产生潜在的生物材料的制备和评价干细胞表未来再生医学技术

文摘

迄今为止,脱细胞支架已广泛探索为再生医学生物支架的来源。然而,非细胞矩阵来源于自然组织和器官有很大的缺陷,包括有限的自组织和手术并发症如失血的风险、伤口感染、疼痛、休克、捐赠者和功能损伤身体的一部分。在这项研究中,我们准备好的非细胞矩阵使用脂肪干细胞(ADSC)表和评估细胞兼容性和免疫反应性。ADSC表是捏造的,随后脱细胞使用反复冻融,特里同x - 100和SDS去细胞。口腔粘膜上皮细胞被播种到脱细胞ADSC表来评估细胞再植能力,和蚕丝蛋白是用作控制。然后,非细胞矩阵被移植到皮下组织1周3周;CD68表达的)染色和免疫组织化学分析和定量实时PCR (qPCR)进行评价免疫原性和生物相容性。保存的ADSC sheet-derived ECM支架的三维架构ECM和留存Triton x - 100去细胞的细胞因子协议。与丝素蛋白体外相比,口腔粘膜上皮细胞更好地存活下来的脱细胞ADSC表和一个完整的连续的表皮细胞层。与猪小肠粘膜下层(SIS)体内,均质脱细胞ADSC表减少了monocyte-macrophage浸润体内植入。 During 3 weeks after transplantation, the mRNA expression of cytokines, such as IL-4/IL-10, was obviously higher in decellularized ADSC sheets than that of porcine SIS. A Triton X-100 method can achieve effective cell removal, retain major ECM components, and preserve the ultrastructure of ADSC sheets. The decellularized ADSC sheets possess good recellularization capacity and excellent biocompatibility. This study demonstrated the potential suitability of utilizing acellular matrix from ADSC sheets for soft tissue regeneration and repair.

1。介绍

迄今为止,脱细胞支架已广泛研究的生物再生医学和组织工程支架。与人工合成生物材料相比,脱细胞支架获得大自然设计架构,保留了固有的生长因子促进细胞生长,和恢复器官功能(1]。许多研究把重点放在了自然的去细胞组织和器官,包括血管(2)、皮肤(3),小肠黏膜下层(4),膀胱(5),脂肪组织(6)、脾(7)、肺(8]。他们的缺点包括自体组织的有限来自病人,增加操作时间、术后恢复时间,和手术并发症如失血的风险、伤口感染、疼痛、休克、捐赠者和功能损伤身体的一部分(9]。此外,现有的去细胞技术不能完全去除细胞组件。异基因的细胞内残余脱细胞支架可能导致不利的宿主免疫反应在活的有机体内。因此,有必要探索替代方案。

电池片技术帮助我们收获汇合的细胞制造相邻细胞与完整的细胞外基质(ECM)表。ECM是一个理想的组织工程和再生医学生物材料,它提供了一个结构和营养微环境细胞分化和增殖,并避免使用外源性支架的缺点,如毒性、炎症反应和细胞分布不均匀10]。细胞板形成的时间和厚度依赖细胞增殖的能力。脂肪干细胞(ADSCs)是最常用的自体移植的干细胞类型。一方面,相比之下,来自骨髓间充质干细胞和软骨,ADSCs拥有最高的增殖潜能,表现出高耐血清deprivation-induced凋亡[11]。另一方面,体内脂肪组织丰富,包含ADSCs含量高;约 ADSCs可以隔离在一克脂肪组织(12]。此外,脂肪组织可以很容易地获得大量的与小施主能级发病率或病人不适。更重要的是,间充质基质细胞都被证明是健壮的趋化因子和细胞因子,促进生长,分化,细胞迁移,导致快速recellularization的生物材料13]。

