在小鼠骨髓基质细胞的神经元分化的早期碱性成纤维细胞生长因子诱导基因谱

摘要

稳定建立的具有自我更新和多向分化潜能的小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)群体得到扩展体外超过50个段落。这些细胞表达高水平的间充质干细胞标记物，可分化成成脂肪的、成软骨的和成骨的谱系体外．进行碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的治疗，典型的神经元表型在这些细胞中被诱导，通过神经元形态，神经元标记的诱导，和相关的电生理学兴奋所支持。To identify the genes regulating neuronal differentiation, cDNA microarray analysis was conducted using mRNAs isolated from cells differentiated for different time periods (0, 4, 24, and 72 h) after bFGF treatment. Various expression patterns of neuronal genes were stimulated by bFGF. These gene profiles were shown to be involved in developmental, functional, and structural integration of the nervous system. The expression of representative genes stimulated by bFGF in each group was verified by RT-PCR. Amongst proneural genes, the mammalianachate-schutehomolog 1 (mash1)是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，进一步被证实显著上调。在小鼠骨髓间充质干细胞中过表达Mash-1可诱导神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达和神经元末端形态，提示Mash-1在诱导小鼠骨髓间充质干细胞神经元分化中发挥重要作用。

1.介绍

骨髓基质细胞(BMSCs)含有间充质干细胞[1能够区分分为中胚层起源的各种后代，例如成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞[2］.研究表明，骨髓间充质干细胞移植后也可以表现出神经表型，改善不同神经障碍的缺陷[3.-6.］.骨髓间充质干细胞可以通过不同的方法分化成不同的神经细胞体外[7.那8.]，证明了多能分化能力和有希望的BMSC的治疗值。然而，差异化概念最近被强烈争论，作为对神经元分化协议采用的一些化学物质的压力反应[9.那10］.也有人认为，与神经干细胞相比，bmscs来源的神经元细胞仅通过一组神经元基因的检测获得部分神经元特征[11］.因此，为了更好地说明这种现象，需要进一步确定具有适当的分化策略的分化BMSCs的神经元性状，尽管存在这种现象体内记录神经元分化BMSCs的生理特性的移植研究。

目前，大多数神经元基因如分化骨髓基质细胞检查被主要用作基准标记物的神经元分化，但很少用于阐明发起和/或调节神经元分化的作用机制。最近的研究表明，基因沉默抑制骨髓基质干细胞的表型不和谐也对神经元的分化很重要[12]，表明动态基因调控参与了BMSC的神经元分化。此外，基于确定的神经元基因的可用性，确定BMSCs的神经元表型是相当困难的[11］.cDNA微阵列分析为基因谱分析的有力工具，并已被广泛用于基因表达的动力学测定。两项研究应用这个方法来解开小鼠骨髓基质干细胞神经元的基因调节特征。例如，森研究永生化人骨髓基质干细胞的神经元分化[13]并且发现分析的基因来自一周神经元分化过程的后期，而不是早期的启动阶段。这种启示将反映分化BMSCs中显性基因的神经特征。yamaguchi进一步研究了DMSO诱导的BMSC的神经元分化中的神经元基因表达谱[14]，直接落入BMSC分化为加入某些化合物，其触发的急性非生理应激反应从而使其不可靠的直接结果之前的辩论。学习适当的生理条件下的神经元分化，我们已经建立的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的小鼠BMSC神经元分化[模型15］.在本报告中，我们打算进一步检查由BFGF诱导的神经元分化的早期阶段的基因表达谱，我们试图进一步阐明BMSC的神经元分化的潜在机制。

bFGF是一种154-氨基酸多肽，是首个在检测骨髓间充质干细胞神经元分化能力的初步研究中使用的生长因子[16那17］.除了它的广泛的对细胞生长，分化和存活的生物活性，诱发FGF信号传导途径也已证明是在鸡胚神经诱导[前提因子18]和神经管中后神经元前体的诱导剂[19］.在神经系统中，FGF的成员影响神经元的分化和迁移，突触突触的形成和成熟，以及侮辱后神经元电路的修复[20］.碱性成纤维细胞生长因子增加创伤性脑损伤后骨髓间充质干细胞移植介导的治疗效果[21］.在体外研究发现，bFGF可诱导胚胎干细胞形成神经管[22]，以及色素上皮细胞转分化为视网膜神经元[23]也有报道。通过促进神经元增殖[bFGF-和的双重传送NGF结合凝聚层赋予神经保护24］.所有这些调查结果都单挑了BFGF作为具有广泛功能范围内的有效散文因素。然而，潜在的机制，尤其是神经元转移化的机制尚不清楚。发现用凹口的细胞内结构域转染的BMSC被发现在BFGF存在下更有效地诱导到神经元样细胞中[9.］.Notch信号通路在神经发生中起着关键作用果蝇[25］.Notch信号解除管制涉及许多神经退行性疾病和脑疾病[26那27].包括bHLH家族在内的几组分子直接受Notch通路调节，Notch通路通常调节神经决定和分化[28那29］.此外，Notch通路的所有基因都被发现保存在脊椎动物中[30］.一个清晰的例子是Mash-1，一种BHLH家族成员基因，在缺口信号通路的突变中显然在小鼠中显然受到影响，这导致神经发生的突变[31］.然而，它仍然不明确于陷波信号传导如何调节BMSCs的神经元分化。

