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Daigaku Hasegawa，Kana Hasegawa，Hiroshi Kaneko，Shinichiro Yoshida，Hiromi Mitarai，Mai Arima，Atsushi Tomokiyo，Sayuri Hamano，Hideki Sugii，Naohisa Wada，Tamotsu Kiyoshima，Hidefumi Maeda， ＂mest调节人牙周韧带干细胞的茎"，干细胞国际， 卷。2020， 文章的ID9672673， 15. 页， 2020． https://doi.org/10.1155/2020/9672673
mest调节人牙周韧带干细胞的茎
Daigaku Hafegawa.
，1
假名长谷川，2
Hiroshi金子，3.
Shinichiro吉田，1
Hiromi Mitarai.，4
梅Arima，3.
Atsushi Tomokiyo，1
柴里滨野，3.，5
秀树Sugii，1
和田直久，4
Tamotsu Kiyoshima，2
和
Maeda Hidefumi1，3.
1九州大学医院骨髓病学系，九州大学3-1-1，麦田，福冈812-8582
2九州大学牙科学院口头病理学系，福冈岛福冈812-8582
3.日本福冈市东区迈达西3-1-1号九州大学牙科科学院牙髓学和手术牙科系，邮编812-8582
4九州大学九州大学医院一般牙科，3-1-1张Maidashi，Higuoki-Ku，福冈812-8582
5九州大学牙科科学学院学院学院学报，张坤，福冈福冈812-8582
抽象的
牙周韧带（PDL）干细胞（PDLSCs）已被报告为牙周组织再生的有用细胞来源。然而，其中一个问题是难以获得足够数量的临床应用的PDLSCs，因为很少有PDLSC可以与供体的PDL组织分离。因此，我们旨在鉴定将人PDL细胞转化为干燥的细胞的特定因素。在该研究中，将人PDLSC线（2-14和2-23）的基因分析与具有低分分化电位（2-52）的细胞系（2-52）的细胞系进行比较的微阵列分析鉴定了印迹基因Mesoderm特异性转录物（最初）．在2-23个细胞的细胞质中表达最初物质。2-23细胞中siRNA的Mest敲低抑制干细胞标志物的表达，例如CD105，CD146，P75TR，N-Cadherin和Nanog;增殖潜力;和骨质细胞，脂肪细胞和软骨细胞的多草化能力。另一方面，在2-52个细胞中的最过度表达在2-52细胞中增强了干细胞标志物和相关标记的表达和多提化能力。此外，过表达2-52个细胞的Mest-过表达2-52个细胞从主轴形状的形态变化到类似于2-14和2-23细胞形态的干细胞状圆形。 These results suggest that MEST plays a critical role in the maintenance of stemness in PDLSCs and converts PDL cells into PDLSC-like cells. Therefore, this study indicates that MEST may be a therapeutic factor for periodontal tissue regeneration by inducing PDLSCs.
