通风。坚持无菌技术,中线头皮切口暴露的头骨和颅骨切除术是在右半球前囱和λ之间的矢状面和冠状缝合高速牙钻。骨皮瓣切除,手术进一步扩大开放,以确保间隙的影响技巧(6毫米,平),集中,降低通过颅骨切除术,直到摸到硬脑膜。杆被收回,影响尖端先进的2.8毫米产生中度脑损伤组织变形在4米/秒(2.8毫米)。影响后,老鼠缝合,气管切开,急性神经功能的评估(弯曲和扶正反应),并允许自发恢复移动之前回到家里笼。温度保持在核心 加热毯。除了CCI虚假的控制进行了所有程序。

2.3。急性神经系统评估

戒烟后的后肢反射能力评估麻醉和删除从立体定位器轻轻挤压后爪老鼠的每5 s和记录时间引起戒断反应。复原的回归反射是由所需的时间将从仰卧的卧姿连续三次。这些神经损伤严重程度指数敏感因素6,8,9,33- - - - - -35]。

2.4。LM-NSC008细胞或阿明费

创伤性脑损伤或虚假的手术后1周开始,接种的老鼠 人类nsc (LM-NS008) 24μL汽车(阿明费)(2%人血清白蛋白)或VEH独自在术后7天,9,11,13,15日和17日。管理过程如前所示报道实现分布和细胞治疗的效果23]。皮下注射环孢菌素A(10毫克/公斤;阿尔法蛇丘,哈佛希尔,MA)管理日常所有大鼠在术后第五天开始持续时间的研究。

2.5。认知功能:采集空间学习和记忆的保留

收购空间学习是由莫里斯水迷宫(微波加工)学习任务已被证明是敏感的赤字后创伤性脑损伤(36- - - - - -40]。培训是每天进行术后天18 - 23。短暂,迷宫(直径180厘米的塑料池)是装满水( )28厘米的深度和位于一个房间视觉线索近年来显示在墙上。越狱平台是一个明确的树脂玻璃站(10厘米直径)放置2厘米低于水面和定位26厘米的边缘池西南象限为所有试验。学习收购由四个试验,随机放置到每个红衣主教的池从一个方向(北、东、南、西)。每个老鼠最多是120年代在每个试验发现水下平台。老鼠在规定时间内没有找到平台手动引导,放在平台上,在那里呆了30年代被移除之前和放置在一个变暖室(ThermoCare®,帕索罗伯斯,CA) 4分钟intertrial区间。4每日的均值为每个老鼠试验用于统计分析。

参与天24日提供了单个探头试验评估的记忆力。简而言之,在探测试验,平台从池中删除和老鼠在迷宫的位置点最远西南象限平台之前(即所在的位置。,目标象限),允许自由探索30年代的池。在目标象限百分比的时间被记录下来,用于统计分析。最后,探针试验后,水面上方的平台提高了2厘米,白色胶带缠绕在rim让它看到老鼠,控制等视力和非空间贡献感觉运动和动力性能。ANY-maze软件跟踪系统(Stoelting、木材Dale, IL)是用于自动记录所有数据,其中包括时间定位平台,在目标象限时间百分比,游泳速度。

2.6。生成和初级NSC文化的特征

隔离和传播胎儿大脑的神经干细胞和不朽L-MYC基因之前描述(41,42]。所有程序,包括干细胞隔离和传播进行下批准的城市希望机构审查委员会批准的协议(SCRO IRB # 10079, # 11002, IBC # 11016)。LM-NSC008细胞无血清培养系统在NSC介质(RHB-A介质;干细胞科学)补充10 ng / mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF), 10 ng / mL表皮生长因子(EGF)、2毫米谷酰胺(表达载体),Gem21 NeuroPlex血清补充(GeminiBio-Products, # 400 - 160)。bFGF和EGF添加每隔一天,媒体被完全改变了每7天。LM-NSC008细胞被修改使用慢病毒表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和美国(LM-NSC008.GFP.fLuc)可视化在活的有机体内荧光显微镜和大脑部分。

2.7。银行扩张LM-NSC008细胞创建主细胞

生成和表征LM-NSC008细胞稳定表达L-MYC一直先前描述(41]。细胞通道和长达50通道特征42]。短暂,LM-NSC008细胞扩展到主细胞银行使用量子细胞扩张系统(作秀的旅级战斗队)和冷冻的浓度 细胞CryoStore在液态氮(BioLife解决方案)。与PBS LM-NSC008细胞解冻,洗净,管理通过滴进老鼠轴承CCI使用以前优化协议或虚假的伤害(25,43]。