在我们尝试更好地理解参与BMSC的神经元分化的基因中，我们采用cDNA微阵列策略在各个时间点依次分析BFGF活化的神经基因。我们观察到BFGF激活的神经基因表现出明显的表达动力学，最重要的是参与各种神经活动。我们进一步证明，在分化的早期阶段诱导哺乳动物骨髓基因，MASH-1，并且BMSC可以通过醪-1的过表达被驱动到神经元细胞中。我们的作品介绍了BFGF对BMSC的神经元分化的分子机制的介绍。

2.材料和方法

2.1。小鼠BMSCs的分离和培养

Bone marrow stromal cells (BMSCs) of 8-week-old male Swiss mice were initially cultivated in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 10% newborn calf serum (NCF; Invitrogen), 100 U/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin (Invitrogen). The cells were incubated at 37°C in 5% CO₂in 100 mm tissue culture dishes for 2-3 days, and nonadherent cells were removed by medium replacement. Adherent cells were further cultured for 7-10 days to reach 90% confluence and defined as the first passage. After detachment with 0.25% Trypsin/0.5 mM EDTA, around 25% of the cells were transferred to a new culture flask. A fairly homogeneous cell population was achieved after 4-5 passages, and these cells could be continuously cultured for up to 50 passages without obvious growth retardation.

２.２.荧光激活细胞分类(FACS)分析

样品含有 将细胞重新悬浮于300 μ.l的FACS缓冲器( ）并在4°C温度下用3 μ.l的异硫氰酸荧光素- (FITC-)，藻红素- (PE-)，别藻蓝素- (APC-)和环磷脂叶绿素蛋白- (Per-CP-)结合抗体，分别对抗CD34, CD44, CD45, CD90.1, CD117, CD105和Sca-1表面标记物。所有抗体均来自Pharmingen (BD Pharmingen)。加入6 ml FACS缓冲液，4℃260 × g离心5 min成球。标记细胞在500年后重悬μ.升FACS缓冲液，并通过BD FACS咏叹调流式细胞仪分析。

2.3。成脂诱导分化

以密度的密度覆盖扁平BMSCs上的6孔组织培养板 cells per well and incubated for 24 hours before treatment with adipogenic differentiation medium (500 nM Dexamethasone, 250 μ.异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)， 100μ.中号吲哚美辛，和5 μ.在基础DMEM中添加10%胎牛血清、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素)。每3天更换一次培养基，在初始成脂诱导后10天通过苏丹黑染色评估成脂分化。

2.4。苏丹黑染色

将细胞用PBS漂洗，并用固定Baker的溶液10分钟，随后暴露3分钟至100％的丙二醇。然后将细胞用苏丹黑染色2小时，接着洗涤3次，用水。其次另一2分钟暴露于85％的丙二醇和最终洗涤3次，用水。正苏丹黑染色细胞出现在光镜下蓝黑色。

2．5．Chondrogenic分化

软骨细胞分化是使用高密度微团培养技术[诱导32］.一个10 μ.浓缩的细胞悬浮液的升降（ 将细胞/ ml）置于井中的中心（24孔组织培养板）并允许在37℃下用5％CO附着和聚集2小时₂．软骨诱导培养基(50 nM抗坏血酸-2-磷酸，6.25μ.g/ml insulin, and 10 ng/ml transforming growth factorβ1在基础DMEM中添加1%胎牛血清和1%青霉素-链霉素)，然后轻轻覆盖，避免破坏附着的细胞。然后每3天更换培养基，在初始软骨诱导后3周通过阿利新蓝染色确定软骨形成表型。

2.6。阿尔新蓝染色

微团培养物用PBS冲洗并固定在2％多聚甲醛15分钟。They were then rinsed with 3% acetic acid for 5 minutes to bring down the pH to 2.6 followed by 20 minutes staining with 1% Alcian Blue (pH 2.6). Cells were then washed twice with water before being observed under light microscopy. The highly sulfated proteoglycans of cartilage matrices were positively stained blue.