1.介绍
牙周韧带（PDL）是含有富含纤维的结缔组织，位于肺泡骨和水泥之间，覆盖齿根的牙根，这在牙齿支持中起重要作用以及营养，保护免受细菌攻击，感官输入，咀嚼的感官输入和稳态[1- - - - - -4]然而，在大多数情况下，深龋、牙周炎或创伤对PDL组织造成的严重损害会导致牙齿缺失，因为目前的治疗效果有限，很难恢复完全再生[5]．
先前的报告表明，人PDL组织含有体细胞干细胞[6]．将这些细胞称为PDL干细胞（PDLSC）不仅表达间充质干细胞（MSC）表面标志物，例如CD105和CD146 [6- - - - - -10.]但还有各种干细胞相关标记，例如P75NTR（神经嵴标记）[10.，11.]、N-cadherin(间充质干细胞标记物)[10.和NANOG(胚胎干细胞标记)[11.，12.]并具有自我更新的特性[7，13.]PDLSC在体外对成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞也显示出与MSC相似的多向分化能力[6，14.]并具有在体内生成牙骨质和PDL样组织的能力[6].其他研究报道，将自体PDLSCs移植到人和猪牙周缺损中可再生PDL组织[15.，16.]．因此，在组织工程技术中应用PDLSCs可能是再生牙周治疗的重要方法。然而，由于PDL组织中驻留干细胞的百分比非常低[17.]而PDLSCs的分离涉及到牙齿的拔除，因此很难稳定地获得足够的PDLSCs用于研究和临床应用。
因此，我们认为解决这些问题的一种方法是从PDL细胞中诱导干细胞群。之前，我们证明了信号素3A（semaphorin 3A）在人类PDL细胞中诱导MSC样特性[18.].Sema3A过表达的PDL细胞表现出向成骨细胞和脂肪细胞（但不是软骨细胞）分化的能力增强，尽管没有增加所有MSC标记物的表达。因此，我们试图在PDLSC中鉴定一种因子，以更有效地诱导MSC样特性。
在本研究中，我们旨在通过微阵列分析来鉴定这种因子，以比较三种不同性质的克隆细胞系的基因图谱。其中，2-14和2-23细胞强烈表达MSC表面标记物，如CD105和CD146，并在体外具有成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的多向分化能力[9- - - - - -11.]．相反，另一个细胞系2-52表示小于2-14和2-23个细胞的MSC表面标记，并且表现出有限的分化容量[18.]．我们的目的是确定在2-14和2-23细胞中比在2-52细胞中高表达的因子，并检查该因子是否能使人PDL细胞转化为干细胞样细胞。
2.材料和方法
2.1。细胞培养
克隆细胞系2-14、2-23和2-52是从异种永生化人PDL成纤维细胞系的极限稀释中获得的。异种永生化人PDL成纤维细胞系是通过将猿猴病毒40大T抗原和人端粒酶逆转录酶转导到人PDL细胞群中产生的，该细胞群具有与一名21岁女性的健康前磨牙分离，该女性曾前往九州大学医院拔牙[19.]细胞系1-17也是我们先前建立的永生化人PDL细胞系[20.]．2- 14,2 -23和1-17细胞在我们之前的研究中被报道为人pdlsc样细胞[9，10.，20.]．维持在最低必需培养基中的细胞(α.-MEM；Gibco BRL，纽约州格兰德岛），含10%胎牛血清（FBS；法国努艾莱生物西部）（10%胎牛血清/α.-MEM）在37°C、含5%CO的增湿大气中2用于所有实验。所有程序符合九州大学牙科教师研究伦理委员会进行。
２.２.成骨细胞的分化分析
细胞播种于 在10％FBS的24孔板（Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ）中的每孔井/α.-mem作为含有2 mm的控制介质（cm）或cmβ-甘油磷酸盐（密苏里州圣路易斯西格玛市），50 mg/ml抗坏血酸（日本京都纳卡莱特斯克）和 M dexamethasone (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) as osteoblastic differentiation medium (DM). Half of the medium was exchanged every 2 or 3 days. After 3 weeks of culture, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA; Merck Millipore) and then washed with distilled water and stained with Alizarin red S as described previously [9]。每个茜素红S阳性区域的面积在Biozero数字显微镜下成像（日本大阪凯恩斯）。3天后从每个培养物中分离总RNA。
