Interleukin-20充当Osteoclastogenesis和矫正运动的发起人

文摘

目标。从事常数self-remodelling骨头构成器官。成骨细胞和破骨细胞内稳态期间改造为整体骨骼状况作出贡献。正畸治疗是临床学科,涉及的调查和实现移动通过骨骼牙齿。机械力的应用到牙齿导致牙槽骨骨和骨之间的不平衡,导致牙齿运动。近年来包括免疫之间的串扰和骨骼系统,调节osteoclast-osteoblast体内平衡。白介素(IL) 20日,IL - 10的家庭成员,被认为是一种促炎因子的自身免疫性疾病,与骨质疏松疾病。然而,IL-20调节破骨细胞分化的机制和osteoclastogenesis激活尚不清楚。这项研究调查了在老鼠模型IL-20对破骨细胞分化的影响;体外研究潜在的分子机制,对矫正运动体内特定的影响。方法。体外分析,主要来源于巨噬细胞的大鼠骨(桥梁养护管理系统)是由Sprague-Dawley破骨细胞诱导的大鼠。桥梁养护管理系统被处理后的组合IL-20重组蛋白质、核、质粒,osteoclast-specific因子和信号通路蛋白的表达水平检测通过实时聚合酶链反应、免疫印迹和免疫荧光染色。体内分析,IL-20注入大鼠腹腔内腔后建立大鼠正畸牙移动(移动)模型。移动距离被ct机,他发现染色;蛋白质的表达水平是通过免疫荧光染色检测。结果。体外分析表明,低浓度的IL-20提升preosteoclast osteoclastogenesis和扩散。然而,高浓度的IL-20抑制BMM osteoclastogenesis和扩散。IL-20击倒减少破骨细胞的表达特殊标记,而IL-20过度增加破骨细胞表达的特殊标记。此外,IL-20调节破骨细胞分化的功能/ RANKL /通路。过度的IL-20可以显著上调RANKL-mediated破骨细胞和破骨细胞分化的具体表达式;此外,RANKL / NF -κB / NFATc1 IL-20作为下游信号分子。体内分析表明,移动速度IL-20腹腔内注射后显著增加;此外,机械应力传感蛋白明显激活。结论。IL-20增强osteoclastogenesis和osteoclast-mediated通过RANKL / NF -骨侵蚀κB / NFATc1信号通路。IL-20抑制可以有效地减少破骨细胞分化和减少骨吸收。此外,IL-20可以加速正畸牙齿移动和激活机械应力传感蛋白。

1。介绍

破骨细胞骨多细胞单元构成一个核心组成部分。他们在骨重建有至关重要的作用,是一个重要的角色在维护骨骼结构完整性和代谢能力1- - - - - -3]。骨骼的协调功能细胞受多种激素、生长因子、趋化因子和细胞因子,通过相互连接的信号网络,导致特定转录因子的激活和相应的靶基因(4]。NF-кB配体受体激活剂(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(csf)分泌和表达的各种细胞包括成骨细胞;这些关键因素在osteoclastogenesis和骨吸收5,6]。

在近年来的背景下,破骨细胞分化过程中细胞因子相声是收到越来越多的关注。许多研究表明,免疫细胞,如巨噬细胞和T细胞,分泌促炎细胞因子(如il - 1、il - 6、il - 10 IL-17,地震,il - 22生成时,IL-33,和肿瘤坏死因子),这是参与调停osteoclastogenesis [7- - - - - -13]。IL-20被认为是促炎因子的自身免疫性疾病;它还充当IL-10-related免疫调节分子(14]。值得注意的是,IL-20可以诱发滑膜成纤维细胞产生促炎的分子,包括TNF -α,il - 1β金属蛋白酶- 1,MMP-13, MCP-1。这种效应激活T细胞,单核细胞,树突状细胞,中性粒细胞,因此,导致组织和骨骼损伤(15,16]。研究表明,血清水平的中位数IL-20骨质疏松症患者和骨量减少209.5 pg / mL, 181.3 pg / mL,分别;然而,健康的人表现出血清中值水平的15.38 pg / mL。此外,使用鼠标反IL-20单克隆抗体保护(OVX)老鼠的骨质破坏,同时促进骨矿物质密度增加。这个抗体抑制IL-20-induced RANKL表达成骨细胞(17]。这些数据表明,IL-20可以抑制成骨细胞,促进破骨细胞的形成。IL-20是一个决定性因素在破骨细胞和成骨细胞分化之间的平衡。骨体内平衡是通过破骨细胞和成骨细胞的活动。另外,我们之前发现IL-20成熟成骨细胞有抑制作用的鼠标preosteogenic MC3T3-E1细胞(18]。这些发现证实了IL-20对破骨细胞分化和功能的影响。