近年来,ADSC片移植表明潜在的广泛用于修复和重建受损的组织和器官,包括心肌梗死(14糖尿病溃疡(),15),和全层缺损的伤口16]。由于细胞表是由细胞和ECM紧凑,因此,脱细胞细胞表有可能被用作再生医学的新生物支架。细胞衍生ECM克服了问题可能的外源性病原体转移并允许ECM由患者自己的细胞(17]。由于抽脂手术的患病率,脂肪组织是唯一可以从人类捐赠者和脱细胞ADSC表有很好的临床应用前景,而伦理问题。在这项研究中,我们研究了三种典型方法的有效性ADSC表去细胞和评估ECM结构、生长因子保留recellularization潜力,组织相容性的脱细胞ADSC表。

2。材料和方法

2.1。材料

ADSC表使用的化学去细胞都来自Sigma-Aldrich除非另有说明。细胞培养试剂和产品,如60毫米鬼屋方面细胞培养皿中,购买从热费希尔科学(美国罗克福德,IL)。在10个月大的小猎犬狗动物实验室提供的上海第六人民医院。综述了动物实验和动物实验伦理委员会批准的医院根据指南善待动物组织建立的国际实验动物科学理事会。

2.2。原代细胞分离和文化

作为一种常见的大型实验动物,狗在我们的研究中用于皮下脂肪丰富,类似于人类生理学和强烈的抗病性。ADSCs获得由过程之前报道和简单孤立的酶消化(18]。脂肪组织收集的腹股沟区小猎犬狗。组织样本和0.25%氯霉素溶液洗了三次,磷酸盐缓冲(PBS),然后用0.1%胶原酶消化我1小时37°C。收集分离细胞通过细胞过滤器过滤后的孔隙直径40μm。主ADSCs被镀到100毫米菜肴在37°C和湿润的气氛中有5%的公司₂并保持较低的葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;美国纽约Gibco)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco), 100毫克/毫升硫酸链霉素(Gibco),和100 U /毫升青霉素(Gibco)。ADSCs被使用在随后的实验中,通过3和造血干细胞标记CD105标记CD45和和CD90流式细胞术进行评估。

口腔粘膜上皮细胞从犬口腔粘膜上皮和准备收获之前报道(19]。口腔粘膜上皮细胞获得颊黏膜的小猎犬狗。的收获 口腔颊粘膜组织与0.25%氯霉素溶液洗3次,切成小块,消化在一夜之间在4°C和0.25%中性蛋白酶(Dispase-II Sigma-Aldrich)。然后,上皮细胞层和镊子和0.05%胰酶消化分离(Gibco) 10分钟。悬浮细胞过滤、离心和无血清培养系统在角化细胞(K-SFM Gibco)补充了5μg / L重组人表皮生长因子和50μg / mL牛脑垂体提取物。主细胞通道2被用于进一步的实验。细胞培养基是在为期两天的间隔。

2.3。形成ADSC表

进一步的实验的有力ADSCs是收获。创建细胞表,ADSCs 被播种在60毫米鬼屋方面的细胞培养表面(热费希尔科学、圣何塞、钙、美国)。培养基是由低糖DMEM, 10%的边后卫,100毫克/毫升硫酸链霉素和100 U /毫升青霉素。一旦达到约80% -90%融合,ADSCs刺激了100μ维生素C (g / mL Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)刺激细胞外基质沉积。培养基是每2天更换一次。当犬ADSCs培养21天在37°C公司5%₂,我们减少了文化温度为30分钟20°C获得完整细胞表。

2.4。去细胞的ADSC表

过程中细胞溶菌作用引起的脱细胞处理,多种细胞内蛋白酶释放可能导致不良损坏本机ECM (20.]。为了保护这些蛋白酶的ECM,丝氨酸蛋白酶抑制剂,如抑肽酶(美国Sigma-Aldrich),用于保护ECM和胞内蛋白酶的相互作用。去细胞疗法被分为三组:(1)冻融方法:冻融一步在-80°C 2 h和随后解冻包含1磷酸盐(PBS)解决方案μg / mL抑肽酶在室温(25°C) 30分钟和冲洗PBS 24小时;这个过程重复了三次。(2)Triton x - 100方法:ADSC表被放置在去细胞的解决方案,包含1% Triton x - 100、0.02% EDTA, 10毫米三,1μg / mL抑肽酶,摇晃的ADSC表24小时在室温下,在磷酸盐和冲洗(PBS) 24 h。(3)SDS法:ADSC表被安置在去细胞溶液含有0.25%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.02% EDTA, 10毫米三,1μg / mL抑肽酶;ADSC床单是2 h摇摆不定在室温和洗用PBS 24 h去除残留试剂。ADSC表没有去细胞被设置为控制。

