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SCI

干细胞国际

1687 - 9678 1687 - 966 x

Hindawi

10.1155 / 2020/9672673

9672673

研究文章

最高明的调节人类牙周韧带的具备干细胞干细胞

https://orcid.org/0000 - 0002 - 2593 - 5633 长谷川

Daigaku

长谷川

假名

² 金子

Hiroshi

³ 吉田

Shinichiro

¹ 御手洗

Hiromi

⁴ 华宇电脑

梅

https://orcid.org/0000 - 0002 - 1638 - 4008 Tomokiyo

Atsushi

Hamano

百合

³ ⁵ Sugii

秀树

¹ 和田

Naohisa

⁴ Kiyoshima

Tamotsu

² Maeda

Hidefumi

¹ ³ Rodriguez-Lozano

Francisco J。

^{1

牙髓部

九州大学医院

九州大学

3-1-1 Maidashi

Higashi-ku

福冈812 - 8582

日本

kyushu-u.ac.jp} ^{2

美国口腔病理学

牙科学院科学

九州大学

3-1-1 Maidashi

Higashi-ku

福冈812 - 8582

日本

kyushu-u.ac.jp} ^{3

牙髓和牙科手术

牙科学院科学

九州大学

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Higashi-ku

福冈812 - 8582

日本

kyushu-u.ac.jp} ^{4

一般牙科分工

九州大学医院

九州大学

3-1-1 Maidashi

Higashi-ku

福冈812 - 8582

日本

kyushu-u.ac.jp} ^{5

OBT研究中心

牙科学院科学

九州大学

3-1-1 Maidashi

Higashi-ku

福冈812 - 8582

日本

kyushu-u.ac.jp}

2020年

8 7 2020年

2020年 29日 11 2019年 02 03 2020年 19 03 2020年 8 7 2020年

2020年

这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

牙周韧带(PDL)干细胞(PDLSCs)已报告作为一个有用的牙周组织再生的细胞来源。然而,的一个问题是很难获得足够数量的临床应用因为很少PDLSCs PDLSCs可以隔绝PDL组织捐助者。因此,我们旨在确定一个特定的因素,将人类PDL细胞转化为干细胞样细胞。在这项研究中,微阵列分析比较人类的基因档案PDLSC线(2 - 14和2-23)与细胞与低分化潜能(2-52)识别印迹基因mesoderm-specific成绩单(最高明的)。最高明的是2-23细胞的细胞质中表达。击倒的最高明的siRNA 2-23细胞抑制干细胞标记物的表达,比如CD105, CD146, p75NTR, N-cadherin, NANOG;的增殖潜力;和multidifferentiation能力对成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。另一方面,过度的最高明的2-52细胞增强干细胞标记物的表达和PDL-related标记和multidifferentiation能力。此外,MEST-overexpressing 2-52细胞表现出形态的变化从一个轴形状干细胞的圆形,类似于2 - 14和2-23细胞的形态。 These results suggest that MEST plays a critical role in the maintenance of stemness in PDLSCs and converts PDL cells into PDLSC-like cells. Therefore, this study indicates that MEST may be a therapeutic factor for periodontal tissue regeneration by inducing PDLSCs.