2.8。大脑组织清算(清晰)和LM-NSC008细胞的分布

老鼠收到过量戊巴比妥钠(i.p)在25天(早期的计算)或46天(计算末)手术后,然后用冰冷的灌注0.1磷酸盐PFA和固定的4%,和大脑是收获。大脑是准备厚(1毫米)部分使用acrylamide-based组织清算(清晰)44,45]。大脑切片,然后由共焦显微镜成像( - - - - - -轴分辨率)和检查由荧光显微镜LM-NSC008细胞的存在。

对于包含IHC,石蜡包埋的大脑部分被分为10μ米日冕部分和第五节都沾染了反巢蛋白抗体(微孔;猫# MAB5326, 1: 200稀释)的城市希望解剖病理学核心。大脑部分被处理抗原检索与蛋白酶K (Dako现成的猫# S3020)和过氧化物酶淬火解决方案中孵化(0.3% H₂O₂在100%的甲醇室温20分钟),然后在屏蔽解决方案(BlockAid 50%,表达载体B10710;50%的西方封锁试剂,罗氏应用科学11921673001;1% triton - 100 x)。部分被沾主要抗体阻断解决方案和孵化一夜之间在4°C,紧随其后的是几个洗PBS和反应与生物素化的二次抗体(1:250稀释,向量ba - 2001) 1 h如前所述[42]。部分被清洗和孵化avidin-biotin复杂(ABC)解决方案1 h在室温和在3 5分钟,3 - - - - - -diaminobenzidine (DAB)底物溶液含有0.25% H₂O₂。最后,大脑部分清洗和安装了Cytoseal 8安装媒体(richard allan科学)和成像。

2.9。清晰的图像分析

最大强度投影的光学切片的大脑部分使用ImageJ生成。背景减法进行50-pixel半径。由此产生的图像是手动阈值生成nsc的分布成像组织部分。组织切片的面具是使用的最大强度投影创建整个大脑。组织内分段nsc面具在MATLAB (MathWorks, MA)进行了分析。创伤性脑损伤的位置,重心是手动输入,每个像素的距离确定为国家安全委员会的一部分从创伤性脑损伤的质心计算。此外,基于组织的面具,每一个像素的距离最近的面具计算边缘组织。这些像素的分布从创伤性脑损伤的网站和组织提出的边缘直方图和累积分布函数。部分图片展示NSC的存在分别进行了分析评估NSC的创伤性脑损伤的距离站点(补充无花果。S1,S2)。为了这个目的,而不是每个像素,集群相互连接的像素距离创伤性脑损伤的网站进行评估。

2.10。统计分析

所有行为分析使用StatView 5.0.1 (Abacus概念Inc .,伯克利,CA)盲实验采集的数据。评估的空间学习进行重复测量方差分析(方差分析)。探测试验,可见平台,使用单因素方差分析和游泳速度进行了分析,如急性神经的结果(即。,后肢撤军反射时间和扶正反射次)。总体方差分析显示显著影响时,Newman-Keuls事后测试用于确定特定群体的差异。结果表示为 平均误差(S.E.M.)和被认为是重要的时候 。八大鼠(雄性)参与去世,因此,统计分析数据从40老鼠,最后组成的组: ( ), ( ), ( ),和 ( )。

3所示。结果

3.1。急性神经功能

没有观察两组随机差异 和 在后肢撤军反射经过短暂的爪子捏或停止后复原的回归反射麻醉( ;表1)。缺乏显著差异与这些急性神经指数表明,创伤性脑损伤的组织经历了同等程度的伤害。此外,没有观察之间的差异 和 大鼠急性神经结果( )。

3.2。在管理LM-NSC008细胞的空间分布

在脑实质内,使用共焦成像LM-NSC008细胞进行3 d成像光学清除1毫米厚的创伤性脑损伤后大脑部分在25岁和46天(分别为早期和后期时间点;数据1和2)。区域脑组织所反映出的方形盒被用于分析细胞集群的数量和距离LM-NSC008细胞迁移的创伤性脑损伤。在早期的计算,大多数LM-NSC008细胞在创伤性脑损伤的局部损伤光清除部分(数据1(一)S1,1(b)S2,1(c)S3),但在后来的计算(46),LM-NSC008细胞被发现在遥远的主要损伤(数据的网站2(一)S1,2(b)S2,2(c)S3,2(d)S4),这表明LM-NSC008细胞病变部位迁移之外,可能受损轴突束。

总LM-NSC008细胞分布在早期和后期时间点的数据进行了总结R10和R30,老鼠在天25 - 46,安乐死(图3)。量化LM-NSC008细胞分布是由测量距离的创伤性脑损伤的网站和脑表面。LM-NSC008细胞的位置显示,可以想象,IN-administered nsc神经元(嗅觉),血管或淋巴迁徙路线分配在蛛网膜下腔,然后输入大脑实质。