2.5。DNA量化

所有的样品都使用蛋白酶K消化解决方案2 h在37°C。消化样品在18000 g离心10分钟在室温下。每组的上层清液是提交给PicoGreen DNA化验(表达载体)和调整为空白样品干重和规范化。总DNA浓度测定的分光光度计(电子科学、CELBIO、意大利米兰)通过阅读光学密度(OD) ,对应的最大吸收氮的基地。

2.6。观察残余细胞的组件

观察细胞的去细胞效率表通过扫描电子显微镜(SEM)和苏木精和伊红染色())。)染色法被用来评估细胞的去除组件,并利用SEM观察形态学改变之前和之后去细胞的过程。组织学分析,脱细胞和原生ADSC表2 h在4%多聚甲醛溶液固定,与一系列梯度乙醇脱水,嵌在石蜡中。然后,5μ米厚的部分得到的切片机和彩色)染色。SEM,样本与2.5%戊二醛固定PBS为4小时。与PBS彻底清洗后,细胞逐渐由冻干脱水,然后晒干。标本被溅射镀铂和检查用扫描电子显微镜(SU8000系列;日立、日本东京)。

2.7。保留了细胞因子的分析

ELISA分析是用来确定ECM的保留因子。可溶性分子从ADSC表之前和之后去细胞中提取蛋白分离设备(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏应用科学,印第安纳波利斯)。样本均质。提取的溶解产物在15000转离心10分钟,和上层的收集。根据制造商的指示,ELISA检测(Kaiji生物工程、南京、中国)进行确定转化生长因子β(TGF -β),基本成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)水平在每组的溶解产物中提取。

2.8。机械测试

机械测试是用来测量之前和之后ADSC表去细胞的弹性。每组细胞表的削减规模 。扣人心弦的距离设置为10毫米。荷载位移曲线进行纵向切割表由微观材料测试系统(mtf - 100、上海大学、中国)在10毫米/分钟,直到发生破裂。张力和位移采样10次每秒,和样品在测试期间保持湿与PBS。

2.9。Cell-Seeding潜在

蚕丝蛋白据报道是一个潜在的再生医学生物材料和有潜力用于尿道重建(21]。丝素蛋白是由国家重点实验室提供的修改化学纤维和聚合物材料,从东华大学材料科学与工程学院,上海,中国。在这项研究中,我们观察到的cell-seeding潜力脱细胞ADSC表与丝素蛋白。脱细胞ADSC表都沉浸在high-glucose DMEM含有10%的边后卫在细胞培养2 h孵化器(37°C)。口腔粘膜上皮细胞使胰蛋白酶化和播种到丝素蛋白和脱细胞ADSC床单的密度 细胞/厘米²分别在6-well板。cell-loaded构造是孵化前4 h补充培养基在慢慢补充道。培养基是改变每2天。样本与扫描电镜观察细胞播种后3至7天。同时,细胞培养3天,7天之后,cell-loaded构造在4%多聚甲醛固定12 h和嵌入在石蜡。然后,5毫米串行部分生成和评估)染色。

2.10。细胞增殖实验

细胞计数kit-8 (CCK-8;南京凯基生物生物技术,中国)被用来评估口腔黏膜上皮细胞的生长动力学脱细胞支架的ADSC床单和蚕丝蛋白。脱细胞ADSC表和蚕丝蛋白被放置在96 -微型板块。总共 /口腔粘膜上皮细胞被播种在脱细胞ADSC床单和蚕丝蛋白总量的100μ分别L。CCK-8解决方案(10μL)被添加到每个37°C,孵化出了30分钟。随后,每个好测量的吸光度值标在450 nm天1,3,5,7细胞后播种。在不同时间点的吸光度值被用来构造一个生长曲线来对比两个支架的细胞增殖能力。