九州大学

30242年

日本促进社会科学

JP19K19002

JP16K20458

JP15H06487

JP23689077

JP15H05023

JP17H01598

1。介绍<gydF4y2Ba/title> <p>牙周韧带(PDL)是一种富含纤维结缔组织位于牙槽骨和牙骨质齿根之间,扮演着重要的角色在牙齿的支持以及营养、防止细菌攻击,咀嚼的感觉输入,体内平衡(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B1"> 1<gydF4y2Ba/xref>- - - - - -<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B4"> 4<gydF4y2Ba/xref>]。然而,在大多数情况下,造成的严重损害自由人民党的组织深龋,牙周炎或创伤导致牙齿脱落,因为目前的治疗效果有限,很难恢复完整的再生(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B5"> 5<gydF4y2Ba/xref>]。<gydF4y2Ba/p> <p>先前的报道表明,人类自由人民党的组织包含成体干细胞(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B6"> 6<gydF4y2Ba/xref>]。这些细胞称为PDL干细胞(PDLSCs)不仅表达间充质干细胞(MSC)表面标记,如CD105和CD146 [<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B6"> 6<gydF4y2Ba/xref>- - - - - -<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B10"> 10<gydF4y2Ba/xref>),而且各种干细胞相关标记,如p75NTR(神经嵴标记)<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B10"> 10<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B11"> 11<gydF4y2Ba/xref>),N-cadherin(间充质干细胞标记)<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B10"> 10<gydF4y2Ba/xref>],NANOG(胚胎干细胞标记)<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B11"> 11<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B12"> 12<gydF4y2Ba/xref>)和具有自我更新属性(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B7"> 7<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B13"> 13<gydF4y2Ba/xref>]。PDLSCs还显示一个multidifferentiation成骨细胞的能力,脂肪细胞,软骨细胞在体外与msc (<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B6"> 6<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B14"> 14<gydF4y2Ba/xref>)和拥有的能力来生成牙骨质,PDL-like体内组织(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B6"> 6<gydF4y2Ba/xref>]。其他的研究报道,移植自体PDLSCs进入人类和猪牙周缺损再生PDL组织(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B15"> 15<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B16"> 16<gydF4y2Ba/xref>]。因此,它被认为在组织工程中使用PDLSCs技术可能是一个关键的方法再生牙周治疗。然而,由于居民自由人民党的组织干细胞的比例是很低的<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B17"> 17<gydF4y2Ba/xref>)和隔离PDLSCs需要拔牙,已经很难获得足够的稳定PDLSCs研究和临床应用。<gydF4y2Ba/p> <p>因此,我们认为解决这些问题的一个方法是诱导干细胞的数量由PDL细胞。以前,我们表明,semaphorin 3 (Sema3A)诱发MSC-like属性在人类PDL细胞(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B18"> 18<gydF4y2Ba/xref>]。Sema3A-overexpressing PDL细胞表现出增强的能力分化为成骨细胞和脂肪细胞,但不是软骨细胞,虽然没有增加表达的MSC标记。因此,我们试图确定一个因素更有效地PDLSCs诱导MSC-like属性。<gydF4y2Ba/p> <p>在这项研究中,我们旨在确定这样一个因素通过微阵列分析比较基因资料在三个克隆细胞系具有不同的属性。其中,2 - 14和2-23细胞的强烈表达MSC表面标记,如CD105和CD146,拥有multidifferentiation能力对成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞体外(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B9"> 9<gydF4y2Ba/xref>- - - - - -<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B11"> 11<gydF4y2Ba/xref>]。相反,另一个细胞系,2-52,表达了MSC不到2 - 14和2-23细胞的表面标记和展品分化能力有限<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B18"> 18<gydF4y2Ba/xref>]。我们旨在识别的因素比在2 - 14和2-23细胞中高度表达2-52细胞并检查是否这个因素使人类PDL细胞转化为干细胞样细胞。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2"> <title>2。材料和方法<gydF4y2Ba/title> <sec id="sec2.1"> <title>2.1。细胞培养<gydF4y2Ba/title> <p>克隆细胞株2 - 14,2-23 2-52得到的极限稀释异构永生的人类自由人民党纤维母细胞线。异构永生的人类自由人民党纤维母细胞是由传导与猴病毒40大t抗原和人类端粒酶逆转录酶在人类PDL细胞群是孤立的21岁的女性健康的前磨牙的参观了九州大学医院提取(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B19"> 19<gydF4y2Ba/xref>]。细胞株1卷也是一个不灭的人类自由人民党细胞系,我们之前建立(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.<gydF4y2Ba/xref>]。2 - 14,2-23 - 17细胞被报告为人类PDLSC-like细胞在我们先前的研究[<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B9"> 9<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B10"> 10<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.<gydF4y2Ba/xref>]。细胞中维护alpha-minimum基本介质(<gydF4y2Baitalic> α<gydF4y2Ba/italic>mem;Gibco-BRL大岛,纽约)含10%胎牛血清(的边后卫;擤鼻涕、Nuaille、法国)(10%的边后卫/<gydF4y2Baitalic> α<gydF4y2Ba/italic>mem)在37°C在湿润的气氛中有5%的公司<gydF4y2Basub>2<gydF4y2Ba/sub>被用于实验。所有程序都执行符合研究伦理委员会的九州大学牙科学院。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>2.2。成骨细胞的分化分析<gydF4y2Ba/title> <p>细胞被播种在<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M1"> <mml:mn> 2<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ×<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞每在24-well板块(实验室的器具,正欲林肯公园,NJ)在10%的边后卫<gydF4y2Baitalic> α<gydF4y2Ba/italic>mem控制介质(CM)包含2毫米或厘米<gydF4y2Baitalic> β<gydF4y2Ba/italic>甘油磷酸酯(σ,圣路易斯,密苏里州),50毫克/毫升抗坏血酸(Nacalai Tesque,京都,日本),和<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M2"> <mml:mn> 1<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ×<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> −<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 7<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>M地塞米松(默克密理博,达姆施塔特,德国)作为成骨细胞的分化培养基(DM)。一半的交换媒介是每2或3天。经过3周的文化,这些细胞被固定在4%多聚甲醛(PFA);默克密理博),然后用蒸馏水洗净,沾染了茜素红S如前所述<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B9"> 9<gydF4y2Ba/xref>]。每个茜素红S-positive区域的面积是Biozero数码显微镜下成像(日本基恩士,大阪,日本)。总RNA从每个文化3天后被隔离。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>2.3。脂肪形成的差异化分析<gydF4y2Ba/title> <p>种子细胞在<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M3"> <mml:mn> 2<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ×<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞每在24-well板块(实验室的器具正欲)在10%的边后卫/培养<gydF4y2Baitalic> α<gydF4y2Ba/italic>mem的0.5毫米methylisobutylxanthine(σ),0.5<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>M氢化可的松(σ),60<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>吲哚美辛(σ),100年<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>M抗坏血酸(Nacalai) 3周如前所述<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B9"> 9<gydF4y2Ba/xref>]。Lipid-containing脂肪细胞被油红O染色鉴定。总RNA从每个文化3天后被隔离。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.4"> <title>2.4。Chondrogenic分化分析<gydF4y2Ba/title> <p>细胞悬浊液<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M4"> <mml:mn> 2。5<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ×<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞每15毫升聚丙烯管(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)离心机<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M5"> <mml:mn> 150年<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ×<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mi> g<gydF4y2Ba/mml:mi> </mml:math> </inline-formula>5分钟,细胞颗粒是培养与10 ng / ml完全chondrogenic媒介重组TGF -<gydF4y2Baitalic> β<gydF4y2Ba/italic>3(研发系统、明尼阿波利斯、MN)如前所述[4周<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B9"> 9<gydF4y2Ba/xref>]。修复后4%的PFA磷酸盐(PBS),细胞颗粒嵌入在石蜡和分为5<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米厚片。阿尔新蓝染色进行识别一个软骨矩阵。总RNA从每个文化3天后被隔离。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.5"> <title>2.5。流仪结果<gydF4y2Ba/title> <p>细胞表面抗原的表达在2 - 14,2-23,2-52细胞被流式细胞术分析。细胞(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M6"> <mml:mn> 2<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ×<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/管)准备作为单个细胞悬液通过胰蛋白酶/ EDTA消化和resuspended在流式细胞术缓冲区(研发系统)孵化与抗体(10毫克/毫升)特定的表面标记或同形像控制抗体(10毫克/毫升)冰45分钟。圣地亚哥Anti-CD105-PE和anti-CD146-PE抗体(eBioscience CA)和鼠标IgG-PE同形像控制使用。流式细胞仪的细胞被洗染色缓冲和分析使用一个EC800细胞分析仪(索尼生物技术,日本东京)。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.6"> <title>2.6。半定量rt - pcr<gydF4y2Ba/title> <p>PCR进行使用铂Taq DNA聚合酶(表达载体,卡尔斯巴德,CA) PCR热循环骰子(豆类生物有限公司、志贺、日本)在下列条件:94°C 2分钟,然后适当数量的周期在94°C 30年代,适当的退火温度为30年代,30年代72°C,最后7分钟72°C。