2.7.成骨分化

将细胞接种在24孔板上，并在成骨分化培养基（50%）中培养 μ.M抗坏血酸-2-磷酸，10 嗯β-glycerophosphate, and 100 nM dexamethasone in DMEM basal medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin) after 24 hours incubation. The media was changed every 3 days. Osteogenic differentiation was assessed by Alizarin Red S staining 3 weeks postinitial osteogenic induction.

2.8。茜素红的染色

用PBS冲洗细胞两次，并在-20℃下固定在冰冷的70％乙醇中。在用去离子水冲洗后，在室温下用40mM茜素红S（pH4.1）温育细胞20分钟，温和振动。进行另外4个用去离子水洗涤，以清除细胞上的未特异性染色。用茜素红S染色证实钙化细胞外基质的分泌。

2.9。神经源性分化

对于神经元分化，每隔一天分离并分裂BMSC细胞。通过暴露于10ng / ml碱性成纤维细胞生长因子来诱导神经源分化。从通道开始加入神经元分化培养基（补充有10％的FBS和10ng / ml BFGF的低葡萄糖DMEM）通过微观观察监测神经元分化，并通过RT-PCR，西方进行神经元标志物的表达印迹和免疫组化。

2.10。cDNA微阵列分析

在bfgf处理后4、24和72小时收获BMSCs，按照制造商的说明(Invitrogen公司)使用Trizol试剂提取总rna。cdna被合成并经过安捷伦小鼠发育寡核苷酸芯片(Agilent Technologies)处理。微阵列实验使用独立实验的RNA样本重复两次，报告的结果是基于这两次独立实验的平均值。筛选出差异至少2倍的cdna进行进一步分析。cDNA微阵列实验对研究者是盲的，微阵列数据分析也由3个独立的研究者对样本是盲的进行评估。

2.11。逆转录聚合酶链反应分析

聊天，GAP43，HES5，MASH1，NSE，TAU，SERT，MAP2和β通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定3-微管蛋白。使用Trizol试剂（Invitrogen）分离细胞总RNA，并使用Invitrogen的第一链cDNA合成Superscript III RT试剂盒进行逆转录。使用以下引物进行PCR扩增（按以下顺序显示在括号中：正反义），ChAT（5 -TGTGAGGAGGTGCTGGACTTA-3 那5. -GCCAGGCGGTTGTTTAGATA-3 )，GAP43（5. -GCTAGCTTCCGTGGACACATA-3 那5. -AGGCACATCGGCTTGTTTA-3 )，Hes5 (5 -ATGCTCAGTCCCAAGGAGAA-3 那5. -CGCTGGAAGTGGTAAAGCAG-3. )，Mash1 (5 -GCTCTGGCAAGATGGAGAGT-3 那5. -CCAGTTGACCAACTGACC-3 )，τ(5 -ccctggaggaggaatataaga-3 那5. -GCAGACACTTCATCGGCTAGT-3 )，和nse（5 -TGATCTTGTCGTCGGACTGTGT-3 那5. -CTTCGCCAGACGTTCAGATCT-3 ）.通过建立的Genbank序列测定所有引物序列。使用重复的PCRS使用β肌动蛋白(5 -TGTTACCAACTGGGACGACA-3 那5. -tctcagctgtggtggtggtgaag-3 那39.2 bp) as a control for assessing PCR efficiency and subsequent analysis by agarose gel electrophoresis.

2.12。定量实时PCR（QRT-PCR）

按照制造商的说明使用Trizol试剂提取总RNA。用RNase-free DNase I (Invitrogen)去除基因组DNA污染后，RNA (1μ.g)用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(Promega, Madison, USA)逆转录成cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)在ABI PRISM 7500实时循环仪(Applied Biosystems)中进行实时PCR。目的基因的mRNA水平归一化为β-肌动蛋白。使用解离曲线软件构建熔融曲线，以确保仅扩增单个产物。根据Livak和Schmittgen的方法，相对表达强度基于2 − ΔΔCT方程。的PCR引物的序列如下：SERT（5 -TGCCTTTTATATATCGCCTCCTAC-3 那5. -CAGTTGCCAGTGTTCCAAGA-3 )，地图2（5） -TCAGGAGACAGGGAGGAGAA-3 那5. -GTGGAGGTGCATTTTT-3 )，β3微管蛋白（5- -catggacagtgttcggtctg-3. 那5. -CGCACGACATCTAGGACTGA-3 )，SV2A（5. -GGTTCACGACACAACATGC-3 那5. -Actttggttcggggctgcata-3 )，和SNAP-25 (5 -CGCAATGAGCTGGAGGAGAT-3 那5. -tcccttcctcaatgcgttcc）。