2.11。生物相容性

商业小肠粘膜下层(SIS)(美国库克泌尿,斯宾塞)是最广泛的临床使用ECM和来自猪的小肠粘膜组织。男性Sprague-Dawley老鼠,老化的6 - 8周,购自上海松弛实验动物有限公司(上海,中国)。老鼠麻醉与戊巴比妥钠腹腔内注射(30毫克/公斤)。腹股沟皮肤切口的1.5厘米;然后的面积 脱细胞ADSC床单或SIS皮下植入老鼠的腹股沟(异种移植)和细胞升降机研究体内生物相容性,和组织样本检索1周、3周。评估骨干与炎性反应,圆)染色进行观察单核细胞和多核移植的异物巨细胞浸润的网站。免疫组织化学分析用CD68(1: 800稀释,Abcam)。幻灯片与三羟甲基氨基甲烷/ HCl-buffered盐水液洗(TBS) + 0.025% Triton x - 100与温和搅拌然后阻塞在TBS含有5%牛血清白蛋白在室温下2小时。样本处理CD68主要抗体和孵化一夜之间在4°C,其次是与PBS洗5次。部分是培养1小时在室温下用二次抗体(1:1500),其次是后续链接到辣根过氧化物酶和底物/色原反应使用immunoperoxidase二级检测设备(微孔、Billerica MA)。Th1细胞,分泌和干扰素- - 2γ,引发phagocyte-dependent炎症和细胞介导的免疫反应。Th2细胞产生il - 4和il - 10,引起体液免疫(抗体生产)和嗜酸性粒细胞积累22]。实时定量PCR (qPCR)是用来测量的mRNA水平局部细胞因子,包括2、干扰素-γ、il - 4和il - 10,评估非细胞的免疫原性和免疫反应性组织。正常鼠腹股沟皮下组织设置为对照组。获取组织的总RNA (SIS和脱细胞ADSC表)提取试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,CA),然后反向转录成互补脱氧核糖核酸定量rt - pcr试剂盒(豆类;志贺、日本)。执行目标基因的PCR分析StepOnePlus™实时PCR系统(生命技术、新加坡)使用SYBR绿色PCR大师混合工具(技术)。引物序列设计、购自上海Sangon公司(上海,中国)。与引物PCR进行:5 - 2(向前 - - - - - -TTGTCTTGCATCGCACTGAC-3 ,反向5 - - - - - -GAGAGGTCCTACGAGTGTAA-3 ),干扰素-γ(前5 - - - - - -CACCCGAACCTCTTCCTT-3 ,反向5 - - - - - -TCCCTGGTTCATCCGTCGGTT-3 ),il - 4(前5 - - - - - -TCCCAACTGATTCCAACTCTG-3 ,反向5 - - - - - -CTTGTAGGAGTGTCGCTCTT-3 ),和il - 10 (5 - - - - - -GAGTCGAGAAGAGTTGCCATC-3 ,反向5 - - - - - -CTACCGTTGAGAAGAGCTGAG-3 )。狗GAPDH基因被选为参考(向前5 - - - - - -TAACTCTGGCAAAGTGGATATT-3 ,反向5 - - - - - -ATGACAAGTTTCCCGTTCTC-3 )。PCR条件如下:35周期放大30秒的变性在95°C, 30秒58°C的退火和30秒72°C扩展的最后5分钟的伸长一步在72°C。褶皱对基因表达变化进行了量化比较Ct使用方法: 。

2.12。统计分析

数据被表示为 偏差。组间显著差异估计使用学生的 - - - - - -测试和/或非参数测试。统计分析了SPSS 17.0(美国纽约IBM)。小于0.05的值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。ADSC文化和ADSC表的形成