矫正牙齿运动取决于协调周围骨质吸收和形成和牙周韧带组织。牙齿加载引起局部组织缺氧和流体流动,触发一个无菌炎症级联,最终导致破骨细胞吸收压缩和成骨细胞沉积的张力。矫正牙齿运动期间,osteoblastogenesis之间的不平衡和osteoclastogenesis是牙槽骨重建的基础和牙齿运动(19- - - - - -21]。我们假设,IL-20可以加速矫正牙齿的速度运动。

在这项研究中,我们调查了IL-20对破骨细胞分化和功能的影响通过RANKL / NF -κB / NFATc1信号通路。值得注意的是,IL-20RB击倒导致部分抑制IL-20促进破骨细胞分化的能力。尽管NF -的表达κB没有显著变化,TRAF6和NFATc1的表达水平显著降低。这些发现表明,IL-20影响破骨细胞分化调控TRAF6 / NFATc1信号通路。此外,体内分析表明IL-20可以显著提高牙齿的矫正运动,和IL-20的表达水平,陷阱,和YAP牙周韧带在牙齿进行矫正运动显著增加。

本研究证明了IL-20对破骨细胞的分化和功能的影响及其机制;它说明了IL-20RB是一个关键因素在IL-20对破骨细胞分化的影响,同时为实验提供重要信息的分析矫正运动。

2。材料和方法

2.1。细胞因子、试剂、抗体

重组鼠- csf和RANKL获得PeproTech(美国)和研发系统(美国),分别。重组鼠IL-20购买从中国生物公司(中国)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;高葡萄糖配方),胎牛血清的边后卫,磷酸盐(PBS)、青霉素和链霉素从英杰公司购买(美国)。红细胞(RBC)裂解缓冲从CWBIO购买(中国)。主要抗体GRB2、ERK NF -κ物,B,陷阱,CTSK TRAF6,我κK, p - 38从细胞信号技术有限公司(美国)。主要抗体RANKL、功能、MMP-9 NFATc1, IL-20 IL-20RB HIF -α,cxcr CCR7和VEGF-R2获得Abcam(美国)。

2.2。动物和动物伦理

前不久Sprague-Dawley老鼠( )获得中山大学动物实验中心和用于这项研究。老鼠被喂食,犀牛,杀死了依照规定的机构动物保健和使用委员会(IACUC)中山大学。所有实验协议是通过中山大学动物伦理和福利委员会(于中山- iacuc - 2018 - 000099,广州,中国)。

2.3。细胞隔离和文化

桥梁养护管理系统主要来源于巨噬细胞的大鼠骨()获得的股骨和胫骨还是Sprague-Dawley老鼠。BMM收集方法进行如前所述[22),小的修改。简单地说,每个大鼠的股骨和胫骨分离;然后,提取骨髓细胞。细胞在450 g离心5分钟然后resuspended红细胞裂解缓冲在冰上15分钟,使净化骨髓细胞。Resuspended细胞在500 g离心10分钟桥梁养护管理系统收集并去除红细胞表面。Resuspended细胞主要组成10%的边后卫和DMEM培养基(高葡萄糖配方),然后在湿润环境中培养5%的二氧化碳和37°C。文化的48小时后,不依从细胞收集和resuspended不完全培养基含有10%的边后卫和15 ng / mL - csf;细胞被镀在24-well板( 细胞/ 2 - 3天)诱导分化成preosteoclasts桥梁养护管理系统。诱导osteoclastogenesis,破骨细胞培养基换成了一个不完全培养基含有csf (30 ng / mL)和RANKL (50 ng / mL)在为期两天的间隔6 - 8天,直到破骨细胞分化和成熟。

2.4。细胞生存能力分析

细胞计数Kit-8试剂从Dojindo购买。短暂,preosteoclasts培养96 -孔板与不完全培养基补充与不同浓度的IL-20 (0.02 -100 ng / mL)。的吸光度测量在450 nm标(Tecan日出标、Tecan、瑞士)后1、3、5、7天的文化。

2.5。TRAP-Positive染色和骨吸收坑试验

在文化与csf和RANKL、成熟破骨细胞治疗在4%多聚甲醛和彩色酸性磷酸酶白细胞(陷阱)工具包(美国Sigma-Aldrich),按照制造商的协议。使用一个倒置显微镜(德国蔡司)TRAP-positive多核细胞的数量≥3核然后计算来确定osteoclast-like细胞的数量。观察成熟破骨细胞的骨吸收活动,培养了桥梁养护管理系统- csf和RANKL 24-well骨的测定表面多井板(美国康宁生命科学)涂上一层薄薄的无机三维晶体材料。经过6 - 8天的文化,一个坑形成化验了,和100年μL 10%的漂白剂的解决方案是添加到每个。细胞培养的漂白剂溶液在室温下10分钟。井用蒸馏水冲洗两次,被允许在室温下晾干2小时。使用一个倒置显微镜(蔡司),分析个人的坑坑或多个集群×5点进行放大。