引物序列,退火温度,循环数,和产品尺寸<gydF4y2Baitalic> 1型胶原蛋白<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> COL-1<gydF4y2Ba/italic>),<gydF4y2Baitalic> 牙周ligament-associated蛋白1<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> PLAP-1<gydF4y2Ba/italic>),<gydF4y2Baitalic> Periostin<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> POSTN<gydF4y2Ba/italic>)和glyceraldehyde3-phosphate脱氢酶(<gydF4y2Baitalic> GAPDH<gydF4y2Ba/italic>)如表所示<gydF4y2Baxref rid="tab1" ref-type="table"> 1<gydF4y2Ba/xref>。<gydF4y2Baitalic> GAPDH<gydF4y2Ba/italic>引物被用作内部标准。所有PCR检测指数放大范围内进行。PCR产品由2%琼脂糖凝胶电泳(Seakem我;BioWhittaker分子应用,大我)和溴化乙锭染色后紫外激发下拍摄。<gydF4y2Ba/p> <table-wrap id="tab1"> <label>表1<gydF4y2Ba/label> <p>引物序列,退火温度,循环数,为半定量rt - pcr和产品尺寸。<gydF4y2Ba/p> <table> <thead> <tr> <th align="left">基因(缩写)<gydF4y2Ba/th> <th align="center">正向/反向引物序列<gydF4y2Ba/th> <th align="center">退火温度(°C)<gydF4y2Ba/th> <th align="center">半定量rt - pcr循环<gydF4y2Ba/th> <th align="center">放大产品的大小(bp)<gydF4y2Ba/th> </tr> </thead> <tbody> <tr> <td align="left">COL-1<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M7"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CCCGGGTTTCAGAGACAACTTC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M8"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M9"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TCCACATGCTTTATTCCAGCAATC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M10"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">61年<gydF4y2Ba/td> <td align="center">23<gydF4y2Ba/td> <td align="center">148年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">PLAP-1<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M11"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ATGGGAGTCTTGCTAACATACCAC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M12"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M13"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CAGAAGTCATTTACTCCCACTCTTG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M14"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">30.<gydF4y2Ba/td> <td align="center">154年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">POSTN<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M15"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CACAACCTGGAGACTGGACA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M16"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M17"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TGCTTCCTTGTGTGGTCTTT-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M18"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">59<gydF4y2Ba/td> <td align="center">25<gydF4y2Ba/td> <td align="center">198年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">GAPDH<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M19"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ACCACAGTCCATGCCATCCAC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M20"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M21"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M22"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">20.<gydF4y2Ba/td> <td align="center">452年<gydF4y2Ba/td> </tr> </tbody> </table> </table-wrap> </sec> <sec id="sec2.7"> <title>2.7。微阵列分析<gydF4y2Ba/title> <p>总RNA分离2 - 14,2-23 2-52细胞使用试剂盒纯化试剂(表达载体)和使用SV总RNA孤立系统(Promega,麦迪逊,WI),根据制造商的指示。RNA样本量化使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(热费希尔科学)。RNA的质量检查使用Experion自动电泳站(Bio-Rad实验室Inc .,大力神,CA)。微阵列分析使用安捷伦科技系统(Santa Clara, CA)是由细胞创新者,公司的风险企业实验室九州大学(日本福冈)如下。互补脱氧核糖核酸是放大和标签使用低输入快速Amp标签工具包(安捷伦科技)和杂化SurePrint G3人类基因表达微阵列<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M23"> <mml:mn> 8<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ×<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 60<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mtext> K<gydF4y2Ba/mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>v2(安捷伦科技)。样品的原始信号强度(认为是2 - 14与2-52 (compare1)和2-23与2-52 (compare2))规范化使用分位数算法在预处理的核心库包Bioconductor应用程序。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.8"> <title>2.8。定量rt - pcr<gydF4y2Ba/title> <p>细胞总RNA分离试剂盒试剂。合成第一链cDNA从1<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>g总RNA使用ExScript RT试剂盒(豆类)。总RNA反向转录和随机五个一ExScript RTase 15分钟42°C。的反应是停在孵化2分钟在99°C,紧随其后的是5分钟在5°C。PCR进行使用SYBR绿色II(豆类)在热循环骰子实时系统(豆类)在下列情况下:95°C的10年代(初始变性),然后40周期在95°C 5 s和60°C 30年代,紧随其后的是分离程序在95°C 15年代,30年代60°C, 95°C 15 s。引物序列,退火温度,循环数,和产品尺寸<gydF4y2Baitalic> p75NTR<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> N-cadherin<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> NANOG<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> 最高明的<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> 细胞周期蛋白D1<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> CCND1<gydF4y2Ba/italic>),<gydF4y2Baitalic> 细胞周期素E1<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> CCNE1<gydF4y2Ba/italic>),<gydF4y2Baitalic> 高山<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> Osterix<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> PPARγ<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> C / EBPα<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> 2型胶原蛋白<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> 第二列<gydF4y2Ba/italic>),<gydF4y2Baitalic> Aggrecan<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> COL-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> PLAP-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> POSTN<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> β肌动蛋白<gydF4y2Ba/italic>如表所示<gydF4y2Baxref rid="tab2" ref-type="table"> 2<gydF4y2Ba/xref>。<gydF4y2Baitalic> β-Actin<gydF4y2Ba/italic>作为一个内部标准。目标基因的表达水平计算使用<gydF4y2Baitalic> ΔΔ<gydF4y2Ba/italic>Ct值。<gydF4y2Ba/p> <table-wrap id="tab2"> <label>表2<gydF4y2Ba/label> <p>引物序列,退火温度,循环数,为定量rt - pcr和产品尺寸。<gydF4y2Ba/p> <table> <thead> <tr> <th align="left">基因(缩写)<gydF4y2Ba/th> <th align="center">正向/反向引物序列<gydF4y2Ba/th> <th align="center">退火温度(°C)<gydF4y2Ba/th> <th align="center">定量rt - pcr循环<gydF4y2Ba/th> <th align="center">放大产品的大小(bp)<gydF4y2Ba/th> </tr> </thead> <tbody> <tr> <td align="left">p75NTR<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M24"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CCGAGGCACCACCGACAACC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M25"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M26"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TGCTTGCAGCTGTTCCACCTCT-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M27"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">108年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">N-cadherin<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M28"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GAAAGACCCATCCACGCCGAGC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M29"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M30"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TCAGCCGCTTTAAGGCCCTCATT-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M31"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">101年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">NANOG<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M32"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TCCAACATCCTGAACCTCAGCTA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M33"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M34"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-AGGTTCCCAGTCGGGTTCAC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M35"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">193年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">最高明的<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M36"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ATGGGCCATTGGATCCTGTA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M37"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> 