主要培养ADSCs坚持板体外增殖迅速。可以确定ADSCs干细胞特异性的结合表面标记。ADSCs可以表达一些可检测的特异性蛋白质和CD标记,如积极的蛋白质标记,包括CD29、CD44, CD73, CD90、CD105,存在,缺乏造血CD45标记和CD34的表达(23]。流式细胞术分析表明,主要培养ADSCs在我们的研究中被负面造血CD45标记和强阳性MSC-related CD90和CD105标记(数字1(一)- - - - - -1 (d)),这证实了干细胞ADSCs起源。ADSCs似乎集中螺旋状分布,大多是在一个长梭形形状单一核(图1 (e))。犬ADSCs培养连续21天,ADSC表获得通过减少温度方法为30分钟(图25°C1 (f))。在倒置相差显微镜下,细胞密切相互混合和周围丰富的ECM(图1 (g))。

3.2。用不同的方法评价脱细胞的效率

)染色前后去细胞的治疗方法是用来评估有效地清除细胞组件和保护ECM架构(图2(一个))。)染色显示ADSC表由5 - 7层的细胞平均厚度 。与反复冻融法相比,细胞可以有效地通过SDS和特里同x - 100的方法。特里同x - 100样品保留胶原蛋白的安排,而原ECM结构被破坏了SDS脱细胞样品和胶原纤维的网状受到干扰,甚至部分破裂。SEM照片显示一个强烈的和统一的ECM微观结构在自然ADSC表(图2 (b))。蛋白质纤维明显暴露去细胞粘附分子和蛋白质被移除时流程。大量细胞组件保留freeze-thaw-treated样本。SDS去细胞过程的间隙率高)染色的细胞组件观察和扫描电镜图像,但它也诱导胶原纤维支架的结构损伤,出现在ECM分裂和破坏蛋白。在脱细胞Triton x - 100样本,胶原纤维可以识别和似乎很有条理的,没有任何残余细胞或细胞碎片。然后,评价删除所有细胞成分的功效细胞板,我们三个去细胞的DNA定量分析进行治疗。如图2 (c)与反复冻融法相比,特里同x - 100和SDS的方法减少了DNA内容更有效( )。DNA的数量去细胞后的ADSC表 , ,和 冻融ng /毫克干重,特里同x - 100和SDS治疗,分别 相比,本机ADSC表( 所有病例/毫克)。此外,DNA量化还指出,大约95%以上的核材料被特里同去细胞过程的x - 100和SDS法( )。因此,根据量化的DNA,他走时染色,和SEM评估,海神x - 100去细胞筛选方法用于进一步的实验,可以去除细胞组件或保持胶原纤维结构。

3.3。保留细胞因子分析和机械测试

那些脱细胞的平均厚度ADSC床单和ADSC床单 μm和 μm,分别。脱细胞ADSC表有一定的机械强度,易于处理和转移(图3(一个))。细胞因子的保留是由ELISA分析自然和脱细胞的蛋白质提取ADSC表(图3 (b))。细胞因子在本地丰富的ADSC表,包括大量的VEGF ( 干重)、bFGF ( 干重),TGF -β( 干重)。虽然在去细胞细胞因子含量略有降低,高水平的VEGF ( ng / g干重)、bFGF ( ng / g干重),TGF -β( ng / g干重)也出现在脱细胞ADSC表和细胞因子VEGF水平,bFGF, TGF -β在脱细胞ADSC床单是类似于自然ADSC表( ),这可能导致细胞粘附、迁移、增殖和分化。梁进行力学行为的代表的ADSC床单之前和之后去细胞图所示3 (c)。没有显著差异的ADSC表之前和之后去细胞力学参数( )。详细的参数如表所示1。