2.6。存在分析

引物对从豆类和RiboBio购买,这个实验中使用的引物序列如表所示1。信使RNA提取总RNA快速净化设备(ES科学,中国),按照制造商的协议。评估中提取RNA浓度和质量进行使用NanoDrop nd - 1000分光光度计分析(美国NanoDrop技术)。PrimeScript™RT大师混合实时(完美)(豆类、日本)是用于逆转录产生互补。定量逆转录-聚合酶链反应(存在)进行SYBR®预混料交货Taq™(RNaseH + Tli)使用微安(豆类、日本)394 -反应板,光学条形码(热费希尔科学)QuantStudio 7 Flex实时PCR系统(应用生物系统公司™)。相对目标基因的mRNA表达计算使用2^−ΔΔCt和正常的表达方法GAPDH管家基因。

2.7。免疫印迹分析

细胞溶解产物是准备用冰冷的里帕裂解缓冲的蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(细胞信号技术)和上层清液进行进一步的实验。简单地说,等量(50μg)的蛋白质样本解决使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide 8%通过凝胶电泳,然后转移到一个止动剂®- p转移膜(美国微孔)。膜阻止了5% ( )牛血清白蛋白(BSA)在4°C过夜然后孵化初级和二级抗体的抗体。西方化学发光免疫反应性的视觉的止动剂™合衬底(微孔)。

2.8。小干扰RNA转染

骨骨髓来源的巨噬细胞与Cy3-conjugated小干扰RNA转染(siRNA)针对IL-20 IL-20RB,或由消极控制核。IL-20和IL-20RB-targeting siRNAs和消极控制核从RiboBio购买(广州)。核序列如表所示2和3。小干扰rna转染的混合物混合Lipofectamine 3000转染试剂(美国热费希尔科学)在无血清DMEM。老鼠被接种到six-well板桥梁养护管理系统( 细胞/)与不完全培养基。4 - 6小时后,细胞粘附;完全培养基被除去,细胞被洗两次与PBS然后孵化转染混合物6 - 8小时。孵化后,转染细胞与DMEM培养48小时内含有10%的边后卫。存在和免疫印迹分析进行如上所述。

2.9。质粒的提取和超表达IL-20

设计和合成的超表达基因序列被RiboBio执行。序列表提供细节4。一个超表达质粒提取大肠杆菌DH5α使用一个EndoFree马克西质粒工具包(Tiangen,中国),和它的浓度和质量测定使用NanoDrop nd - 1000分光光度计分析(NanoDrop技术)。质粒转染混合物混合Lipofectamine 3000转染试剂血清DMEM(热费希尔科学)。BMM文化和分析进行如上所述。测序的打击是克隆片段测序结果。下划线的部分序列克隆的目标序列,和上游和下游地区是矢量的序列帧。

CTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAAGCTGTAATACGACTCACTATAGGGATCCCAGGAATTCGCCGCCACCATGAGAGGCTTTCGTCTTGCCTTTGGACTGTTCTCCGTTGTGGGTTTTCTTCTCTGGACTCCTTTAACTGGGCTCAAGACCCTTCATTTGGGAAGCTGTGTAATCACTGCAAACCTACAGGCGATACAAAAGGAATTTTCTGAGATTCGGCATAGTGTGCAAGCTGAAGATGAAAATATCGACGTCAGGATTTTAAGGACGACTGAGTCCCTGAAAGACACAAAGCTTTCGGATAGGTGCTGCTTTCTCCGCCATCTAGTGAGGTTCTATCTGGACAGGGTGTTCAAAGTCTACCAGACCCCTGACCATCATACCCTGCGAAAGATCAGCAGCCTCGCCAATTCTTTTCTTATCATCAAGAAGGACCTCTCAGTCTGTCATTCTCACATGGCATGTCATTGTGGCGAAGAAGCAATGGAGAAATACAACCAAATTCTCAGTCATTTCACAGAGCTTGAGCTCCAGGCAGCCGTGGTGAAGGCTTTGGGGGAACTAGGCATTCTTCTGAGATGGATGGACTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTGGCC。