2.3.成脂分化试验
种子细胞 24孔板（Becton Dickinson Labware）中的每孔每孔的细胞均以10％FBS培养/α.-存在0.5%时的MEM mM-甲基异丁基黄嘌呤（西格玛），0.5 μ.M氢化可的松(Sigma)， 60μ.M吲哚美辛(Sigma)和100μ.如前所述，M抗坏血酸（Nacalai）3周[9]通过油红O染色鉴定含脂脂肪细胞。3天后从每个培养物中分离总RNA。
2.4。软骨生分化测定
细胞悬浮液 每15个单元 ml聚丙烯管（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）在室温下离心 5分钟，细胞颗粒在完全软骨培养基中培养，具有10ng / ml重组TGF-β如前所述，3（R＆D Systems，MinNeapolis，Mn）4周[9].在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用4%PFA固定后，将细胞颗粒包埋在石蜡中并切片成5块 μ.m厚切片。进行Alcian蓝染色以鉴定软骨基质。3天后从每种培养物中分离出总RNA。
2.5. 流式细胞术分析
流式细胞术分析2-14、2-23和2-52细胞表面抗原的表达( 通过胰蛋白酶/EDTA消化制备成单细胞悬液，并在流式细胞仪缓冲液中重悬(R&D Systems)，与针对表面标记物的特异性抗体(10 mg/ml)或同型对照抗体(10 mg/ml)在冰上孵育45分钟。使用抗cd105 - pe和抗cd146 - pe抗体(eBioscience, San Diego, CA)和小鼠IgG-PE同型对照。用流式细胞术染色缓冲液清洗细胞，使用EC800细胞分析仪(Sony Biotechnology, Tokyo, Japan)进行分析。
2.6。半定量rt-PCR
在以下条件下，使用PCR热循环器骰子（日本志贺Takara Bio Inc.）中的铂Taq DNA聚合酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行PCR：94℃下2小时 然后在94°C下进行30分钟的适当循环次数 s、 适宜的退火温度为30℃ s、 72°C持续30分钟 s、 最后72°C持续7小时 最小底漆顺序、退火温度、循环次数和产品尺寸1型胶原（COL-1),牙周膜相关蛋白-1（PLAP-1),骨膜素（邮政)、甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH.)如表所示1．GAPDH.引物用作内标。在指数放大范围内进行所有PCR测定。PCR产物通过电泳分离2％琼脂糖凝胶（Seeex Me; Biowhittaker Molecular应用，ROCKLAND，ME）并在溴化乙锭染色后在紫外激发下拍摄。
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2.7.微阵列分析
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从2-14、2-23和2-52细胞中分离总RNA，并使用SV总RNA分离系统（Promega，Madison，WI）进行纯化。使用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）对RNA样品进行定量使用Experion自动电泳站（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA）检查RNA质量。使用安捷伦技术系统（Santa Clara，CA）的微阵列分析由九州大学创业实验室（日本福冈）的Cell Innovator，Inc.执行如下：使用低输入快速Amp标记试剂盒（安捷伦科技）扩增和标记cDNA，并与SurePrint G3人类基因表达微阵列杂交 v2（安捷伦科技）。使用生物导体应用程序预处理核心库包中的分位数算法对样本的原始信号强度（视为2-14 vs.2-52（compare1）和2-23 vs.2-52（compare2））进行标准化。