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<mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M41"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M42"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TAGGACAGGAAGTTGTTG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M43"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">163年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">CCNE1<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M44"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GCCAGCCTTGGGACAATAATG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M45"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M46"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CTTGCACGTTGAGTTTGGGT-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M47"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">104年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">高山<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math 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align="center">137年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">Osterix<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M52"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GCCATTCTGGGCTTGGGTATC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M53"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M54"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GAAGCCGGAGTGCAGGTATCA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M55"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">129年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">PPAR<gydF4y2Baitalic> γ<gydF4y2Ba/italic></td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M56"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TATTCTCAGTGGAGACCGCC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M57"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M58"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TGAGGACTCAGGGTGGTTCA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math 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<mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GTCATTGTCACTGGTCAGCTC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M63"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">135年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">第二列<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M64"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CAACCAGGACCAAAGGGACA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M65"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M66"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ACCTTTGTCACCACGATCCC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M67"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">129年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">Aggrecan<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M68"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TGGTGATGATCTGGCACGAG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M69"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M70"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CGTGAGCTCCGCTTCTGTAG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M71"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">124年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">COL-1<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M72"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CCCGGGTTTCAGAGACAACTTC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M73"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M74"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TCCACATGCTTTATTCCAGCAATC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M75"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">148年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">PLAP-1<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M76"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ATGGGAGTCTTGCTAACATACCAC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M77"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M78"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CAGAAGTCATTTACTCCCACTCTTG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M79"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">154年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left">POSTN<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M80"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-CACAACCTGGAGACTGGACA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M81"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M82"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TGCTTCCTTGTGTGGTCTTT-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M83"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">198年<gydF4y2Ba/td> </tr> <tr> <td align="left"> <italic> β<gydF4y2Ba/italic>肌动蛋白<gydF4y2Ba/td> <td align="center">5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M84"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M85"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/ 5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M86"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M87"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> <td align="center">60<gydF4y2Ba/td> <td align="center">40<gydF4y2Ba/td> <td align="center">89年<gydF4y2Ba/td> </tr> </tbody> </table> </table-wrap> </sec> <sec id="sec2.9"> <title>2.9。免疫印迹分析<gydF4y2Ba/title> <p>细胞细胞溶解在缓冲包含50 mM Tris-HCl (pH值6.9;σ),2%钠dodecylsulfate (SDS;Nacalai), 6% 2-mercaptoethanol(σ),和10%的甘油。蛋白质样品(20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>g)受到4% - -20% SDS-polyacrylamide凝胶电泳,随后转移到一个Immuno-Blot PVDF膜(Bio-Rad)。膜处理小鼠单克隆抗-<gydF4y2Baitalic> β<gydF4y2Ba/italic>肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术)的稀释1:1000或山羊多克隆抗体anti-MEST (Abcam)的稀释1:200年,其次是生物素化的anti-mouse免疫球蛋白(Nichirei生物科学公司,东京,日本)抗体或免疫球蛋白(Nichirei)合适。膜清洗干净后,活性乐队是可视化使用ECL选择免疫印迹检测系统(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)和图像定量拉斯维加斯500 (GE)。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.10"> <title>2.10。免疫荧光染色<gydF4y2Ba/title> <p>细胞被固定为4% PFA和0.5%二甲亚砜和光)(kouichi PBS 20分钟。与2% BSA在PBS阻塞后1 h,这些细胞被孵化1 h和一只山羊多克隆抗体anti-MEST (Abcam)的稀释1:200或鼠标单克隆抗体anti-Ki67(表达载体)的稀释1:100,然后用PBS。这些细胞被培养1 h和一个Alexa萤石488 -共轭鸡抗体抗体的稀释(表达载体)1:200。PBS的细胞被洗,然后用DAPI复染色(向量实验室,伯林盖姆,CA)。细胞骨架是沾Phalloidin-Tetramethylrhodamine B异硫氰酸酯(σ)。Biozero数码显微镜下细胞成像和分析。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.11"> <title>2.11。小干扰RNA转染<gydF4y2Ba/title> <p>反对最高明的小干扰rna (siRNAs)(任务siRNA)和不属预定目标的控制核(任务siRNA普遍消极控制)从σ购买。在转染前的一天,2-23细胞被播种在Opti-MEM 24-well板块(表达载体)包含10%的边后卫(10%的边后卫/ Opti-MEM)。confluency在30% -50%,细胞转染核。