LM-NSC008细胞在创伤性脑损伤的现场调查,雌性老鼠的大脑被收获,固定,切片,染色组织学检查和包含IHC人类天巢蛋白39(图的可视化4)。LM-NSC008(人类Nestin-expressing)细胞衬里的边缘被发现受伤CCI网站(红色箭头),在大脑和脑实质内的边缘(数字4和无花果。S3红色箭头)。

3.3。收购的空间学习

空间学习数据的分析揭示了重要的集团( , )和天( , )的差异。的 小组学习水下逃生平台的位置(即。,获得空间学习)明显比 集团( )。时间定位可见平台也显著更长的时间 组相对于 和 组( ;数据未显示)。事后分析发现没有差异 和 组( ),都比 和 组( ;图5)。游泳速度之间没有差别组( 来 ; )。同时,组中没有观察到的差异百分比在目标时间象限探测器审判期间( ;数据未显示)。

4所示。讨论

这些数据表明,在人类LM-NSC008细胞在创伤性脑损伤后管理极大地提高了收购相对于VEH-treated创伤性脑损伤大鼠的空间学习和LM-NSC008细胞分布在受损的脑组织,在正常的大脑区域。,IN-administered LM-NSC008细胞存在于足够数量,提高认知是一个重大发现的可行性作为一个主要的障碍,和功效NSC-based疗法是确保足够数量的可行的细胞到达中枢神经系统的病变或受损的区域(23- - - - - -25,41]。研究表明,尽管IV-administered nsc可以穿过血脑屏障和本地化受损组织,他们表现出有限的大脑中积累(少于1%的注射nsc) [28]。第四nsc管理也会导致系统性并发症。IC nsc管理,同时避免潜在的系统性反应导致移植约5 - 15%的注射细胞(27),是侵入性的,昂贵的,而且可能会损害正常组织(46]。

几个团体努力设计和评估潜在的策略来有效地恢复受损的神经元网络和恢复认知功能(47,48]。然而,这些疗法发展一直受到有限的访问相关的人体组织和使用啮齿动物模型不完全概括人类大脑生理学(49]。此外,文化的方法来创建人类干细胞的方法已被开发,使用胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(万能)作为起始原料,则是最常见的(49- - - - - -51]。然而,使用万能时出现的挑战,包括遗传背景的差异和表型,这限制了它们的使用是可行的治疗方法(52- - - - - -54]。此外,必须被编程的细胞则分化成特定的细胞类型和这种编程可以不完整或错误,导致瀑样异质性,缓慢增长,贫穷或不完整的分化(55- - - - - -60]。然而,使用同种异体神经干细胞的力量(LM-NSC008)已经证明。LM-NSC008细胞可以进一步分化成不同的神经细胞,结合其他因素产生复杂的大脑结构包括血管,新的3 d synaptic-like连接文化和体内的开发从人类的ESCs(为),则(61年]。其他干细胞疗法治疗创伤性脑损伤的调查或其他神经退行性条件包括使用nsc来源于骨骨髓来源间充质干细胞,牙髓干细胞(DPSCs),胚胎干细胞或脐cord-derived间充质干细胞(62年- - - - - -75年]。的确,DPSCs已被证明是一个有利的干细胞能够分化成neuro-like细胞来源和使用的可能性DPSCs在神经退化中列出若干报告(76年,77年]。与LM-NSC008细胞显示创伤性脑损伤后认知利益当独自管理,其他NSC-based疗法产生显著改善行为只有在结合环境浓缩(EE)康复策略69年,70年,78年]。根据以往的联合疗法(72年)和LM-NSC008细胞的功效在最近的研究中,结合LM-NSC008细胞与EE加法制造创伤性脑损伤后可在协同工作或更大的好处比独自LM-NSC008细胞。

同时,在动物模型中,内源性nsc能够产生新的神经元和神经胶质细胞的地区的成年神经发生,比如subventricular区(SVZ)和齿状回(DG)的海马体62年,65年,79年]。Post-TBI干细胞招聘SVZ和DG表明固有的大脑试图损伤后的修复和再生,这可能会进一步由外生LM-NSC008管理细胞(66年,67年]。可以增强内源性神经发生外源性生长因子,VEGF,他汀类药物,和孕酮,但干细胞疗法可能会更有效地提高内源性神经发生整合到宿主组织以及提供营养支持(68年,72年,80年]。Gennai和其他人证明干细胞和祖细胞可以迁移到受伤的大脑区域和增殖,发挥保护作用可能通过细胞替代和释放抗炎和生长因子在临床前研究(81年]。而干细胞/祖疗法证明改进后创伤性脑损伤和中风在临床前和临床研究中,复苏的(s)的确切机制还不完善。一些研究报道体内迁移能力有限;然而,细胞疗法的好处已经清楚地表明在帕金森病模型46,82年]。需要进一步的研究来确定大脑修复发生通过细胞替换,免疫调节,或内源性组织修复机制83年]。