2.13。免疫印迹

细胞s were lysed with lysis buffer (50 mM Tris-Base, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM MgCl₂，10％甘油，1％Triton X-100和Roche的完全蛋白酶抑制剂片剂），并在4℃下以14,000×g离心20分钟。50. μ.从上清液的蛋白质的克8％-12％SDS-PAGE凝胶上分离，并转移至PVDF膜。免疫印迹法进行与多克隆抗体聊天，GAP43，HES5，MASH1，NSE，头，和β分别为-actin。与过氧化物酶 - 缀合的二次抗免疫球蛋白抗体一起孵育后，使用Pierce的West Pico化学发光法开发膜。

2.14。电生理学

对于整个细胞电流记录，如前所述（37）被擦拭细胞。含有浴溶液（以mm）NaCl 150，KCl 5，MgCl₂1，Cacl.₂2.2，Hepes 10，pH 7.3，用NaOH调节渗透压，用葡萄糖调节渗透压至310 mOSM。移液管溶液含有（mM）天冬氨酸钾盐120，MgCl₂5, EGTA 0.5, Hepes 10, ATP 2, GTP 0.3, pH 7.3与KOH混合，将渗透压调节到295 mOSM。Axopatch 200B放大器(Axon Instruments)电压钳位下获得全细胞电流;软件为pClamp 8.1 (Axon Instruments)。电流在10khz采样，在1khz滤波。采用P/4协议在线消除泄漏。所使用的移液管为1-2 mω.那和the series resistance was typically <5 mω.并得到75%的补偿。保持电位设置为-70 mV，并去极化到不同的电压以唤起通道开启。

2.15。质粒建设

鼠标醪-1的编码区克隆到用方便的限制性位点pREP10矢量。MASH1的PCR产物用消化kpn.我和XhoI，纯化并连接至酶切的pREP10表达载体。然后将mash1的bHLH结构域融合到V5表位上。PCR生成的所有结构物在使用前均经过测序验证，用Mash-1抗体和表位标签V5进行western blotting确定蛋白表达。

2.16.转染

细胞接种到100 mm组织培养皿，并在转染前过夜 μ.质粒DNA的克用60混合 μ.L Lipofectamine 2000试剂引发复合物成形。通过将混合物直接添加到细胞中来引发转染。将细胞提取并测定3天后缩合。

2.17。免疫荧光染色

For immunofluorescence staining, cells were seeded on Lab-Tek chamber slides and fixed with precold methanol at –20°C for 3 min. Then, the cells were permeabilized with 0.2% TritonX-100 in PBS for 15 min and blocked with 10% normal goat serum in PBS at room temperature for 30 min. The cells were incubated with the primary antibodies at 37°C for 1 h, washed with PBS twice, and then were incubated with the appropriate fluorescein isothiocyanate-conjugated secondary antibodies for 30 min. Finally, the cells were mounted with an antifluorescence quenching sealing liquid for observation under a fluorescence microscope.

2.18。统计分析

所有数据都显示为 (SEM)。学生 -检验用于确定个体比较之间的显著性。采用Bonferroni校正的单因素方差分析检验用于多重比较。计算使用SPSS 11.0版统计软件进行。值< 0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。不同通道的BMSCS的多因素

从小鼠的股骨骨骼中分离出小鼠BMSC，并在补充10％FBS，10％FCS和1％青霉素 - 链霉素的DMEM中培养。在4-5个通道后最终获得成纤维细胞样细胞群，并且这种细胞群可以在我们的实验条件下连续生长超过50个通道，而不会失去大部分可塑性并出现健康。由于来自其他细胞类型的竞争，早期通道的细胞生长速率降低，4-5次通道后达到均匀细胞群的稳定阶段。从段落6到50追踪的细胞形态显示一致的表型和均匀性水平（图1（a））.据报道，细胞特征和可塑性可能因长期而有所不同体外文化 [33]因此，我们检测了不同传代的骨髓间充质干细胞的几种细胞表面标记物。流式细胞术结果显示这些细胞显示出高水平的Sca-1[34]，干细胞标记物和CD44 [35]，横跨通道6,25和50的间充质标记物（图1（b）).正如所怀疑的，所有造血细胞标记物CD90.1、CD45、CD34和CD117在所有传代的BMSCs中均未检测到或表达不良（图1（b））.我们还检测了另一种标志物CD105用于鉴定不同传代的BMSCs，其阳性结果与预期一致(图)1（c））.这些数据表明在指示的通道这个高度同质的细胞群表现出的间充质干细胞标记物，距离明显造血细胞污染。

为了确定骨髓间充质干细胞的多向分化能力，细胞向间充质来源进行一系列分化，即脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。如图所示2，将细胞以6个25代可以分化成脂肪细胞，并通过生化试验所确定的软骨细胞，而细胞在传代50可以分化成所有三种细胞类型。这些结果与前面的观察一致，即与脂肪细胞分化的能力的BMSCs具有集落形成的高容量[36.]虽然骨髓间充质干细胞的默认承诺是进行成骨分化，但这种现象仅在骨髓间充质干细胞的早期发育阶段观察到。