二十个皮摩尔每个核的50<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>l Opti-MEM混合1<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>l preincubated Lipofectamine iMAX在另一个50(表达载体)<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>l Opti-MEM。混合物在室温下孵化了20分钟,然后添加到细胞培养在10%的边后卫/ Opti-MEM 37°C在湿润的气氛中有5%的公司<gydF4y2Basub>2<gydF4y2Ba/sub>。48小时后,介质换成新鲜的边后卫/ 10%<gydF4y2Baitalic> α<gydF4y2Ba/italic>mem。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.12"> <title>2.12。WST-1扩散分析<gydF4y2Ba/title> <p>细胞被播种在96 -孔板(正)<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M88"> <mml:mn> 3<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ×<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/在10%的边后卫<gydF4y2Baitalic> α<gydF4y2Ba/italic>mem和培养24和48 h。细胞增殖率测量使用预混料WST-1细胞增殖试验系统(豆类),根据制造商的指示。简单地说,在指定的时间点,10<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>l WST-1试剂添加到培养基的好。在100年1 h<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>l的上层清液收集从每个好,450海里的吸光度测量使用标(ImmunoMini nj - 2300;系统工具有限公司,日本东京)。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.13"> <title>2.13。基因转染和建立转染克隆<gydF4y2Ba/title> <p>人类最老成的cDNA(基因库的编码区加入。NM_002402.4)插入到pcDNA3.1 / Hygro(+)(表达载体)表达载体。2-52细胞转染pcDNA3.1 / Hygro(+)单独或与pcDNA3.1 / Hygro包含编码区(+)的人类最高明的cDNA使用Lipofectamine肝和加试剂(表达载体)。这些被称为“2-52_empty”和“2-52_MEST”。2-52_empty细胞被认为是控制。建立了候选克隆2-52_empty和2-52_MEST细胞通过选择潮霉素(表达载体)。最高明的表达克隆的水平稳定表达的最高明的cDNA评估定量rt - pcr和免疫印迹分析。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.14"> <title>2.14。统计分析<gydF4y2Ba/title> <p>所有的实验进行了一式三份或一式四份。值表示为<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M89"> <mml:mtext> 的意思是<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> 标准<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 偏差<gydF4y2Ba/mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>。使用成对的学生的统计分析<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M90"> <mml:mi> t<gydF4y2Ba/mml:mi> </mml:math> </inline-formula>以及。的值<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M91"> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.05<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>被认为是具有统计学意义。<gydF4y2Ba/p> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>3所示。结果<gydF4y2Ba/title> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。识别的最高明的微阵列分析<gydF4y2Ba/title> <p>人类PDLSCs识别的具体因素,我们进行了微阵列分析比较三个人类PDL细胞株基因表达,2 - 14,2-23,2-52。2-52细胞表现出spindle-like形状,而2 - 14和2-23细胞表现出一个圆形的形状(图<gydF4y2Baxref rid="fig1a" ref-type="fig"> 1(一)<gydF4y2Ba/xref>)。2 - 14和2-23细胞具有multidifferentiation成骨细胞的能力,脂肪细胞和软骨细胞,而2-52细胞分化能力有限(图展出<gydF4y2Baxref rid="fig1b" ref-type="fig"> 1 (b)<gydF4y2Ba/xref>)。2 - 14和2-23细胞的高度表达了MSC表面标记,如CD105和CD146(图<gydF4y2Baxref rid="fig1c" ref-type="fig"> 1 (c)<gydF4y2Ba/xref>并补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1<gydF4y2Ba/xref>等),以及干细胞相关标记<gydF4y2Baitalic> p75NTR<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> N-cadherin<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> NANOG<gydF4y2Ba/italic>(图<gydF4y2Baxref rid="fig1d" ref-type="fig"> 1 (d)<gydF4y2Ba/xref>),而2-52细胞表达这些干细胞标记少于2 - 14和2-23细胞。此外,2 - 14和2-23细胞的表达PDL-related基因,如<gydF4y2Baitalic> COL-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> PLAP-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> POSTN<gydF4y2Ba/italic>的表达高于2-52细胞(图<gydF4y2Baxref rid="fig1e" ref-type="fig"> 1 (e)<gydF4y2Ba/xref>)。从这些结果,我们2 - 14和2-23细胞的定义为人类PDLSC线。基于微阵列分析的结果(2 - 14比2-52 2-23比2-52),我们选择人类表达的分子高度PDLSC线条和专注于最高明的(图<gydF4y2Baxref rid="fig1f" ref-type="fig"> 1 (f)<gydF4y2Ba/xref>)。<gydF4y2Ba/p> <fig-group id="fig1"> <label>图1<gydF4y2Ba/label> <p>识别的最高明的微阵列分析。(安妮)2 - 14的表征,2-23,2-52细胞。(一)相差三个细胞系的(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M92"> <mml:mtext> 酒吧<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> =<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 40<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula> <italic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。(b) multidifferentiation成骨细胞的能力,三个细胞系的脂肪细胞,软骨细胞。茜素红染色的细胞在成骨细胞的分化培养基培养3周(上面一行:<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M93"> <mml:mtext> 酒吧<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> =<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 5<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>毫米)。油红O染色细胞培养的脂肪形成的3周的诱导条件。插图:更高的石油红体内脂质(放大视图中一行:<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M94"> <mml:mtext> 酒吧<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> =<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 20.<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula> <italic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。阿尔新蓝染色的细胞培养4周chondrogenic归纳条件(底下一行:酒吧= 200<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。(c) CD105和CD146的表达强度2 - 14(绿线),2-23(蓝线),和2-52(黑线)细胞被流仪结果证明。在封闭的地区,阳性细胞。(d)的基因表达<gydF4y2Baitalic> p75NTR<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> N-cadherin<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> NANOG<gydF4y2Ba/italic>在三个细胞系被定量rt - pcr检测。这是标准化的反对<gydF4y2Baitalic> β肌动蛋白<gydF4y2Ba/italic>表达式。所有的值都是<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M95"> <mml:mtext> 意味着<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> 年代<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> D<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:math> </inline-formula>(误差)一式四份化验。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M96"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.01<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。(e)的基因表达<gydF4y2Baitalic> 1型胶原蛋白<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> COL-1<gydF4y2Ba/italic>),<gydF4y2Baitalic> PLAP-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> Periostin<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> POSTN<gydF4y2Ba/italic>)在三个细胞系被半定量rt - pcr检测。这是标准化的反对<gydF4y2Baitalic> GAPDH<gydF4y2Ba/italic>表达式。(f)之间的基因表达微阵列分析比较三种细胞系(左列:2 - 14与2-52 (compare1);右列:2-23与2-52 (compare2))。热图是由兆电子伏生成软件。行代表的基因,列代表样本。颜色表示每一行的距离值(红色块:高;绿色块:低;黑块:类似的表达式)。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig1a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.001a"></graphic> </fig> <fig id="fig1b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.001b"></graphic> </fig> <fig id="fig1c"> <label>(c)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.001c"></graphic> </fig> <fig id="fig1d"> <label>(d)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.001d"></graphic> </fig> <fig id="fig1e"> <label>(e)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.001e"></graphic> </fig> <fig id="fig1f"> <label>(f)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.001f"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。的表达在人类PDLSC最高明的线<gydF4y2Ba/title> <p>微阵列分析表明,在2-23最高明的细胞的表达水平高于2-52细胞(图所示<gydF4y2Baxref rid="fig2a" ref-type="fig"> 2(一个)<gydF4y2Ba/xref>)。定量rt - pcr表明<gydF4y2Baitalic> 最高明的<gydF4y2Ba/italic>基因高表达不仅(图2 - 14和2-23细胞还- 17的细胞<gydF4y2Baxref rid="fig2b" ref-type="fig"> 2 (b)<gydF4y2Ba/xref>)。此外,免疫印迹分析表明2-23细胞中最高明的蛋白质的表达水平高于2-52细胞(图<gydF4y2Baxref rid="fig2c" ref-type="fig"> 2 (c)<gydF4y2Ba/xref>)。此外,免疫荧光染色显示,最高明的是2-23表达细胞,和2-23中最高明的细胞的表达水平高于2-52细胞(数据<gydF4y2Baxref rid="fig2d" ref-type="fig"> 2 (d)<gydF4y2Ba/xref>和<gydF4y2Baxref rid="fig2e" ref-type="fig"> 2 (e)<gydF4y2Ba/xref>)。这些结果表明,最高明的是人类PDLSCs高度表达。<gydF4y2Ba/p> <fig-group id="fig2"> <label>图2<gydF4y2Ba/label> <p>的表达在人类PDLSC最高明的线。