通过可视化LN-NSC008细胞原位,我们已经能够关联行为后果与nsc的存在伤害的网站。未来的研究应该扩大在这些发现通过评估策略来提高LM-NSC008细胞积累,包括计量模式。虽然不是评估在这项研究中,从我们实验室以前的工作表明,LM-NSC008细胞肿瘤发生的在活的有机体内(测试12个月在免疫缺陷小鼠),表明他们将安全作为治疗创伤性脑损伤(42]。关于可能的性别差异,我们实验室的初步数据显示,LM-NSC008细胞疗法的好处是等价的创伤性脑损伤后免疫抑制雌性老鼠(未出版)。

这些研究将有显著的平移影响通过提供一种给药途径(鼻内)微创比其他航线的干细胞管理和比现有方法更符合成本效益,因为它可以通过一个门诊,可以克服风险和障碍与目前政府的路线。因此,这些发现可能会增强信心的使用NSC疗法可能最终成为一个可行的治疗数以百万计的创伤性脑损伤的幸存者目前有几个选择治疗衰弱的运动和认知能力。

总体而言,当前的研究是第一个报告评估同种异体LM-NSC008细胞在创伤性脑损伤的地点分布在空间学习和后续改进。这些研究,如果扩大到其他神经退行性疾病,可以改变范式治疗创伤性脑损伤和其他疾病患者的中枢神经系统,提供一个非侵入性的方法,重复治疗。

5。结论

尽管先前的研究已经解决了IC和交付的蛋白质、生长因子、激素、小分子,细胞和干细胞治疗神经系统疾病或神经胶质瘤在啮齿动物中,这些研究不容易翻译给人类,而无需使用昂贵和耗时的临床前研究。我们所知,提出将首先开发一个定量模型研究人类大脑中同种异体NSC迁移后交货,会导致剂量和路由的优化和预测NSC交付。这些发现表明,在政府分配导致LM-NSC008细胞在创伤性脑损伤和遥远的创伤性脑损伤的CCI网站在老鼠模型中。LM-NSC008细胞分布导致改善认知能力的恢复,从而证明在交付的潜在效用LM-NSC008细胞治疗环境。这项工作还演示了使用组织清算和卷成像的可行性的评估LM-NSC008细胞迁移和分布在大脑中。这些措施将有助于优化剂量、时间和路线NSC-mediated细胞疗法的临床使用。

数据可用性

数据被广泛用于研究团体。

信息披露

内容是完全的责任作者,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由美国国立卫生研究院(赠款P30CA033572和R03 CA216142-01(毫克);HD069620、NS099674 NS084967, NS113810 (AEK);和NS094950 NS099683, NS110609(棒子));艾伯特和贝蒂萨基基金会(毫克);和UMPC康复研究所(玉米)。研究报告在这个出版包含执行工作的希望病理学核心支持由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的格兰特P30CA033572数量。作者承认城市希望病理学核心的专业技术和光学显微镜的核心,包括布莱恩·阿姆斯特朗和罗兰Quintanar。

补充材料

图S1:量化LM-NSC008细胞盒1 - 7在天内的25。(A)部分从25天邮报CCI (LM-NSC008s假色绿色,大脑中蓝色)。创伤性脑损伤部位右上象限(所示插图黑白图像)。(b - h)的细胞集群数量框1 - 7 ( - - - - - -轴)与LM-NSC008细胞迁移的距离从创伤性脑损伤的站点( - - - - - -轴)。图S2(ⅰ)的细胞簇量化每个象限1 - 9 ( - - - - - -轴)和距离LM-NSC008细胞迁移的创伤性脑损伤的网站一天46 post-TBI ( - - - - - -轴)。图S3:使用反Nestin-specific抗体,免疫组织化学染色观察LM-NSC008细胞在创伤性脑损伤的站点39天(雌性老鼠,冠状石蜡部分# 70)。(一)亮视场图像CCI受伤的网站,规模1000酒吧μm。(B, C, D) 10和20 x放大的左下区域CCI受伤的网站。用红色箭头LM-NSC008细胞是棕色和强调。100年规模的酒吧μ米和50μm,分别。(补充材料)

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