2.10。基因本体论(去)分析和路径分析

信使rna分析包括分析(http://www.geneontology.org),它提供了三种结构化网络描述基因产物属性定义的术语。值表示的意义去预测词浓缩mRNA列表,在那里 被认为是具有统计学意义。最充实的走在褶皱浓缩和富集得分在三组中被确认。通路分析也使用最新执行京都基因和基因组的百科全书KEGG数据库。这个功能分析允许识别的生物通路有显著差异表达mrna的浓缩。如上所述, 被认为是具有统计学意义。

2.11。建立大鼠正畸牙移动模型

老鼠常规麻醉后固定在仰卧位。我们使用专门设计的力施加装置,包括一个张力弹簧切小段,约5毫米,有两个0.1毫米直径结扎线张力弹簧的两端,而结束时被允许保持长连接和固定牙齿。左上颌第一磨牙和左上颌切牙是清洁和干燥。力装置的一端固定在上颌第一磨牙和绳索的一端通过上颌第一和第二磨牙之间的差距;当时收紧和削减。上颌第一磨牙然后用酒精清洗,干,用酸蚀刻剂治疗40秒。完整切除后蚀刻剂,树脂连着第一磨牙的近端表面然后用口服的涂布如下。结扎线之间的连接和拉簧包装防止装置放松;结束的结扎线也包装防止最终破坏老鼠的嘴。同时,少量的树脂是连着的咬合的表面摩尔加强记忆。 An orthodontic dynamometer was used to measure and record the position of the ligature wire at a tension of 50 g. The other end of the force device was then ligated and fixed to the maxillary central incisor, and the end was cut to prevent detachment of the device. Then, we used Micro-CT and HE staining to assess the rat orthodontic tooth movement model.

2.12。统计分析

所有的结果都表示为 ,和报告从至少三个实验获得的价值观。统计差异评估GraphPad棱镜软件,版本7.04,使用学生的 - - - - - -测试或单向方差分析与图基的事后分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。BMM扩散受到IL-20的浓度

IL-20是否会影响BMM扩散,我们与不同浓度的IL-20桥梁养护管理系统的治疗,使用一个CCK-8试验检测细胞增殖活动天1,3,5,7。我们发现一个IL-20 20 ng / mL的浓度足以促进BMM扩散(图1(一))。然而,IL-20浓度> 100 ng / mL BMM抑制扩散引起的。免疫印迹分析证实,在一个IL-20浓度20 ng / mL, BMM增殖信号因素(例如,GRB2,的兵,NF-κB)显著调节在破骨细胞分化早期(图1 (b))。使用相同的细胞治疗方法,我们管理的各种浓度的IL-20 M-CSF-induced preosteoclasts RANKL然后确定了破骨细胞数量和规模的陷阱染色后6 - 8天的细胞培养。我们发现一个IL-20 20 ng / mL的浓度导致显著增加的数量和大小TRAP-positive破骨细胞,与对照组相比,相反,一个IL-20 100 ng / mL的浓度显著降低的数量TRAP-positive破骨细胞(图1 (c))。此外,我们孵化M-CSF-induced preosteoclasts RANKL在骨的表面分析板处理各种IL-20浓度。使用骨吸收坑试验,我们发现一个IL-20 20 ng / mL的浓度显著增强骨吸收坑的大小,坑的大小相比其他组;然而,100 ng / mL的IL-20浓度导致骨吸收坑面积最小的变化(图1 (d))。这些结果表明IL-20监管osteoclastogenesis以剂量依赖性的方式和功能。

随后,我们对待M-CSF-induced preosteoclasts RANKL和IL-20 20 ng / mL的浓度6 - 8天。免疫印迹分析表明IL-20调制osteoclast-specific和骨吸收功能蛋白质的表达模式(例如,陷阱,CTSK和MMP-9)(数据1 (e)和1 (f))。确认IL-20在早期破骨细胞分化的影响,我们对M-CSF-induced preosteoclasts RANKL和IL-20 2 - 3天。免疫印迹分析显示标记基因的表达(例如,排名,CTSK,陷阱,ATP60,c-Fos用早期破骨细胞分化(数字)1 (g)和1 (h))。这些结果表明,在早期破骨细胞分化、低浓度的IL-20调节的表达排名和CTSK,而它表达下调的表达c-Fos;此外,高浓度的IL-20表达下调的表达排名,CTSK,ATP60。值得注意的是,IL-20没有影响陷阱表达式。这些结果表明,低浓度的IL-20早期促进破骨细胞分化。此外,陷阱是一个成熟破骨细胞的特异表达蛋白质;我们的结果表明,展品很少或没有表现在早期破骨细胞分化。