(一)散点图代表2-23和2-52细胞微阵列的基因表达分析。(b)的表达<gydF4y2Baitalic> 最高明的<gydF4y2Ba/italic>信使rna - 17(灰色的列),2 - 14黑色(左列),2-23黑色(右列),和2-52(白列)细胞进行定量rt - pcr。这是标准化的反对<gydF4y2Baitalic> β肌动蛋白<gydF4y2Ba/italic>表达式。所有的值都是<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M97"> <mml:mtext> 意味着<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> 年代<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> D<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:math> </inline-formula>(误差)一式四份化验。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M98"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.01<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。(c)在2-23最高明的蛋白质的表达和2-52细胞被免疫印迹分析评估。这是标准化的反对<gydF4y2Baitalic> β<gydF4y2Ba/italic>肌动蛋白的表达。(d, e)的最高明的本地化2-23 (d)和2-52 (e)细胞被免疫荧光染色检查(anti-MEST:绿色,DAPI:蓝色;酒吧:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig2a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.002a"></graphic> </fig> <fig id="fig2b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.002b"></graphic> </fig> <fig id="fig2c"> <label>(c)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.002c"></graphic> </fig> <fig id="fig2d"> <label>(d)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.002d"></graphic> </fig> <fig id="fig2e"> <label>(e)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.002e"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.3"> <title>3.3。最高明的击倒抑制干细胞标记物的表达和增殖潜力2-23细胞<gydF4y2Ba/title> <p>评估的角色在人类PDLSCs最高明的,我们检查的影响最高明的击倒在干细胞的核属性,如干细胞标记物的表达,增殖潜力,multidifferentiation能力。定量rt - pcr和免疫印迹分析证实,最高明的mRNA的表达(图<gydF4y2Baxref rid="fig3a" ref-type="fig"> 3(一个)<gydF4y2Ba/xref>(图)和蛋白质<gydF4y2Baxref rid="fig3b" ref-type="fig"> 3 (b)<gydF4y2Ba/xref>)在2-23细胞表达下调了48 h与最高明的siRNA治疗。流仪分析表明,MSC表面标记物的表达,如CD105和CD146低2-23细胞转染最高明的核(2-23_siMEST)相比,负控制核(2-23_siCont)(图<gydF4y2Baxref rid="fig3c" ref-type="fig"> 3 (c)<gydF4y2Ba/xref>并补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1<gydF4y2Ba/xref>b)。此外,干细胞相关标记物的表达,例如<gydF4y2Baitalic> p75NTR<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> N-cadherin<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> NANOG<gydF4y2Ba/italic>由最高明的击倒,2-23细胞也表达下调(图<gydF4y2Baxref rid="fig3d" ref-type="fig"> 3 (d)<gydF4y2Ba/xref>)。的影响最高明的击倒2-23细胞的增殖潜力是使用WST-1扩散试验检查。我们发现最老成的击倒显著降低2-23细胞的增殖率(图<gydF4y2Baxref rid="fig3e" ref-type="fig"> 3 (e)<gydF4y2Ba/xref>)。此外,我们研究了细胞的基因表达cycle-related标记<gydF4y2Baitalic> CCND1<gydF4y2Ba/italic>和<gydF4y2Baitalic> CCNE1<gydF4y2Ba/italic>。与2-23_siCont细胞相比,两个基因的表达水平下调2-23_siMEST细胞(图所示<gydF4y2Baxref rid="fig3f" ref-type="fig"> 3 (f)<gydF4y2Ba/xref>)。此外,相比之下2-23_siMEST细胞,免疫荧光染色显示2-23_siCont细胞阳性ki - 67,扩散的典型标志(图<gydF4y2Baxref rid="fig3g" ref-type="fig"> 3 (g)<gydF4y2Ba/xref>)。这些结果表明,最高明的击倒抑制人类PDLSCs增殖的潜力。<gydF4y2Ba/p> <fig-group id="fig3"> <label>图3<gydF4y2Ba/label> <p>最高明的击倒的影响干细胞标记物的表达和增殖潜力2-23细胞。(a, b)最高明的mRNA的表达蛋白质(a)和(b)与负控制2-23细胞转染核(siCont)或最高明的核(siMEST_ # 1和siMEST_ # 2)评估定量rt - pcr和免疫印迹分析,分别。(c) CD105和CD146的表达强度与siCont 2-23细胞转染。(黑线)或siMEST_ # 1(红线)证明了流量仪分析。在封闭的地区,阳性细胞。(d)的基因表达<gydF4y2Baitalic> p75NTR<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> N-cadherin<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> NANOG<gydF4y2Ba/italic>与siCont 2-23细胞转染。或sim卡被定量rt - pcr进行评估。(e) 2-23转染细胞的增殖与负控制核(siCont)或最高明的核(sim)被WST-1扩散试验检查。图显示的时间进程与siCont 2-23细胞转染的细胞数量增加。(灰色线)或sim(黑线)。所有的值都是<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M99"> <mml:mtext> 意味着<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> 年代<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> D<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:math> </inline-formula>(误差)一式四份化验。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M100"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.01<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M101"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.05<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。(f)的基因表达<gydF4y2Baitalic> 细胞周期蛋白D1<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> CCND1<gydF4y2Ba/italic>),<gydF4y2Baitalic> 细胞周期素E1<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> CCNE1<gydF4y2Ba/italic>)与siCont 2-23细胞转染。或sim卡被定量rt - pcr进行评估。(f) ki - 67的表达与siCont 2-23细胞转染。(上)或sim(低)被immunocytofluorescence染色观察(anti - ki - 67:绿色,DAPI:蓝色;酒吧:500<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。(a、d、f)在定量rt - pcr,这些基因的表达水平正常化<gydF4y2Baitalic> β肌动蛋白<gydF4y2Ba/italic>表达式。所有的值都是<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M102"> <mml:mtext> 意味着<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> 年代<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> D<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:math> </inline-formula>(误差)一式四份化验。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M103"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.01<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M104"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.05<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig3a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.003a"></graphic> </fig> <fig id="fig3b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.003b"></graphic> </fig> <fig id="fig3c"> <label>(c)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.003c"></graphic> </fig> <fig id="fig3d"> <label>(d)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.003d"></graphic> </fig> <fig id="fig3e"> <label>(e)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.003e"></graphic> </fig> <fig id="fig3f"> <label>(f)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.003f"></graphic> </fig> <fig id="fig3g"> <label>(g)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.003g"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.4"> <title>3.4。最高明的击倒抑制Multidifferentiation 2-23细胞的能力<gydF4y2Ba/title> <p>我们下一个最高明的击倒后的效果如何multidifferentiation 2-23细胞的能力。茜素红S-positive 2-23_siMEST面积在成骨细胞的分化培养基培养细胞小于2-23_siCont细胞(图<gydF4y2Baxref rid="fig4a" ref-type="fig"> 4(一)<gydF4y2Ba/xref>)。此外,骨基因的表达水平,如<gydF4y2Baitalic> 高山<gydF4y2Ba/italic>和<gydF4y2Baitalic> Osterix<gydF4y2Ba/italic>(图<gydF4y2Baxref rid="fig4b" ref-type="fig"> 4 (b)<gydF4y2Ba/xref>),显著降低在2-23_siMEST在成骨细胞的分化培养基培养细胞比2-23_siCont细胞。同样,石油的好心人区域2-23_siMEST脂肪形成的细胞分化中小于2-23_siCont细胞(图<gydF4y2Baxref rid="fig4c" ref-type="fig"> 4 (c)<gydF4y2Ba/xref>),和adipocyte-related基因的表达水平,如<gydF4y2Baitalic> PPARγ<gydF4y2Ba/italic>和<gydF4y2Baitalic> C / EBPα<gydF4y2Ba/italic>(图<gydF4y2Baxref rid="fig4d" ref-type="fig"> 4 (d)<gydF4y2Ba/xref>在2-23_siMEST细胞),显著低于2-23_siCont细胞。此外,阿尔新blue-positive chondrogenic 2-23_siMEST的软骨基质细胞分化中小于2-23_siCont细胞(图<gydF4y2Baxref rid="fig4e" ref-type="fig"> 4 (e)<gydF4y2Ba/xref>),和chondrocyte-related基因的表达水平,如<gydF4y2Baitalic> 第二列<gydF4y2Ba/italic>和<gydF4y2Baitalic> Aggrecan<gydF4y2Ba/italic>(图<gydF4y2Baxref rid="fig4f" ref-type="fig"> 4 (f)<gydF4y2Ba/xref>在2-23_siMEST细胞),显著低于2-23_siCont细胞。这些结果表明,最高明的击倒抑制人类PDLSCs multidifferentiation能力。<gydF4y2Ba/p> <fig-group id="fig4"> <label>图4<gydF4y2Ba/label> <p>的影响,最高明的击倒multidifferentiation 2-23细胞的能力。(a)矿化结节的形成与控制2-23细胞转染核(siCont)或最高明的核(sim)检查茜素红S染色后文化在成骨细胞的分化培养基(DM) 3周(酒吧:5毫米)。(b)基因的表达<gydF4y2Baitalic> 高山<gydF4y2Ba/italic>和<gydF4y2Baitalic> Osterix<gydF4y2Ba/italic>与siCont 2-23细胞转染。或sim,培养有或没有DM为3天,由定量rt - pcr进行评估。(c)与siCont 2-23转染细胞的脂质空泡。