3.4。Recellularization能力

确定的recellularization能力去细胞ADSC床单,口腔粘膜上皮细胞(图4(一))被播种到脱细胞ADSC床单和丝素蛋白和细胞移植和细胞生长状态检查。CCK-8试验表明,吸光度值随时间稳步上升在两个支架,而脱细胞ADSC床单展出增殖能力高于蚕丝蛋白在任何时间点(图4 (b))。)染色结果显示,与蚕丝蛋白相比,口腔粘膜上皮细胞扩散迅速合并成线,高度紧张的脱细胞ADSC表在第三天。此外,口腔粘膜上皮细胞生长一层一层地和一定厚度的上皮细胞层(4 - 6层)形成在第七天播种(图4 (c))。SEM结果表明,细胞是紧密相连的,只有少数坏死细胞在脱细胞ADSC表3天的文化和典型的cobblestone-like形态学显示在脱细胞ADSC表在第七天播种,而对于蚕丝蛋白recellularization,有很多坏死细胞和部分暴露丝素蛋白结构的3天可以看到文化;虽然细胞密度显著增加7天的文化中,仍有一些缺陷,无法形成一个细胞融合结构(图4 (d))。因此,他走时染色和细胞计数Kit-8化验证实了更好recellularization脱细胞ADSC表比丝素蛋白的能力。

3.5。生物相容性测试

我们评估了脱细胞的生物相容性ADSC表体内移植1周和3周;然后用)染色组织学分析。的脱细胞ADSC表处理Triton x - 100和SIS移植显示在短期内明显的炎症反应期1周(图5(一个))。发现,炎症细胞,含有单核细胞和嗜中性粒细胞浸润为主的移植。植入后3周,渗透炎性细胞明显减少的数量随着时间的推移,特别是对脱细胞ADSC表(图5(一个))。CD68染色被用来评估单核细胞和巨噬细胞浸润在移植网站(图5 (b))。Th-related细胞因子的检测移植网站价值的理解当地的免疫反应的状态。Th1 / Th2细胞因子mRNA表达的移植网站被qPCR进一步确定,如图5 (c)和5 (d)。在移植后1周或三个星期在正常皮下组织,和干扰素- - 2 mRNA表达水平γ没有显示统计区别脱细胞ADSC床单和异种的SIS ( )。此外,两组都显著上升的mRNA水平比正常皮下组织il - 4和il - 10在移植后1周;然而,脱细胞的mRNA水平的il - 4和il - 10 ADSC表下降迅速,显然是高于异种的SIS在移植后3周( )。

4所示。讨论

脱细胞ECM-based生物材料表现出重要的应用前景外科植入物和组织工程支架。在我们的研究中,最优脱细胞过程探讨了准备一个ADSC sheet-derived ECM bioscaffold,保留完整的ECM超微结构和丰富的细胞因子,这些细胞播种等仿生支架可能产生功能性组织工程再生医学移植。

经典的去细胞方法包括物理、化学和生物治疗和他们的组合,但没有单一的技术,适合各种组织和器官。最有效的代理去细胞将取决于多因素,包括组织的细胞结构,脂质含量,密度,厚度20.]。理想的去细胞方法可以删除所有细胞组件和保留ECM的完整性和微观结构。在这项研究中,我们首先选择最佳的去细胞协议准备脱细胞ADSC表。DNA的结果量化和圆)染色法作为定量的标记细胞残骸(7):(1)DNA定量小于50 ng / mg ECM干重和(2)看不见的核材料染色)。反复冻融导致细胞内冰晶的形成,并可能破坏细胞膜和细胞结构,导致组织分裂和细胞死亡。冻融处理证明生产小ECM超微结构的破坏,保护弹性蛋白量,并保留机械性能(24]。然而,这些冻融治疗通常不足以实现完整的去细胞,这个过程必须遵循由其他去细胞的过程。在目前的研究中,产生的DNA仍大脱细胞ADSC表内容,达到 冻融治疗(图2)。