3.2。IL-20调制Osteoclast-Specific蛋白质的表达和功能提升Osteoclastogenesis通过/ RANKL /等级轴

使用TRAP-positive染色和骨吸收坑化验,我们发现IL-20 osteoclastogenesis和骨吸收能力的影响。细胞免疫组织化学分析证实IL-20的存在及其受体IL-20RB骨髓基质细胞(bmsc)和骨髓单核细胞(图2(一个))。这些结果提供了实验依据用siRNA击倒IL-20及其受体IL-20RB;它还提供了一个依据执行IL-20超表达与脂质体化验。功能/ RANKL /等级轴有各种细胞监管职能,但最著名的观点是破骨细胞分化上游信号通路。这生物轴调节破骨细胞分化通过功能和RANKL的拮抗作用8,10,23- - - - - -27]。调查是否IL-20可以通过功能/ RANKL /调节破骨细胞分化等级轴,我们构造了一个IL-20超表达质粒大肠杆菌DH5α然后转染质粒为桥梁养护管理系统。IL-20在桥梁养护管理系统的表达转染后检测到存在和免疫印迹(数字2 (b)和2 (c))。转染后细胞分化为破骨细胞,刺激和功能的表达模式,排名,RANKL使用中存在和免疫印迹(数据调查2 (d)和2 (e))。与对照组相比,级别和RANKL的表达水平显著增加IL-20进行靶向治疗组,而功能的表达水平显著降低;此外,RANKL /功能比显著增加。这些结果清楚地表明,增加表达IL-20可以调节RANKL的表达和功能,表明IL-20可以通过功能/ RANKL /调节破骨细胞分化等级轴。

3.3。去分析和路径分析后IL-20的超表达骨骨髓来源的单核细胞

上述结果表明,IL-20可以调节功能/ RANKL /等级途径促进破骨细胞分化。进一步调查IL-20在单核细胞和破骨细胞的影响,我们使用高通量转录组测序技术(RNA-seq)检测mRNA表达正常的桥梁养护管理系统之间的差异和IL-20-overexpressing桥梁养护管理系统。结果显示组之间的差异,表明IL-20 preosteoclasts超表达有显著影响(图3(一个))。火山图描述表明,与正常的桥梁养护管理系统相比,表现出桥梁养护管理系统IL-20-overexpressing 994显著调节基因和1203显著表达下调的基因(图3 (b))。去分析和路径分析进行评估的角色IL-20在生物过程中,细胞组件、分子功能,和途径。去分析表明IL-20超表达对单核细胞生物过程有强烈影响,影响主要集中在细胞免疫反应和刺激的细胞反应。值得注意的是,IL-20超表达在桥梁养护管理系统大大改变了他们对压力的反应,这意味着IL-20是重要的牵引和矫正牙槽骨重建(图3 (c))。KEGG分析表明IL-20超表达在桥梁养护管理系统有重大影响破骨细胞分化和趋化因子的交互。也有健壮的对关节炎发病机理的影响,下游破骨细胞分化途径诱导,RANKL和低氧诱导因子-α信号通路和细胞凋亡(图3 (d))。

3.4。IL-20监管RANKL-Mediated Osteoclastogenic下游信号转导

探索的机制IL-20调节RANKL-mediated破骨细胞分化、骨骨髓来源的单核细胞和核转染荧光染色显示转染效率高(图4(一))。存在和免疫印迹分析表明,核有显著的转染效率对目标基因(数字4 (b)和4 (c))。转染后,在不需抗生素的完全培养基培养的桥梁养护管理系统- csf和RANKL 3天。免疫印迹显示,与对照组相比,细胞IL-20超表达组表现出等级/ RANKL的激活下游信号在osteoclastogenesis效应器(如物,NF -κB, TRAF6,我κK NFATc1和p38)(图4 (d))。相比之下,小干扰rna抑制IL-20表达式显示收到的那组能显著抑制以上的信号通路;特别是,》κkα明显激活,表明抑制NF -κB信号通路。此外,我们使用核减少IL-20RB和培养细胞的表达不完全培养基含有20 ng / mL IL-20(图4 (d))。西方墨点法证明了我κK和NF -κB信号通路被激活,而物,TRAF6, NFATc1, p - 38通路(图4 (e))。IL-20类似抑制,抑制IL-20RB也抑制TRAF6 / NFATc1信号通路的激活;这表明关键IL-20受体,IL-20RB,可以调节破骨细胞分化信号通路的激活。