或sim检查油红O染色后文化3周脂肪形成的DM(酒吧:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。(d)的基因表达<gydF4y2Baitalic> PPARγ<gydF4y2Ba/italic>和<gydF4y2Baitalic> C / EBPα<gydF4y2Ba/italic>与siCont 2-23细胞转染。或sim,培养有或没有DM为3天,由定量rt - pcr进行评估。(e)软骨矩阵与siCont 2-23细胞转染。或sim检查阿尔新蓝染色后文化4周chondrogenic DM(酒吧:200<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。(f)的基因表达<gydF4y2Baitalic> 2型胶原蛋白<gydF4y2Ba/italic>(<gydF4y2Baitalic> 第二列<gydF4y2Ba/italic>),<gydF4y2Baitalic> Aggrecan<gydF4y2Ba/italic>与siCont 2-23细胞转染。或sim,培养有或没有DM为3天,由定量rt - pcr进行评估。(b, d, f)定量rt - pcr,这些基因的表达水平正常化<gydF4y2Baitalic> β肌动蛋白<gydF4y2Ba/italic>表达式。所有的值都是<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M105"> <mml:mtext> 意味着<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> 年代<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> D<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:math> </inline-formula>(误差)一式四份化验。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M106"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.01<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。n。:不重要。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig4a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.004a"></graphic> </fig> <fig id="fig4b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.004b"></graphic> </fig> <fig id="fig4c"> <label>(c)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.004c"></graphic> </fig> <fig id="fig4d"> <label>(d)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.004d"></graphic> </fig> <fig id="fig4e"> <label>(e)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.004e"></graphic> </fig> <fig id="fig4f"> <label>(f)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.004f"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.5"> <title>3.5。最高明的超表达诱发PDLSC-Like属性2-52细胞<gydF4y2Ba/title> <p>接下来,检查的影响,最高明的人类PDL细胞的干细胞的特性,我们建立了2-52细胞表达最高明的稳定,与一个向量编码转染人类最高明的,称为2-52_MEST细胞。2-52_MEST细胞表达高水平的最高明的基因和蛋白质而2-52细胞转染空载体,称为2-52_empty细胞。最高明的基因和蛋白的表达水平2-52_MEST细胞高于2-52_empty细胞和几乎相同的2-23细胞(数字<gydF4y2Baxref rid="fig5a" ref-type="fig"> 5(一个)<gydF4y2Ba/xref>和<gydF4y2Baxref rid="fig5b" ref-type="fig"> 5 (b)<gydF4y2Ba/xref>)。我们发现MSC表面标记物的表达,如CD105和CD146(图<gydF4y2Baxref rid="fig5c" ref-type="fig"> 5 (c)<gydF4y2Ba/xref>并补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1<gydF4y2Ba/xref>c),和干细胞相关标记,如<gydF4y2Baitalic> p75NTR<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> N-cadherin<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> NANOG<gydF4y2Ba/italic>(图<gydF4y2Baxref rid="fig5d" ref-type="fig"> 5 (d)<gydF4y2Ba/xref>),在2-52_MEST细胞高于2-52_empty细胞。此外,PDL-related基因的表达,如<gydF4y2Baitalic> COL-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> PLAP-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> POSTN<gydF4y2Ba/italic>在2-52_MEST细胞,也高于2-52_empty细胞(图所示<gydF4y2Baxref rid="fig5e" ref-type="fig"> 5 (e)<gydF4y2Ba/xref>)。此外,为成骨细胞的能力,脂肪形成的,chondrogenic 2-52_MEST细胞分化是高于2-52_empty细胞和几乎相同的2-23细胞(数字<gydF4y2Baxref rid="fig6a" ref-type="fig"> 6(一)<gydF4y2Ba/xref>- - - - - -<gydF4y2Baxref rid="fig6f" ref-type="fig"> 6 (f)<gydF4y2Ba/xref>)。此外,有趣的是,2-52_MEST细胞表现出形态的变化从轴形状类似2-23细胞(干细胞的圆形人物<gydF4y2Baxref rid="fig7a" ref-type="fig"> 7(一)<gydF4y2Ba/xref>- - - - - -<gydF4y2Baxref rid="fig7d" ref-type="fig"> 7 (d)<gydF4y2Ba/xref>)。这些结果表明,过度的最高明的诱发PDLSC-like属性在人类的PDL细胞。<gydF4y2Ba/p> <fig-group id="fig5"> <label>图5<gydF4y2Ba/label> <p>的影响,最高明的超表达干细胞标记物的表达和在2-52 PDL-related标记细胞。(a, b)最高明的mRNA的表达蛋白质(a)和(b)在2-52细胞转染空载体(2-52_empty) 2-52细胞转染与向量编码人类最高明的(2-52_MEST)和2-23细胞进行定量rt - pcr和免疫印迹分析,分别。(c) CD105的表达强度和CD146 2-52_empty(黑线),2-52_MEST(红线),和2-23细胞(蓝线)证明了流量仪分析。在封闭的地区,阳性细胞。(d)的基因表达<gydF4y2Baitalic> p75NTR<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> N-cadherin<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> NANOG<gydF4y2Ba/italic>在2-52_empty 2-52_MEST, 2-23细胞被定量rt - pcr进行评估。(e)的基因表达<gydF4y2Baitalic> COL-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> PLAP-1<gydF4y2Ba/italic>,<gydF4y2Baitalic> POSTN<gydF4y2Ba/italic>在2-52_empty 2-52_MEST, 2-23细胞被定量rt - pcr进行评估。(a、d、e)在定量rt - pcr,这些基因的表达水平正常化<gydF4y2Baitalic> β肌动蛋白<gydF4y2Ba/italic>表达式。所有的值都是<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M107"> <mml:mtext> 意味着<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> 年代<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> D<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:math> </inline-formula>(误差)一式四份化验。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M108"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.01<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M109"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.05<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>;n。:不重要。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig5a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.005a"></graphic> </fig> <fig id="fig5b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.005b"></graphic> </fig> <fig id="fig5c"> <label>(c)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.005c"></graphic> </fig> <fig id="fig5d"> <label>(d)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.005d"></graphic> </fig> <fig id="fig5e"> <label>(e)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.005e"></graphic> </fig> </fig-group> <fig-group id="fig6"> <label>图6<gydF4y2Ba/label> <p>的影响,最高明的超表达multidifferentiation 2-52细胞的能力。(a)的形成矿化结节茜素红S了2-52_empty或2-52_MEST染色文化在成骨的DM 3周后(酒吧:5毫米)。(b)基因的表达<gydF4y2Baitalic> 高山<gydF4y2Ba/italic>和<gydF4y2Baitalic> Osterix<gydF4y2Ba/italic>在2-52_empty或2-52_MEST,培养有或没有DM为3天,由定量rt - pcr进行评估。(c)在2-52_empty的脂质空泡或2-52_MEST检查油红O染色文化后3周脂肪形成的DM(酒吧:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。(d)的基因表达<gydF4y2Baitalic> PPARγ<gydF4y2Ba/italic>和<gydF4y2Baitalic> C / EBPα<gydF4y2Ba/italic>在2-52_empty或2-52_MEST,培养有或没有DM为3天,由定量rt - pcr进行评估。(e)的软骨基质2-52_empty或2-52_MEST检查阿尔新蓝染色后文化chondrogenic DM为4周(酒吧:200<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。(f)的基因表达<gydF4y2Baitalic> 第二列<gydF4y2Ba/italic>(k)和<gydF4y2Baitalic> Aggrecan<gydF4y2Ba/italic>(左)在2-52_empty或2-52_MEST,培养有或没有DM为3天,由定量rt - pcr进行评估。所有的值都是<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M110"> <mml:mtext> 意味着<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> 年代<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> D<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> 。<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:math> </inline-formula>(误差)一式四份化验(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M111"> <mml:mi> n<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> =<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 4<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M112"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.01<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M113"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗<gydF4y2Ba/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> p<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.05<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。n。:不重要)。