2.8.定量RT-PCR
用TRIzol试剂分离细胞总RNA，并从1 μ.g使用ExScript RT试剂盒（Takara）检测总RNA。总RNA用随机六聚体和ExScript RTase反转录15分钟 在42°C下培养2分钟，停止反应 在99°C时最小，然后是5 在5°C条件下，在以下条件下，使用SYBR Green II（Takara）在热循环骰子实时系统（Takara）中进行PCR：95°C，持续10分钟 s（初始变性），然后在95℃下进行40次循环，持续5小时 s和60°C，持续30分钟 s、 然后在95°C下进行15分钟的分离程序 s、 60°C持续30分钟 s、 温度为95℃，温度为15℃ s底漆顺序、退火温度、循环次数和产品尺寸p75NTR，n-cadherin.，NANOG，m，Cyclin D1.（CCND1),细胞周期蛋白E1（ccne1.),阿尔卑斯山，Osterix，PPARγ.，C / EBPα，2型胶原（COL-2),聚糖，COL-1，PLAP-1，邮政，及β肌动蛋白见表2．β肌动蛋白作为内部标准。计算靶基因表达量ΔΔCt值。
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2.9.蛋白质印迹分析
将细胞在含有50mM Tris-HCl（pH6.9; sigma）的缓冲液中裂解，2％十二烷基硫酸钠（SDS; Nacalai），6％2-巯基乙醇（Sigma）和10％甘油。蛋白质样品（20 μ.g） 进行4%-20%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到免疫印迹PVDF膜（Bio-Rad）上。膜用小鼠单克隆抗体处理-β-Actin抗体（Santa cruz生物技术）在1：1000或山羊多克隆抗组合抗体（Abcam）的稀释液，其稀释1：200，然后是生物素化的抗小鼠IgG（Nichirei Biosciences，Inc。，东京，日本或适当的抗山羊IgG（Nichirei）。在彻底洗涤膜之后，使用ECL选择Western印迹检测系统（GE Healthcare，Buckinghamire，UK）和图像量LAS 500（GE），可视化活性带。
2.10.免疫荧光染色
用4%PFA和0.5%二甲基亚砜（Wako）在PBS中固定细胞20分钟 PBS中2%BSA阻断1分钟后的最小值 h、 细胞培养1小时 h与稀释度为1的山羊多克隆抗MEST抗体（Abcam）混合 : 200或小鼠单克隆抗Ki67抗体（Invitrogen），稀释度为1 : 100，然后用PBS洗涤。然后将细胞培养1小时 h与Alexa Fluor 488结合的鸡抗山羊抗体（Invitrogen）在稀释度为1 : 细胞用PBS洗涤，然后用DAPI（Vector Laboratories，Burlingame，CA）复染。细胞骨架用Phalloidin四甲基罗丹明B异硫氰酸盐（Sigma）染色。细胞在Biozero数字显微镜下成像和分析。
2.11.小干扰RNA转染
在Sigma购买了针对比什最小干扰RNA（siRNA）和针对比例（任务siRNA）和非靶名对照siRNA（使命siRNA通用对照）。转染前一天，在含有10％FBS（10％FBS / OPTI-MEM）的OPTI-MEM（Invitrogen）中，将2-23个细胞接种在24孔板上。汇合30％-50％，用siRNA转染细胞。每个siRNA的二十个皮质米在50中 μ.l Opti-MEM与1μ.l在另一个50%溶液中预孵育Lipofectamine iMAX（Invitrogen） μ.l Opti MEM.将混合物培养20分钟 在室温条件下，加入10%FBS/Opti MEM，37°C，在含5%CO的增湿空气中进行细胞培养2.48岁以后 h、 将培养基替换为新鲜的10%FBS/α.mem。
2.12。WST-1增殖测定
细胞接种于96孔板(Becton) 10%FBS中的电池/井/α.-MEM培养24和48天 h、 根据制造商的说明，使用预混料WST-1细胞增殖分析系统（Takara）测量细胞增殖率 μ.l WST-1试剂添加到每个孔的培养基中。1 h、 一百 μ.从每个孔中收集1 l上清液，吸光度为450 使用微孔板阅读器（ImmunoMini NJ-2300；日本东京系统仪器有限公司）测量nm。