离子洗涤剂是有效的增溶的核和细胞细胞质膜,但倾向于变性蛋白质通过扰乱蛋白质-蛋白质之间的关系(25]。SDS是最常用的离子去除细胞残留的洗涤剂。特里同x - 100相比,SDS通常更有效的在细胞清除但ECM超微结构的更大的干扰(相关联2]。心包,已经表明,去细胞1% SDS使不可逆转的肿胀和破坏胶原纤维相比,抗拉强度,降低本地组织(26]。薄ECM板,厚度和韧性的ADSC表小于原生的组织,如心包,我们减少了SDS浓度到0.25%。虽然DNA量化和圆)染色显示细胞的间隙率高组件(图2),然而,和胶原蛋白弹性纤维分布网络中断后的脱细胞ADSC负债表SDS治疗(图2)。非离子去污剂打破lipid-protein和lipid-lipid交互但离开完整蛋白质-蛋白质之间的关系和维护固有的结构(27]。特里同x - 100是应用最广泛的非离子去污剂对去细胞过程和更合适的消除细胞从薄组织比厚和复杂的组织(28]。脱细胞的胶原蛋白含量海神x - 100年骨骼肌组织几乎完全保留相比减少约27%到31% trypsin-Triton x - 100 - sds组和trypsin-SDS集团(29日]。DNA和细胞的间隙比组件Triton x - 100年样本类似SDS的示例,但它保持ECM微环境并没有影响胶原纤维结构(图2);因此,海神x - 100筛选用于ADSC表去细胞在我们的实验。

ADSCs可以分泌一种广泛的生长因子和细胞因子,调节炎症反应,促进血管生成,并招募内源性干细胞,这可能有助于协调原位组织再生(30.]。此外,干细胞分泌大量的内生ECM,它提供了一个原生细胞微环境加强细胞粘附、增殖、分化、迁移和组织形态发生。通过绑定到特定的ECM分子,分泌各种细胞因子、生长因子、趋化因子和ECM内沉积31日]。ECM的保存超微结构和组成也帮助存储和释放生长因子。细胞因子的生产相对缓慢,成熟的细胞因子结合ecm占多数ADSC表。春et al。32)报道,膀胱非细胞矩阵保存丰富的内生增长因素去细胞处理后,包括bFGF、VEGF和TGF -β,它类似于我们的脱细胞ADSC表(图3 (b))。同时,ECM提供了一个理想的微环境可以加速血液循环和交换氧气和营养细胞和外部环境之间的关系。天然支架材料,先前的研究表明,丝素蛋白可以被塑造成一个表或电影支持形成的上皮和显示显著的优势,包括生物相容性、温和的机械性能和低成本33- - - - - -35]。然而,就像任何其他nonautologous生物材料,蚕丝蛋白可以诱导一些不良免疫反应事件的起源相同。因此,我们将cell-seeding潜力与丝素蛋白在体外以避免免疫排斥反应。不同于丝素蛋白、脱细胞ADSC表作为支架为细胞提供一个“本地”生物环境附件并保存大量的生长因子促进细胞增殖,理所当然地,使用薄ECM表允许更容易recellularization比合成支架,和实验研究的结果和理论分析是一致的在口腔粘膜上皮细胞接种后7天。口腔粘膜上皮细胞的脱细胞ADSC负债表上显示优越的扩散能力相比,蚕丝蛋白(图4)。细胞外基质有三维结构促进细胞粘附和分化,也为组织再生提供了一定的机械强度。因此,它可以用作一个满意的软组织再生修复材料。