3.5。IL-20反馈调节BMSC参与Osteoclastogenesis通过功能/ RANKL /等级轴和下游信号转导

bmsc具有自我更新能力的细胞,能产生至少一种高度分化的子代细胞多向分化潜能;bmsc也能产生细胞因子参与免疫反应。bmsc分化成成骨细胞后,csf和RANKL可以分泌,这些因素可以诱导破骨细胞的形成5]。在这个实验中,我们使用核击倒IL-20及其关键受体IL-20RB bmsc;我们也使用诱导bmsc IL-20过表达质粒。转染后,伴着被不断培养48小时;然后我们收集和使用BMSC条件培养液(CM)培养的桥梁养护管理系统。荧光染色显示转染效率高(图5(一个))。免疫印迹分析表明,核有显著的转染效率对目标基因(数字5 (b)和5 (c))。免疫印迹分析骨骨髓来源的单核细胞经过3天的文化与BMSC厘米显示,与对照组相比,级别和RANKL的表达水平显著增加在桥梁养护管理系统培养IL-20-overexpressing BMSC厘米;此外,功能的表达显著降低功能和RANKL /比率显著增强(数字5 (d)和5 (e))。桥梁养护管理系统培养与BMSC CM处理IL-20 siRNA显示功能表达水平明显升高。此外,桥梁养护管理系统培养与IL-20-overexpressing BMSC厘米证明osteoclastogenesis激活下游信号通路介导的等级/ RANKL轴(例如,NF -κB和TRAF6通路);然而,p38和物通路没有激活。桥梁养护管理系统培养与IL-20 siRNA-treated BMSC厘米p38的差别表现出对这些TRAF6,物通路。这些结果表明,IL-20可能直接诱发preosteoclast分化为破骨细胞。此外,它的监管功能和RANKL的表达诱导bmsc和激活下游信号通路的激活的功能/等级/ RANKL轴osteoclastogenesis [28),从而间接促进preosteoclast分化为破骨细胞。

3.6。IL-20可以加速鼠矫正牙齿的速度运动

上述结果证实IL-20促进破骨细胞分化调节上游排名/ RANKL /功能通路和RANKL-mediated下游信号通路。“矫正运动”是一个独特的颚骨重建过程,主要体现通过张力端的骨形成和骨吸收在压缩方面。这种机制在口腔生物力学领域都得到了广泛的关注(29日]。调查IL-20是否能加速骨吸收和骨重建的老鼠,我们建立了一个老鼠矫正牙齿运动模型(图6 (e)),与上颌切牙为基础点,使用一个矫正治疗春季以一致的力量沿着第一摩尔(50克)。ct机的上颌骨显示,与对照组相比,之间的差距第一和第二磨牙移动组的增加;因此,横向和纵向部分第一磨牙移动组均可见(图6 (b))。他染色第一磨牙的横向平面显示的压缩一边磨牙牙周韧带是窄移动组比对照组(数字6 (d),6 (f),6 (h),6(我))。基于体外实验的结果,我们IL-20注入腹腔内腔的老鼠受到矫正力量。三天前造型,老鼠在移动+ IL-20组IL-20解决方案的速度40毫克/公斤体重。腹腔内注射进行每隔两天前3天的造型;第十天,老鼠是牺牲和ct机进行(图6(一))分析第一磨牙运动距离。相比之下,移动+汽车集团(图6 (c)),移动+ IL-20组更大的牙齿移动距离超过7天的接触类似的力量类似的持续时间(图6 (b));骨吸收也更大的移动+ IL-20组。这些发现表明IL-20加速骨折的形成和骨重建的速度。为了验证这个假说,double-labelling免疫荧光染色上颌第一磨牙牙周韧带的。结果表明,IL-20在牙周韧带的表达增加与IL-20注入矫正运动后,与对照组相比,此外,陷阱,YAP的表达水平也增加了集团IL-20注入(图6 (g))。陷阱是一个osteoclast-specific蛋白质,而狂吠是一种蛋白质,对机械应力。表达水平的增加IL-20接受矫正牙齿的牙周韧带运动暗示IL-20牙槽骨重建是很重要的。陷阱,YAP表达水平的增加在该地区附近IL-20表达式表明,尽管IL-20促进破骨细胞分化和加速骨重建,它还可以使牙周韧带细胞应对矫正力量的更强劲,进一步加速牙槽骨重建。

4所示。讨论

IL-20是一个强大的促炎、趋化因子和血管生成细胞因子il - 10的家庭。在慢性炎症性疾病(如牛皮癣、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎),IL-20已经表现出强劲的促炎,血管再生,也影响细胞的趋化作用[30.,31日]。IL-20家族细胞因子可以增强组织的改造和伤口愈合,维护组织的完整性,保持和恢复体内平衡的环境中感染和炎症(32]。一些研究表明,IL-20扮演重要的角色在骨质疏松和骨相关疾病;此外,在老鼠的骨质的研究表明anti-IL-20抗体可以防止骨吸收通过阻止破骨细胞形成和诱导成骨细胞的形成17,18]。因为突破osteoclastogenesis分子机制通过coculture系统包括综合和桥梁养护管理系统或T细胞,许多细胞因子和趋化因子参与骨重建和骨吸收已确定;这些包括肿瘤坏死因子-α、il - 1、il - 6、il - 10、IL-17和il - 22生成(33- - - - - -40]。