2.13。基因转染和分染克隆的建立
将人体mest cDNA的编码区（GenBank登录No.NM_002402.4）插入PCDNA3.1 / hygro（+）（Invitrogen）表达载体中。单独使用PCDNA3.1 / Hygro（+）或用PCDNA3.1 / Hygro（+）转染2-52个细胞，所述PCDNA3.1 / Hygro（+）使用Lipofectamine LTX和ROP试剂（Invitrogen）含有人类最终cDNA的编码区。这些被称为“2-52_empty”和“2-52_mest”。2-52-52-52-52-52-52-52克被视为对照。通过选择潮霉素（Invitrogen）建立2-52_empty和2-52mest细胞的候选克隆。通过定量RT-PCR和Western印迹分析评估稳定表达最初CDNA的克隆中最克隆的最佳表达水平。
2.14。统计分析
所有实验都是在三次或四次重复中进行的。值表示为 ．使用配对的学生进行统计分析 -测试。价值 被认为是统计学意义。
3.结果
3.1。通过微阵列分析鉴定mest
为了确定人类PDLSC的特异性因子，我们进行了微阵列分析，以比较三种人类PDL细胞系2-14、2-23和2-52的基因表达。2-52细胞呈梭形，而2-14和2-23细胞呈略圆的形状（图2）1(一))．2-14和2-23细胞具有成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的多向分化能力，而2-52细胞分化能力有限(图)1 (b)).2-14和2-23细胞高度表达MSC表面标记物，如CD105和CD146（图1 (c)及补充数字1a） ，以及干细胞相关标记物，如p75NTR，n-cadherin.，及NANOG(图1 (d))而2-52细胞表达的干细胞标记物少于2-14和2-23细胞。此外，2-14和2-23细胞表达PDL相关基因，如COL-1，PLAP-1，及邮政，表达高于2-52个细胞（图1（e）)．从这些结果中，我们定义了2-14和2-23个细胞作为人类PDLSC线。基于微阵列分析的结果（2-14与2-52和2-23与2-52），我们选择了在人类PDLSC系中高度表达的分子并关注最初的原种（图1（f）)．
（一种）
（b）
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。Mest在人类PDLSC线中的表达
微阵列分析显示2-23细胞中MEST的表达水平高于2-52细胞（图2(一个)).定量RT-PCR证明m基因在不仅2-14和2-23个细胞中高度表达，还具有1-17个细胞（图2（b）)．此外，Western印迹分析表明，2-23个细胞中最初蛋白质的表达水平高于2-52个细胞（图2（c）)此外，免疫荧光染色显示MEST在2-23细胞中表达，并且MEST在2-23细胞中的表达水平高于在2-52细胞中的表达水平（图2（d）和2（e）)．这些结果表明，Mest在人PDLSC中高度表达。
（一种）
（b）
(c)
(d)
(e)
3.3。最初敲低抑制2-23细胞中干细胞标记物和增殖潜力的表达
为了评估MEST在人类PDLSCs中的作用，我们检测了siRNA下调MEST对干细胞样特性的影响，如干细胞标记物的表达、增殖潜能和多分化能力。定量RT-PCR和western blot分析证实了MEST mRNA的表达(图3（a））和蛋白质（图3（b））在2-23细胞中，通过用最粒定值的SiRNA治疗48小时。流式细胞术分析证明了MSC表面标记的表达，例如CD105和CD146，在与阴性对照siRNA（2-23_sicont）相比用Mest siRNA（2-23_simest）转染的2-23个细胞中的2-23个细胞中较低3（c）及补充数字1b）。此外，表达干细胞相关标记，例如p75NTR，n-cadherin.，及NANOG，在2-23个细胞中也被最初敲低下调（图3（d）)。使用WST-1增殖试验检测MEST敲除对2-23细胞增殖潜能的影响。我们发现MEST敲除显著降低2-23细胞的增殖率（图3（e）)．此外，我们检查了与细胞周期相关标记的基因表达CCND1和ccne1.与2-23_-siCont细胞相比，2-23_-siMEST细胞中两种基因的表达水平均下调（图3（f）)此外，与2-23_-siMEST细胞相比，免疫荧光染色显示2-23_-simect细胞对Ki-67呈阳性，Ki-67是一种典型的增殖标记物（图3（g）)这些结果表明MEST基因敲除抑制人PDLSC的增殖潜能。