3.2。骨髓基质干细胞诱导的神经元分化在bFGF

通过bFGF的[对小鼠BMSC神经元分化的模型15]已被建立以阐明小鼠骨髓间充质干细胞在生理条件下神经元分化的分子机制。仅用碱性成纤维细胞生长因子处理3至6天的小鼠骨髓间充质干细胞表现出典型的神经元形态，表现为缩小的细胞体和延长的细胞突起（图3（a））.胆碱O-乙酰转移酶（聊天）是负责乙酰胆碱的生物合成的酶，其目前是用于鉴定中央和周围神经系统中的胆碱能神经元的最具体的标记。生长相关蛋白质（间隙）43是当它们生长轴突时在神经元中诱导的多肽。神经元特异性烯醇酶（NSE）是主要在神经元中的糖酵解酶烯醇酶的二聚体同种型，其对神经元细胞相对特异。Tau蛋白是神经元中发现的蛋白质，主要在中枢神经系统中，其与小管蛋白相互作用以加强神经元轴突中的神经管。为了聚集更多关于神经元表型的证据，我们通过RT-PCR检查了这些神经元分化标志物。如图3（b）在碱性成纤维细胞生长因子治疗后，ChAT、GAP-43、NSE和Tau的mRNA水平显著上调。这些基因在蛋白质水平上也观察到类似的表达模式（图3（c）)补充资料中提供了完整的未经编辑的western blot图像1．一致的是，bFGF的处理后，如通过全细胞膜片钳技术测定分化的神经元细胞显示出特征性的电性质。如图3（d），在6天神经元分化细胞中检测到典型的全细胞电流痕量。我们还检测到其他相关标记。血清素转运蛋白（SERT）是血清奈诺替代神经元的临数血清素转运蛋白，作为中枢神经系统中的血清onOronergic神经递血的生物标志物。据认为，微管相关蛋白（MAP）2参与微管组件，这是神经发生的重要步骤。β3-微管是六个中的一个β-微管蛋白亚型，在轴突引导和成熟过程中高度表达，是一个重要的神经元标志物。采用qRT-PCR方法，采用高水平的SERT、MAP2和rt - pcr检测β检测到3-微管蛋白表达（图3（e））.我们还使用免疫荧光染色来测试这些蛋白质，结果表明，用BFGF处理的BMSCs表现出高表达神经发生相关标志物，包括GAP43，NSE，TAU，MAP2和β3-微管蛋白（图3（f））.随着我们在这些数字中表明的数据，我们发现在BFGF诱导的BMSC中发现了聊天和SERT，其显示这些细胞具有胆碱能和神经元血清素能神经元分化的潜在能力。所有这些数据都显示在BFGF处理之后，BMSCS朝向神经元方向分化。

３．３．bfgf诱导的小鼠骨髓间充质干细胞基因表达谱综述

小鼠骨髓基质干细胞的基因表达谱通过微阵列分析在试图收集参与神经元分化的基因的更完整的画面并且在确定负责转换成骨髓干细胞的神经元单元中的分子进行分析。由于我们先前已经观察到的神经元表型可以被强烈地诱导后72小时的bFGF治疗[15[分别在由BFGF处理的0,4,24和72小时后从BMSCs中提取总RNA，该BFGF被认为是表示这些分化细胞表型的神经发育，分化和成熟阶段。否则，成纤维细胞样BMSCs开始在24小时后24小时内改变其与具有神经元细胞表型的形态（图4(一))这些变化被进一步追踪，包括观察神经突起样结构的生长，甚至在72小时后与相邻的分化细胞连接，表明设计的时间点适合检测早期表达的基因。相邻细胞的交叉对话模拟了成熟神经元形成信息传递突触的行为，能够在我们分化的神经元细胞中观察到这种联系确实为这些分化的细胞最终可能成为功能性神经元提供了一线希望。在反转录成cDNA后，样本与代表约21000个基因的DNA寡核苷酸芯片杂交（安捷伦科技）。为了确保结果，进行了两个独立的神经元分化实验和微阵列分析。从不同时间点的偶数基因表达值中，鉴定出1148个基因，其表达水平在一个或多个时间点与未处理样本相比变化超过两倍。这些基因根据其表达模式进行分组，并采用分层聚类和彩色条表示法（图1）4 (b)）.