据报道一个IL-20受体(IL-20R)细胞因子表达的免疫细胞。IL-20R细胞因子可能相关慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制。一些研究表明,IL-20R细胞因子发挥抑制作用在调节免疫细胞,如先天和适应性的T细胞反应(41];因此,IL-20R细胞因子的功能和角色自身免疫是大概是复杂的。IL-20及其细胞因子家族分享三个受体(IL-20RA、IL-20RB IL-22RA1);因为滥交的I型(IL-20RA和IL-20RB异质二聚体)和II型(IL-20RAI和IL-20RB异质二聚体)受体,IL-20及其家人有一些独特的特性31日]。IL-20信号可以通过I型受体形成和II型受体形成,和两个受体形成共享的共同受体亚基IL-20RB [42]。因此,IL-20RB可能有重要影响细胞IL-20的角色。

我们用siRNA可拆卸的桥梁养护管理系统减少老鼠IL-20的表达,发现RANKL-induced osteoclastogenesis下降。然而,我们的研究结果表明,IL-20对破骨细胞分化和功能具有双重影响。低浓度的IL-20提升preosteoclast扩散和osteoclastogenesis,而高浓度的IL-20抑制BMM osteoclastogenesis和扩散。值得注意的是,与IL-20-overexpression转染质粒并没有导致抑制破骨细胞分化;相比之下,它激活RANKL-mediated osteoclastogenic下游信号通路,促进了破骨细胞分化。这些发现表明,IL-20结合两种受体复合物:IL-20R1 / IL-20R2和IL-22R1 / IL-20R2。两个heterodimeric受体复合物部分通过JAK / STAT信号通路。此外,IL-20受体结合激活STAT1和进入细胞。我们KEGG路径分析显示,这激活JAK / STAT信号通路和STAT1足以抑制破骨细胞分化抑制c-Fos和TRAF6。我们假定的增强表达IL-20 TRAF6 / NF -可以直接移植κB / NFATc1信号通路促进破骨细胞分化。

依照之前的发现,我们添加了重组IL-20蛋白质鼠撞倒了IL-20RB和cocultured桥梁养护管理系统。结果表明,NF -的表达κB是增加,尽管RANKL-mediated TRAF6 / NFATc1信号通路没有显著变化。因此,在缺乏IL-20RB IL-20并不影响破骨细胞分化。这些数据表明IL-20RB IL-20细胞功能的一个重要的影响。我们的发现表明IL-20RB提供了一个潜在的治疗骨质疏松症和骨质疏松症患者的目标,从而有效地抑制骨质流失。

Osteoblast-osteoclast沟通,由不同的分子,细胞因子和信号通路,对于骨体内平衡是很重要的。功能/等级/ RANKL轴是一个重要的信号通路在这种沟通,和IL-20 osteoblastogenesis之间的平衡是一个重要的监管机构和osteoclastogenesis [37,38]。研究表明,bone-associated免疫介质目标IL-20 MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞)和成熟的破骨细胞;此外,IL-20充当一个重要的监管机构的成骨细胞和破骨细胞功能通过激活/等级/ RANKL、破骨细胞信号通路中的核心元素(43,44]。在这项研究中,我们证实IL-20可以诱导bmsc调节功能和RANKL的表达,然后通过功能/ RANKL /等级影响osteoclastogenesis轴。随后,我们发现RANKL / TRAF6 / NF -κB和物/ p38 MAPK信号通路被激活破骨细胞分化中桥梁养护管理系统,在文化与CM IL-20-overexpressing bmsc。然而,RANKL / TRAF6 / NF -κB和物/ p38 MAPK信号通路在桥梁养护管理系统没有激活破骨细胞分化过程中,文化与IL-20厘米和IL-20RB击倒后综合。总的来说,我们的研究结果表明,RANKL和功能在bmsc内生IL-20引起时,支持监管反馈在破骨细胞分化的概念通过功能/ RANKL /等级轴。