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig6a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.006a"></graphic> </fig> <fig id="fig6b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.006b"></graphic> </fig> <fig id="fig6c"> <label>(c)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.006c"></graphic> </fig> <fig id="fig6d"> <label>(d)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.006d"></graphic> </fig> <fig id="fig6e"> <label>(e)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.006e"></graphic> </fig> <fig id="fig6f"> <label>(f)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.006f"></graphic> </fig> </fig-group> <fig-group id="fig7"> <label>图7<gydF4y2Ba/label> <p>细胞形态学上的影响最高明的超表达2-52细胞。(a - c)免疫荧光染色的细胞形态学研究2-52_empty (a), 2-52_MEST (b)、(c)和2-23细胞。(d)盒装的高度放大的视图区域(b),细胞核与DAPI染色和f -肌动蛋白与phalloidin染色(f -肌动蛋白:红色;anti-MEST:绿色;DAPI:蓝色;酒吧:10<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米)。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig7a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.007a"></graphic> </fig> <fig id="fig7b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.007b"></graphic> </fig> <fig id="fig7c"> <label>(c)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.007c"></graphic> </fig> <fig id="fig7d"> <label>(d)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.fig.007d"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4所示。讨论<gydF4y2Ba/title> <p>在目前的研究中,使用核功能丧失分析表明,最高明的起着至关重要的作用在维护PDLSCs具备干细胞,而功能分析采用基因转移透露,最高明的可能PDL细胞转换成PDLSC-like细胞。这是第一个报告来证明最高明的候选人因素调节人类PDLSCs的具备干细胞。<gydF4y2Ba/p> <p>首先,我们确定因素表达人类PDLSC线通过微阵列分析和高度专注于最高明的。最高明的是一个印迹基因在胚胎发育中扮演重要的角色(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B21"> 21<gydF4y2Ba/xref>]。印迹基因影响的所有方面建立干细胞分化(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B22"> 22<gydF4y2Ba/xref>]。先前的报道发现印在成年体细胞干细胞和基因表达表明,基因组印记可能是多能性的标志(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B23"> 23<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B24"> 24<gydF4y2Ba/xref>]。在我们的研究中,最高明的高度表达多个人类PDLSC行包括2 - 14,2-23,1卷。这些发现表明,印迹基因在人类PDLSCs包括最高明的可能是重要的。此外,我们发现,击倒的最高明的抑制人类PDLSCs几茎状的属性。这个发现证实,最高明的可能发挥重要作用在PDLSCs具备干细胞的维护。到目前为止,没有具备干细胞因子参与调节PDLSCs报告。我们目前的研究表明,最高明的可能是一个小说因素调节PDLSCs具备干细胞。此外,研究结果表明最高明的诱导干细胞样细胞的可能性。<gydF4y2Ba/p> <p>以前,移植自体PDLSCs进入人类和猪牙周再生PDL组织缺陷已经完成(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B15"> 15<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B16"> 16<gydF4y2Ba/xref>]。此外,其他牙齿干细胞,它一直认为PDLSCs是最适合牙周组织再生的细胞疗法(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B25"> 25<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B26"> 26<gydF4y2Ba/xref>]。因此,我们调查的方法获得足够数量的PDLSCs临床应用。到目前为止,作为一个方法来获取PDLSCs,它已经从牙齿中提取常见分离(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B6"> 6<gydF4y2Ba/xref>]。然而,PDLSCs从牙齿中提取获得的一个病人是非常小的<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B17"> 17<gydF4y2Ba/xref>]。因此,作为一个替代方法,我们认为从nonstem PDLSCs是否可以诱导细胞存在于PDL细胞群。<gydF4y2Ba/p> <p>Urodele两栖动物,四肢不全如蝾螈再生和反面去分化成熟的细胞未分化细胞(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B27"> 27<gydF4y2Ba/xref>]。此外,据报道,天花板文化诱导去分化成熟的脂肪细胞成MSC-like多功能细胞(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B28"> 28<gydF4y2Ba/xref>]。其他报告显示,治疗reversine诱发muscle-committed细胞的去分化成多能祖细胞(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B29"> 29日<gydF4y2Ba/xref>]。然而,这样的结果还没有出现在PDL细胞。在我们最近的研究中,我们建立了一个方法,人类PDL细胞去分化成PDLSC-like细胞转移基因高表达在人类PDLSC线。以前,我们发现Sema3A 2-52细胞转换成MSC-like细胞表达MSC表面标记和表现出成骨细胞和脂肪细胞的分化能力<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B18"> 18<gydF4y2Ba/xref>]。然而,这些细胞不表达PDL-related基因。PDL-derived干细胞样细胞表达干细胞相关标记和已报告PDL-related基因(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B6"> 6<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B9"> 9<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B10"> 10<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.<gydF4y2Ba/xref>]。在我们目前的研究中,我们感应PDLSC-like细胞表达干细胞相关标记和PDL-related基因的超表达<gydF4y2Baitalic> 最高明的<gydF4y2Ba/italic>基因。到目前为止,还没有报告PDLSCs表达干细胞相关标记和PDL-related由单个基因转移基因。此外,这些细胞表现出形态的变化从一个轴形状类似于人类的圆形PDLSC线。这些发现表明,最高明的可能诱发更适合PDLSC-like细胞对牙周组织再生治疗。<gydF4y2Ba/p> <p>总之,这项研究表明,最高明的可能使获得足够数量的PDLSCs临床应用和可能是一个小说因素与潜在的再生PDL组织效率。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec5"> <title>5。结论<gydF4y2Ba/title> <p>最高明的,印迹基因之一,是人类PDLSC线高度表达。然后,最高明的击倒抑制干细胞标记物的表达,增殖潜能,multidifferentiation能力成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞在人类PDLSC线。另一方面,最高明的超表达诱发PDLSC-like属性,如干细胞标记物的表达和PDL-related标记,multidifferentiation容量,PDLSC-like人类PDL细胞形态。总之,本研究表明,最高明的具备干细胞在维护中扮演着重要的角色在PDLSCs PDL细胞转化为干细胞样细胞的潜力。因此,最高明的可能是一个小说因素与潜在再生PDL组织效率。<gydF4y2Ba/p> </sec> <back> <sec sec-type="data-availability"> <title>数据可用性<gydF4y2Ba/title> <p>所有数据用于支持本研究的结果包括在本文中。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec sec-type="COI-statement"> <title>的利益冲突<gydF4y2Ba/title> <p>作者宣称没有利益冲突。<gydF4y2Ba/p> </sec> <ack> <title>确认<gydF4y2Ba/title> <p>我们感谢Drs。Fujino Nozu Itoyama,小野,Ipposhi,山下先生,Safwan,足立,Kadowaki Sugiura和轶事的大力支持这项工作的准备。我们要感谢研究支持中心,医疗科学研究生院,九州大学。我们还要感谢米切尔伤势从Edanz集团(<gydF4y2Baext-link ext-link-type="uri" xlink:href="http://www.edanzediting.com/ac"> http://www.edanzediting.com/ac<gydF4y2Ba/ext-link>)编辑这个手稿的草案。本研究在经济上支持jsp KAKENHI(项目号。JP23689077、JP15H05023 JP15H06487, JP16K20458, JP17H01598,和JP19K19002)从日本社会促进科学和Qdai-jump研究项目(项目编号30242)从学术研究和工业合作九州大学的管理办公室。<gydF4y2Ba/p> </ack> <sec sec-type="supplementary-material" id="supplementary-material-1"> <title>补充材料<gydF4y2Ba/title> <supplementary-material xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/9672673.f1.pdf" id="supp-1" mimetype="application/pdf"> <label>补充材料<gydF4y2Ba/label> <p>补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1<gydF4y2Ba/xref>:平均荧光强度的量化的MSC表面标记流仪分析。(a - c)平均荧光强度的定量值CD105和CD146 2 - 14(灰色的列),2-23(黑列),和2-52细胞(白列)所示(一个)。这与siCont 2-23细胞转染。(黑列)或siMEST_ # 1(黑色和白色条纹列)(b)所示。在2-52_empty(白色列),2-52_MEST(黑色和白色条纹列),和2-23细胞(黑列)(c)所示。<gydF4y2Ba/p> </supplementary-material> </sec> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Shimono<gydF4y2Ba/surname> <given-names> M。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 石川<gydF4y2Ba/surname> <given-names> T。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 石川<gydF4y2Ba/surname> <given-names> H。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 松崎<gydF4y2Ba/surname> <given-names> H。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 桥本<gydF4y2Ba/surname> <given-names> 年代。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Muramatsu表示<gydF4y2Ba/surname> <given-names> T。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 日本岛<gydF4y2Ba/surname> <given-names> K。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 松板大辅<gydF4y2Ba/surname> <given-names> K.-I。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 井上<gydF4y2Ba/surname> <given-names> T。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 牙周再生的调节机制<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 显微镜研究和技术<gydF4y2Ba/italic> <year> 2003年<gydF4y2Ba/year> <volume> 60<gydF4y2Ba/volume> <issue> 5<gydF4y2Ba/issue> <fpage> 491年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 502年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1002 / jemt.10290<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 0037376489<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 12619125<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B2" content-type="article"> <label>2<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Bartold<gydF4y2Ba/surname> <given-names> p . 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