如上所述，小鼠BMSCs在BFGF治疗后24小时开始表现出神经元形态，并且我们假设所选时间点可以反映在0,4,24和72小时的BMSCs的神经元感应，分化和成熟的BFGF治疗分别。与未处理的细胞相比，每组中的几种典型基因列出不同时间点的混凝土表达比（图5.）.因此，基因表达的变化如早期上调分组（图5.， A组)，中度上调(图5.，B组），上年上调（图5.，C组），并组成上调（图5.，组d）基于这些时间点的诱导折叠。由于该基因下调也显示参与BMSC的神经元分化[12]，也列出了两个下调组，中间下调组(图5.， E组)和结构性下调(图5.，F组）基因表达。

3.4。神经元基因表达谱

从一个或多个时间点bFGF的至少5倍上调上调，约300神经相关基因的基因列表进行鉴定。这些基因可以被分类成两组，早期上调神经基因和连续上调神经基因（表1)第一组中主要有四个基因，即突触囊泡糖蛋白2a（SV2a）、趋化因子（C-C基序）受体1（CCR1）、突触体相关蛋白25（SNAP-25）和γ-氨基丁酸（GABA）SV2a受体已被证明参与囊泡运输和胞吐，这是神经传递的关键过程，在调节癫痫发生中起着关键作用[37.]CCR1介导的信号转导是招募效应免疫细胞引起神经炎症的关键，是阿尔茨海默病的早期和特异性标志物[38.］.SNAP-25是涉及形成神经可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（蛇子）的关键蛋白质之一，其负责神经递质的钙依赖性胞毒性，这是神经递质和正常的主要步骤大脑的功能[39.］.GABA受体参与中枢神经系统内的抑制突触[40］.持续上调的神经基因组主要有4个基因，包括信号量5A、p2激活激酶1、推定神经元细胞粘附分子和信号量6A。信号量5A是轴向运动神经元的双功能轴突引导线索[41.］.假定的细胞粘附膜分子Vstm5调控中枢神经系统的神经元形态和迁移[42.］.缺血神经元中的NRF2通过调节信号素6a来促进视网膜血管再生[43.］.

如上述同样地进行分析，大约在一个或多个时间点与至少2倍上调300神经相关基因也被鉴定。这些基因可以根据所涉及的功能神经可能性被分类成若干组（表2）.第一组参与神经元发育，代表性基因是成纤维细胞生长因子受体（FGFR），Nestin，Chordin和空螺旋形同源物1. Nestin是神经元干细胞的广泛使用的标记，并在神经元分化的早期表达[16那44.］.和弦，短原肠胚形成的同系物果蝇，已被证明刺激Xenopus中的神经诱导[45.］.证明FGFR在神经发生中发挥重要作用[46.]，我们还发现，BFGF诱导的BMSC的神经元分化需要FGFR-1 [15］.第二组基因是原神经转录因子[47.]，如achaet - sccute complex homologlike 1 (mash1)、多毛增强split 5 (hes5)、神经元PAS域-2和-3、神经元D4(神经源分化4)等。mash1又称achaet - sccute family bHLH转录因子1 (ASCL1)，受Notch信号通路调控[29］.mash1在控制中枢神经系统(CNS)前体和外周神经系统(PNS)外部感觉器官的生成中发挥作用[48.那49.］.该基因编码bHLH转录因子家族的一个成员。该蛋白通过与E盒结合激活转录(5 -CANNTG-3 ）.有效的DNA结合需要与其他BHLH蛋白质的二聚化。该蛋白质在神经元承诺和分化中发挥作用以及嗅觉和自主神经元的产生[50.］.有趣的是，hes5基因被证明可以抑制Mash家族的功能，并通过Notch信号促进细胞增殖[51.那52.］.NeuroD家族成员Neuronal D4在神经发育中起神经元决定作用，过表达Neurogenin1可在人间充质干细胞中诱导神经元样表型[53.那54.］.神经元PAS域蛋白被证明参与bfgf刺激的成人神经发生[55.］.综上所述，这两组基因的上调可能参与了骨髓间充质干细胞的神经发生。第三组是轴突，包括Dynein-4和-10等基因，Netrin-1参与轴突的形成。动力蛋白家族因子是轴突生长的关键发动机[56.］.Netrin是一种有效的轴突生长因子[57.]，在本研究中已观察到诱导倍数超过20倍。综上所述，这些基因组可能导致了细胞形态的改变。

涉及神经活性或功能的基因可被分成两种神经递质分子（第四组）或离子转运（第5组）或肽信令（表2）.典型的神经递质分子是Complexin-1，它是一种胞质分子，可以与SNAP受体结合，与SNAP竞争[58.］.在本研究中也上调了两种语法家族成员，语法3和4A。Syntaxin家族成员仅在神经系统中表达并涉及对接的突触囊泡[59.］.离子转运中表达最高的分子是-氨基丁酸受体- 6。该家族基因在神经元细胞去极化中起着非常重要的作用[60.］.在本研究中，BFGF上调了Semaphorin的几名成员。信号蛋白在细胞膜上表达，已经证明了调节生长玉米的引导[61.］.