“矫正运动”是应用程序适当的“生物力”的牙齿,牙槽骨,和下巴导致生理运动,从而纠正咬合不正(阻塞)畸形。成骨细胞和破骨细胞之间的失衡是齿运动的生物学基础和牙槽骨重建29日]。通过体外实验,我们澄清IL-20及其关键受体的影响,IL-20RB,破骨细胞分化和功能。此外,我们发现IL-20刺激bmsc参与破骨细胞形成的反馈调节功能/ RANKL /等级轴。此外,IL-20可以改变当地的免疫环境和影响破骨细胞分化。我们的体外研究结果暗示IL-20会影响矫正运动。使用齿运动的老鼠模型,我们IL-20溶液注入腹腔。值得注意的是,老鼠注射IL-20解决方案表现出显著增强牙齿移动速度和距离。这些发现表明,IL-20加速破骨细胞分化和牙槽骨重建的速度。通过double-labelling免疫荧光染色在矫正移动牙周韧带,我们发现IL-20在牙周韧带与osteoclast-specific蛋白密切相关,陷阱,和机械压力反应的蛋白质,狂吠。因此,IL-20可以促进破骨细胞分化和矫正牙齿的速度加速运动; it can also enable the periodontal ligament to better respond to the mechanical force of the load and accelerate the reconstruction of alveolar bone.

总之,我们发现IL-20可以不同调节破骨细胞形成和osteoclast-mediated骨吸收能力。IL-20作用于上游初生osteoclastogenesis微分调节通过调节功能/ RANKL /等级轴。此外,我们表明,IL-20可能激活功能/ RANKL /等级轴,我们揭示了一个涉及RANKL / NF -的可能的分子机制κB / NFATc1通路。使用IL-20 20 ng / mL的浓度,结合核转染减少IL-20RB的表达,IL-20关键受体,我们实现的部分抑制RANKL-mediated下游信号通路由IL-20监管。我们也使用高通量转录组测序证实,增强表达IL-20可以显著影响细胞免疫反应,刺激反馈,和细胞对压力的反应;这些影响是除了它在破骨细胞分化途径中的作用。我们的体内分析证实,IL-20可以促进破骨细胞分化,从而加速矫正牙齿的速度运动。此外,IL-20提升机械力反应蛋白质的表达,这可能使牙周韧带更有效地适应机械力加载和可以提高骨重建的速度。我们的研究结果表明,针对IL-20可能是一个有前途的治疗方法与骨质疏松疾病;它们还支持一个新的视角关于矫正运动的调查。

缩写

IL:	白介素
核:	小干扰RNA
信使rna:	信使核糖核酸
走:	基因本体论
KEGG:	京都基因和基因组的百科全书
移动:	矫正牙齿运动
存在:	实时定量聚合酶链反应
的边后卫:	胎牛血清
互补脱氧核糖核酸:	互补脱氧核糖核酸
PBS:	磷酸缓冲盐
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
OMEM:	Opti修改鹰介质
SD:	标准偏差
csf:	巨噬细胞集落刺激因子
排名:	受体的激活NF-кB
RANKL:	NF-кB配体的受体激活
CCK-8:	细胞计数kit-8
OverEx:	超表达
功能:	Osteoclastogenesis抑制因子
陷阱:	抗酒石酸酸性磷酸酶
CTSK:	组织蛋白酶K
MMP-9:	矩阵metalloprotein-9
加拿大皇家银行:	红细胞
伴着:	骨髓间充质干细胞
BMM:	骨髓来源巨噬细胞
里帕:	无线电免疫沉淀反应试验
sds - page:	钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳
BSA:	牛血清蛋白
IL-20RA:	20白介素受体α亚基
IL-20RB:	20白介素受体β亚基
IL-22RA1:	白介素22受体亚基α1
GRB2:	生长因子receptor-bound蛋白2
兵:	细胞外调节MAP激酶
物:	c-Jun n端激酶
TRAF6:	肿瘤坏死因子receptor-associated因子6
IKK:	κB的激酶抑制剂β
NFATc1:	核转录因子激活的T细胞1
- 38:	p38激酶
低氧诱导因子-α:	低氧诱导因子1α亚基
趋化因子受体CXCR4:	C-X-C主题趋化因子受体4
CCR7:	主题趋化因子受体7
VEGF-R2:	血管内皮生长因子受体2。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

杨曹、刘华盈元博大、仪陇AI设计实验。华盈元博大刘、仪陇AI和孟博文进行了实验。华盈元博大Liu宣太阳,Xi Chen联苯乙杨、电子狗Wu Chaoran傅,吴伊琳,Lei Gan收集和分析数据。华盈元博大刘、仪陇AI和杨曹写和修改了手稿。华盈元博大刘、仪陇AI和宣太阳co-first作者。

确认

本研究支持由广东省自然科学基金(批准号2017 a030313529),中国国家自然科学基金(批准号81970963),和广东金融基金高素质医院建设。

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