（一种）
（b）
(c)
(d)
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(f)
（g）
3.4.MEST敲除抑制2-23细胞的多向分化能力
接下来，我们研究了MEST基因敲除对2-23细胞多分化能力的影响。在成骨细胞分化培养基中培养的2-23μS细胞的茜素红S阳性面积小于2-23μS细胞（图1）4（a）)此外，骨相关基因的表达水平，如阿尔卑斯山和Osterix(图4（b））在成骨细胞分化培养基中培养的2-23℃细胞显着降低于2-23℃细胞。类似地，脂肪分化介质中2-23℃的油红色O阳性面积小于2-23°C细胞（图4（c）)，以及脂肪细胞相关基因的表达水平，如PPARγ.和C / EBPα(图4（d）)，在2-23_-siMEST细胞中显著低于2-23_-siCont细胞。此外，2-23_-siMEST细胞在软骨分化培养基中的阿尔辛蓝阳性软骨基质小于2-23_-siCont细胞（图1）4（e）)，以及软骨细胞相关基因的表达水平，如COL-2和聚糖(图4（f）)这些结果表明，MEST基因敲除抑制了人PDLSC的多向分化能力。
（一种）
（b）
(c)
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3.5.MEST过度表达在2-52细胞中诱导PDLSC样特性
接下来，为了研究MEST对人PDL细胞干细胞样特性的影响，我们建立了稳定表达MEST的2-52细胞，并将其转染编码人MEST的载体，称为2-52_MEST细胞。与转染空载体term的2-52细胞相比，2-52_MEST细胞表达高水平的MEST基因和蛋白质ed 2-52_空细胞。2-52_MEST细胞中MEST基因和蛋白质的表达水平高于2-52_空细胞中的表达水平，与2-23细胞中的表达水平几乎相同（图5（a）和5（b）)我们发现MSC表面标记物的表达，如CD105和CD146（图5（c）及补充数字1c）和干细胞相关标记，如p75NTR，n-cadherin.，及NANOG(图5（d）)在2-52μMEST细胞中的表达高于2-52μ空细胞COL-1，PLAP-1，及邮政，在2-52μMEST细胞中也高于2-52μ空细胞（图5（e）)．2-52_MEST细胞的成骨、成脂、成软骨分化能力高于2-52_empty细胞，与2-23细胞基本相同(图)6（a）- - - - - -6 (f))．此外，有趣的是，2-52mest细胞从主轴形状表现出与类似于2-23个细胞的干细胞状圆形的形态变化（图7(一)- - - - - -7（d）)这些结果表明MEST的过度表达在人PDL细胞中诱导PDLSC样特性。
（一种）
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（一种）
（b）
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4。讨论
在本研究中，使用siRNA进行的功能丧失分析表明，MEST在PDLSC的干细胞维持中起着关键作用，而使用基因转移进行的功能获得分析表明，MEST可能将PDL细胞转化为PDLSC样细胞。这是第一份证明MEST是调控PDLSC的候选因子的报告延迟人类PDLSC的干细胞。
首先，我们通过微阵列分析确定了在人类PDLSC细胞系中高度表达的因子，并重点研究了MEST。MEST是一种在胚胎发育中起重要作用的印迹基因[21]．印迹基因影响干细胞的所有方面，从建立到分化[22]．以前的报道已经检测到成年体细胞中的印迹基因表达，并表明基因组印记可以是多能性的标志物[23，24]在我们的研究中，MEST在包括2-14、2-23和1-17在内的多个人类PDLSC株系中高度表达。这些发现表明，包括MEST在内的印迹基因在人类PDLSC中可能很重要。此外，我们发现，MEST的敲除抑制了人类PDLSC中的几种干样特性。这一发现证实了MEST可能在PDLSC中发挥重要作用在PDLSCs的干细胞维持中起着关键作用。迄今为止，还没有关于调节PDLSCs干细胞的因子的报道。我们目前的研究表明MEST可能是调节PDLSCs干细胞的一种新因子。此外，研究结果表明MEST可能诱导干细胞样细胞。