也清楚地上调了一组受体基因，例如G蛋白偶联受体（第六组）（表2）.G蛋白偶联受体也证明具有非神经元功能。GRP54，例如，参与繁殖发育[62.]和GRP65在信号级联[63.]此外，阿片受体以介导吗啡作用而闻名[64.］.

3.5。mash-1促进BMSCs神经元分化

神经元分化涉及复杂的基因调控，其中与信号转导和基因转录相关的分子起着至关重要的作用。鉴于我们对bFGF诱导的神经元基因和神经元分化过程的研究结果，我们提出了以下完整的基因调控网络神经元分化模型。在确定在骨髓间充质干细胞转化为神经元细胞中起主要作用的基因库时，我们决定重点研究前两类基因，它们参与神经发生，也与基因转录有关。在原神经基因中，哺乳动物achate-schute homolog 1 (mash1)，一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，进一步被证明显著上调。Mash-1在处理4小时时上调4倍以上，72小时时又上调8倍2）.

对mash1进行RT-PCR分析，在mRNA水平上评估我们的微阵列结果的可信度。这一步是为了确保在处理样品时从cDNA微阵列获得的结果不是由于人为因素或未经调节的信号放大。如图6（a）(左图)，在bFGF作用下，mash1的转录水平升高。Western blot结果显示，mash1蛋白水平在24 h后显著升高(图)6（a），右侧小组）。全部未编辑的免疫印迹图像以补充数据提供2．在BFGF处理后，还检测到神经元相关基因的表达，包括GAP43和HES5，其也上调，但在mRNA水平下的MAH-1之后（图6（a）)，提示mash1可能在骨髓间充质干细胞的神经元分化中起启动作用。我们还使用免疫荧光染色检测Mash1。结果显示，经bFGF处理72 h后，骨髓间充质干细胞表现出Mash1的高表达，神经发生相关标志物，包括GAP43和Hes5，也在这些细胞上表达(图)6（b））.为了确定醪-1在骨髓基质干细胞的proneuronal作用，我们克隆和转染醪-1到小鼠骨髓基质干细胞。转染后，醪-1过度表达的骨髓基质细胞表现出神经元样的形态，这是由细长的神经突和细胞体收缩率所证明（图6（c））.生化分析显示神经标记NSE在过表达mash1的骨髓间充质干细胞中表达更高(图)6（d）)NSE在中枢神经系统神经元中具有广谱的神经营养和神经保护特性。我们还检测到突触相关基因的表达，包括SV2a和SNAP-25（图6（e）中）.SV2a是一种重要的囊泡膜蛋白，几乎在所有的突触中都有表达，可以作为突触密度的合适靶点。SNAP-25是n -乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白受体之一，参与突触囊泡对接以及随后与靶膜的融合。数据显示，SV2a和SNAP-25在过表达mash1的骨髓间充质干细胞中被高度诱导，表明这些细胞具有潜在的突触能力。综上所述，结合我们早期的观察，mash1可能是bFGF治疗的关键神经元分化因子。

4。讨论

骨髓干细胞被证明都表现神经表型体内和体外在有利的条件下。BMSC产生的细胞的神经特性在大多数情况下，通过测量少数神经标记物的表达来确定，这在我们看来，这不会完全反映神经特征的表型[11把神经元的分化机制留给我们自己去想象。为了获得骨髓间充质干细胞神经元分化过程中基因表达变化的整体模式，我们采用cDNA芯片分析技术研究了神经元分化小鼠骨髓间充质干细胞基因谱的动态变化。我们的研究显示，具有各种神经功能和特性的神经基因有强烈的上调倾向。有趣的是，我们进一步证明Notch信号分子mash1在骨髓间充质干细胞采用神经元表型中发挥重要作用。提示骨髓间充质干细胞的神经元分化可能模仿或执行某些保守的神经元分化途径。

微阵列分析已被用于确定bFGF分化的骨髓间充质干细胞的神经特性。Mori等人报道了第一个使用永生的人类骨髓间充质干细胞的神经基因谱[13]山口池采用，进一步确定神经基因表达[14］.然而，它们两者使用从细胞中提取的RNA分化为它们的模板，甚至使用包括DMSO和β-巯基乙醇的一系列化学物质，以区分BMSCs，这被严格认为是压力 -诱导的反应[10那65.］.此外，在他们的研究中，他们只涵盖了一小部分基因，其中大多数识别的神经基因是在成熟/分化细胞中表达的神经标记或分子。在我们的研究中，我们使用bFGF单独诱导小鼠骨髓间充质干细胞在2-3天左右的神经元分化，分化后的细胞获得电生理特性[15]大范围神经基因的明显上调表明神经元分化的骨髓基质细胞在生理条件下可以采用多种神经表型，而不仅仅是神经标记物的表达[11］.