SIS富含胶原蛋白、粘多糖和生长因子,已被用作生物材料支架为骨骼,韧带,皮肤缺损,血管、腹部体壁,尿道狭窄,硬脑膜在临床和临床前研究。此外,许多研究显示SIS几乎没有被拒绝的风险因为它非细胞。因此,我们将组织相容性和免疫排斥与SIS体内。核酸DNA和细胞膜抗原表位负责不良炎症和免疫反应在异种的或同种异体器官移植。脱细胞的过程会导致细胞膜受体的损失,大大降低了细胞的抗原性。然而,细胞膜和核组件是难以完全消除,将激活宿主免疫反应残余细胞组件和异基因的蛋白质。此外,非细胞矩阵的异构组件仍然有一定的免疫原性,可产生免疫排斥反应,甚至导致死亡的患者移植后(36]。在这项研究中,炎症反应是进行组织学检查1周和3周后体内移植,结果显示急性炎症细胞浸润引起的脱细胞ADSC表和异种的SIS在早期阶段(1周)和主要集中在界面的组织缺损,这可能是一个非特异性术后炎症反应(图5(一个))。然而,他走时染色不足以描述炎性细胞积累样本。CD68是110 KD跨膜糖蛋白和高度表达的单核细胞和组织巨噬细胞。脱细胞ADSC负债表移植相比,更多表达的SIS植入CD68在不同时间点,证实了SIS注入了更严重的炎症反应(图5 (b))。小鼠植入异种的SIS SIS-specific抗体反应,CD3⁺T细胞浸润,Th2-like免疫反应(37]。Th2反应与捐献者的身体接受异基因的蛋白质,组织或器官(38]。炎症反应消失,在脱细胞和单核细胞和巨噬细胞显著减少ADSC表3周的移植,而炎症仍然在移植的异种的姐姐,这证明了脱细胞ADSC表具有良好的生物相容性。同样,Th-related mRNA表达的细胞因子通过qPCR是依照组织学分析的结果。Th1细胞已被证明在抗肿瘤免疫中发挥重要作用和细胞介导的刺激反应。促炎细胞因子如TNF -α和干扰素-γ众所周知,刺激Th1细胞。相比之下,Th2细胞被作为辅助细胞影响b细胞发育和产生抗炎细胞因子il - 4和il - 10等。Th1-related细胞因子(和正- - 2γ)mRNA表达显示,两组无显著差异,其中表达量是类似于正常的皮下组织,这表明异种的SIS和脱细胞ADSC表都没有造成T细胞介导免疫排斥。然而,Th2-related细胞因子(il - 4和il - 10) mRNA表达明显高于比脱细胞异种的SIS的ADSC床单,这表明异种的SIS是免疫原性和免疫反应是体液免疫过程遵循一个特定的异基因的蛋白质和由Th2异种的移植后淋巴细胞。此外,高表达的il - 4和il - 10促进巨噬细胞极化M2消炎表型可移植有利于缓解当地的炎症反应,促进血管生成,组织重构,和修复(39]。在进一步分析中,与正常皮下组织相比,高基因表达的il - 4和il - 10被发现在两组移植后1周和3周,这表明SIS和脱细胞ADSC表都可以诱导抗炎的效果。然而,脱细胞的mRNA水平的il - 4和il - 10 ADSC床单明显高于异种的SIS在移植后3周,显示脱细胞ADSC表提供了更强大的和持久的抗炎效果。先前的研究表明间充质干细胞促进巨噬细胞表型的优惠转变从M1, M2和促进组织修复40];因此,我们推测,脱细胞的抗炎效果ADSC表有关immune-modulating ADSC的特征。

在这个实验中,我们开发了一个非细胞矩阵使用ADSC表Triton x - 100去细胞,初步评价其细胞相容性和免疫反应性的特征。然而,生物材料的优点和缺点需要评估在许多方面和一些限制应该被认为是在这个研究。首先,我们只发现几个保留细胞因子水平;更广泛的细胞因子分析应该执行在以后的实验。此外,biomaterial-mediated体内免疫是一个复杂的过程。我们的研究表明脱细胞ADSC表拥有比姐姐更好的生物相容性,但潜在的脱细胞ADSC表机制诱导减少炎症仍未知,需要进一步调查。需要进一步的研究来探索脱细胞ADSC片移植后宿主免疫机制和提供更详细的信息,这些生物支架的适应性有或没有细胞播种的修复和重建受损的软组织和器官在活的有机体内。

5。结论

我们建立了一个新的bioscaffold通过结合使用的细胞表技术和特里同x - 100去细胞协议。的ADSC sheet-derived ECM支架保留ECM的三维结构,保留了机械强度,表现出好的recellularization潜力,减少炎症,具有很好的应用前景自体或同种异体的软组织扩张和重建。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者都没有财务披露或利益冲突。

作者的贡献

Shukui周,应王,恺乐张同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81800593和81800593),孵化项目四川省优秀青年科学家基金(批准号2019 jdjq0039),四川省卫生委员会的关键研究基金会(批准号19 zd015),“带和道路”青年科学家交流项目的上海市科学技术委员会(批准号18410741600和18410741600),博士创新基金的上海交通大学医学院(批准号BXJ201943)和上海的上海领袖培训计划。

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