此前，已将自体PDLSCs移植到人和猪牙周缺损中，以再生PDL组织[15.，16.]．此外，在牙科干细胞中，PDLSCs被认为是最适合牙周组织再生治疗的细胞[25，26]因此，我们研究了一种获得足够数量PDLSC用于临床应用的方法。到目前为止，作为一种获得PDLSC的方法，通常将其从拔牙中分离出来[6]．然而，从一个患者的提取齿获得的PDLSC的数量非常小[17.]因此，作为一种替代方法，我们考虑是否可以从PDL细胞群中存在的非干细胞诱导PDLSC。
乌洛代尔两栖动物，如蝾螈，通过将成熟细胞去分化为未分化细胞来再生被截肢的四肢和尾巴[27]．此外，有报道称，顶培养可诱导成熟脂肪细胞脱分化为类似msc的多能细胞[28]．其他报告显示，用逆转素治疗可诱导肌肉定向细胞向多能祖细胞去分化[29]．然而，这种结果尚未在PDL细胞中报道。在我们最近的研究中，我们建立了一种方法，通过转移一个在人PDLSC系中高表达的基因，将人PDL细胞去分化为PDLSC样细胞。此前，我们发现Sema3A可将2-52细胞转化为MSC样细胞，表达MSC表面标记物，具有成骨细胞和脂肪细胞的分化能力[18.]然而，这些细胞不表达PDL相关基因。据报道，PDL衍生的干细胞样细胞同时表达干细胞相关标记物和PDL相关基因[6，9，10.，20.，30.]在我们目前的研究中，我们通过过表达干细胞相关标记物和PDL相关基因诱导PDLSC样细胞m基因。到目前为止，还没有PDLSCs通过单基因转移同时表达干细胞相关标记和pdl相关基因的报道。此外，这些细胞的形态由梭形转变为圆形，与人类PDLSC细胞系相似。这些结果表明，MEST可诱导更适合牙周组织再生治疗的pdlsc样细胞。
总之，该研究表明，MEST可以使得能够获得足够数量的临床应用的PDLSC，并且可以是具有有效再生PDL组织的电势的新因素。
5.结论
MEST是一种印迹基因，在人PDLSC细胞系中高度表达。然后，MEST敲除抑制干细胞标记物的表达，抑制人PDLSC细胞系中成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的增殖潜能和多向分化能力。另一方面，MEST过表达诱导PDLSC样特性，如作为干细胞标记物和PDL相关标记物的表达、人PDL细胞的多向分化能力和PDLSC样形态。总之，本研究表明MEST在PDLSC的干细胞维持中起着重要作用，并有可能将PDL细胞转化为干细胞样细胞。因此，MEST可能是具有高效再生PDL组织潜力的新因子。
数据可用性
所有用于支持本研究结果的数据均包含在本文中。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
致谢
我们感谢野津博士、伊藤山博士、大野博士、藤野博士、伊波希博士、山下博士、沙夫万博士、Adachi博士、加多瓦基博士、杉原博士和阿纳斯博士对本研究的大力支持。我们要感谢九州大学医学研究生院研究支持中心。我们还感谢来自Edanz集团的米切尔·阿里科博士(http://www.edanzediting.com/ac.)本研究由日本科学促进会和Qdai跳跃研究项目（项目编号30242）的JSPS KAKENHI（项目编号：JP23689077、JP15H05023、JP15H06487、JP16K20458、JP17H01598和JP19K19002）资助来自九州大学学术研究和产业合作管理办公室。
补充材料
补充图1:流式细胞分析MSC表面标记物平均荧光强度的定量。(a - c) 2-14(灰柱)、2-23(黑柱)和2-52细胞(白柱)中CD105和CD146的平均荧光强度定量值如(a)所示。(黑色栏)或siMEST_#1(黑白条纹栏)显示在(b)。2-52_empty(白色栏)，2-52_MEST(黑白条纹栏)，和2-23 cells(黑色栏)显示在(c)。（补充材料）
工具书类
- M. Shimono, T. Ishikawa, H. Ishikawa等，“牙周再生的调节机制”，显微镜研究与技术，第60卷，第5期，第491-502页，2003年。浏览：出版商的网站|谷歌学者
- P.M.Bartold、C.A.McCulloch、A.S.Narayanan和S.Pitaru，“组织工程：基于分子和细胞生物学的牙周再生新范式，”牙周病学2000，卷。24，不。1，pp。253-269,2000。浏览：出版商的网站|谷歌学者
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