BMSC的神经元分化，特别是用各种化学品诱导的BMSC分化被攻击为直接应激诱导的反应[65.]，多数研究证实，神经元分化的骨髓间充质干细胞胞突样突起是由细胞质收缩形成的，而不是神经突的生长[10］.然而，在我们的研究中，许多轴突生长相关基因如Netrin-1和dynine从bFGF处理4小时开始明显上调。这些基因的高水平表达清楚地表明，所观察到的神经突样细胞突起是一种活跃的突起，而不是如所争论的简单的细胞收缩现象。此外，离子转运、神经递质、GABA受体、complexin、阿片受体等肽信号通路等大量基因也上调。与我们之前的发现一致，bfgf处理的骨髓间充质干细胞的神经元细胞表现出电生理特性[15]，完成了神经基因的各种表达，显然，这种指出的BMSC可以在生理刺激下获得更完整的神经元性状。

人类神经系统发育的研究果蝇表明Notch受体发起的信号通路发挥神经细胞后代至关重要的作用，它的基因的几组，其中包括家族的bHLH，被诱导调节神经决心和分化[66.］.在果蝇中，已经证明了BFGF信号传导途径与各种细胞类型中的凹口信号通路相互作用[67.］.所有的Notch通路基因都保存在脊椎动物中，并在神经系统和其他器官中表达[26］.通过生理因子将BMSCs对神经元细胞的启动和分化显然参与了在开发中有很好的文献中的神经发生途径。果蝇和神经干细胞分化。虽然可以绘制与果蝇模型的紧密比较，但仍应解决与在果蝇中观察到的BMSC神经元分化的区分。

在骨髓间充质干细胞中，Notch细胞内结构域(NICD)最近被证明能够诱导骨髓间充质干细胞神经元分化。该功能进一步被证明与bFGF协调[9.］.有趣的是，BFGF显示出促进胚胎神经头脑前体细胞中凹口途径的活性，以抑制分化[67.］.陷波信号传导途径的组分可以受到BFGF的影响，以影响少突胶质细胞分化[68.］.但Notch与bFGF信号通路之间的交互机制还有待进一步研究。采用微阵列筛选，我们观察到惊人的mash1上调，这是bHLH转录因子的脊椎动物同源物，也被称为achaet -鳞片复合体同源物-1，显示控制中枢神经系统和外周神经系统外部感觉器官祖细胞的生成[69.那70］.以前的研究已经描绘了转录因子mash-1，Prox-1在显影中枢神经系统中的神经干细胞分化期间在早期步骤中发挥作用[48.］.mash1在陷波信号传导和神经元的分化中具有重要作用[71.］.当我们过表达mash1时，BMSCs表现出与bFGF分化后相似的神经元结构(图)6.）.这些结果表明，醪-1很可能是通过bFGF的负责驱动BMSC分化为神经细胞调控基因的关键因素。同样作为我们的研究中，王等人。表明，分化的条件下，MASH1过表达的骨髓基质细胞表现出与对照相比神经元标记的表达增加和神经元形态的更大程度（非MASH1过度表达细胞）72.］.Xu等也指出过表达mash1基因促进小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化[49.］.此外，研究表明mash1依赖的Notch信号通路也调节BMSCs的gaba能神经元样分化[50.那73.］.

在如此丰富的研究和综述中，各种神经元细胞的生物标记物在特性上得到了应用。因此，有必要将多个标记应用于分析细胞类型。在这项工作中，我们使用这些标记物来鉴定bfgf诱导的骨髓间充质干细胞的神经元分化。收集分析数据，我们发现许多在bfgf诱导的神经发生发展中建立的标记物。虽然更多的神经标记可能会更好地反映神经特征，但其他人认为，科学试图用更少的标记合成对生物过程的识别，这也是事实。然而，使用单一的标记物来单独鉴定单个细胞类型是很困难的。这项工作达到了两个目的，Mash-1基因在识别神经元来源方面是非常有用的基因，这为干细胞和再生医学的研究提供了一个概念性的视野。

总之，我们的工作揭示了串扰是通过在BFGF激活mash-1的细节机制的情况下激活下游凹口组分。应进一步分析对由BFGF诱导的BMSCs对BMSCs的敏感，测定和分化水平的担忧，应进一步分析。进一步指出，在该研究中，BFGF诱导的BMSC的神经元分化打开了研究涉及BMSC神经发生的生理状况的神经元分化和成熟过程中涉及的潜在机制的机会窗口。BMSC的遗传工程将是获得诸如神经元供体细胞的有用途径以治疗神经系统障碍。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者宣称不存在相互竞争的利益。

致谢

这项工作是由中国国家自然科学基金（批准号：81671226，81500675号和82070895号）的资助。

补充材料

完整无限的网络污染图像的数字3（c）和6（a）数据在补充材料被提供。（补充材料）

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