骨髓基质细胞(bmsc)的瑞士8-week-old雄性老鼠最初种植在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM;英杰公司)补充10%胎牛血清(的边后卫;表达载体),10%的新生牛血清(NCF;表达载体),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(表达载体)。这些细胞被孵化有限公司37°C的5%₂在100毫米的组织文化菜2 - 3天,和不依从细胞被介质替换删除。贴壁细胞进一步培养7 - 10天达到90%融合和定义为第一段。与0.25%胰蛋白酶/ 0.5毫米EDTA分离后,大约25%的细胞转移到新的培养瓶。达到了一个相当均匀的细胞群4 - 5通道后,这些细胞可以不断培养50通道没有明显的生长迟缓。

样本包含 1 × 10 6 细胞被resuspended在300年 μl的流式细胞仪缓冲区( 美国公共电视台 + 2 % 的边后卫 在4°C)和孵化20分钟和3 μl(异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE), allophycocyanin——(APC),和peridinin叶绿素蛋白质——(Per-CP)共轭抗体,分别对表面标记CD34、CD44、CD45、CD90.1, CD117、CD105,本来。所有抗体都从Pharmingen (BD Pharmingen)。添加6毫升流式细胞仪缓冲区后,细胞颗粒状,5分钟离心260×g在4°C。标记细胞在500年resuspended μl缓冲和流式细胞仪分析了BD流式细胞仪咏叹调流式细胞分析仪。

平的bmsc被镀到6-well组织培养板的密度 5 × 10 4 细胞每口井和孵化24小时之前治疗脂肪形成的分化培养基(500 nM地塞米松,250 μM isobutyl-methylxanthine (IBMX), 100年 μM indomethacine, 5 μ胰岛素在基底DMEM补充10%的边后卫,10% FCS, 1% penicillin-streptomycin)。媒体改变了每3天,去评估了苏丹黑染色10天postinitial脂肪形成的归纳。

细胞被冲洗与PBS和固定贝克的解决方案10分钟,其次是3分钟100%丙二醇。然后细胞与苏丹黑染色2小时3用水洗紧随其后。其次是另一个2分钟的接触丙二醇85%,最后3用水洗。积极的苏丹黑染色细胞出现蓝色黑色在光学显微镜下。

Chondrogenic分化诱导使用高密度micromass文化技术( 32]。一个10 μl的集中细胞悬液( 1 × 10 6 细胞/毫升)放置到油井的中心(24-wells细胞培养板),并允许附加和总2小时37°C公司为5%₂。Chondrogenic感应介质(50纳米抗坏血acid-2-phosphate, 6.25 μg / ml胰岛素,和10 ng / ml转化生长因子 β1在基底DMEM penicillin-streptomycin补充的边后卫为1%和1%)轻轻覆盖,避免中断连接细胞。媒体随后改变了每3天,chondrogenic表型是由阿尔新蓝染色3周postinitial chondrogenic归纳。

Micromass文化与PBS和固定在2%多聚甲醛冲洗15分钟。他们然后用3%醋酸冲洗5分钟降低pH值2.6染色以1%紧随其后20分钟阿尔新蓝(pH值2.6)。细胞然后用水洗了两次在光学显微镜下观察。高硫酸软骨蛋白聚糖的矩阵积极彩色蓝色。

1 × 10 4 细胞被镀上24-wells板和培养成骨分化培养基(50 μM抗坏血acid-2-phosphate, 10毫米 β甘油磷酸盐,100 nM地塞米松在DMEM基础培养基补充penicillin-streptomycin的边后卫为10%和1%)24小时后孵化。媒体改变了每3天。成骨分化进行茜素红S染色3周postinitial成骨的归纳。

细胞与PBS和固定在冰冷的70%乙醇冲洗两次一小时在-20°C。几与去离子水漂洗后,细胞被孵化40毫米茜素红S (pH值4.1)20分钟在室温下与温和的颤抖。进一步4与去离子水进行清洗,清除非特定的染色的细胞。分泌钙化的细胞外基质被证实为红色污渍用茜素红S染色。

神经元分化,BMSC细胞被孤立和分裂每隔一天。神经源性分化诱导了暴露于10 ng / ml基本成纤维细胞生长因子。神经元分化培养基(低葡萄糖DMEM补充10%的的边后卫和10 ng / mL bFGF)从通道添加了5。神经元的分化是由微观观察监控,神经元标记的表达进行了分析通过rt - pcr,免疫印迹和免疫组织化学。

bmsc收获在4、24和72小时post-bFGF治疗,和总rna提取使用试剂盒试剂制造商的指示后(表达载体)。互补脱氧核糖核酸合成并受安捷伦的鼠标发展低聚糖微阵列(安捷伦科技)。微阵列实验重复两次使用RNA样本独立实验,结果报告是基于这两个独立实验的平均值。互补dna显示至少2倍差异选择进行进一步分析。互补脱氧核糖核酸微阵列实验蒙蔽调查员,微阵列数据分析也评估了三个独立调查人员对样品也不清楚。

聊天的表情,GAP43、Hes5 Mash1,了无,τ,泽特,MAP2, β3-tubulin是由逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)。细胞总RNA分离利用试剂盒试剂(表达载体)和反向转录表达载体合成第一链cDNA上标三世RT工具包。使用以下引物进行PCR扩增(在括号中按照以下顺序:感觉和反义),聊天(5 ′ -TGTGAGGAGGTGCTGGACTTA-3 ′ ,5 ′ -GCCAGGCGGTTGTTTAGATA-3 ′ ),GAP43 (5 ′ -GCTAGCTTCCGTGGACACATA-3 ′ ,5 ′ -AGGCACATCGGCTTGTTTA-3 ′ ),Hes5 (5 ′ -ATGCTCAGTCCCAAGGAGAA-3 ′ ,5 ′ -CGCTGGAAGTGGTAAAGCAG-3 ′ ),Mash1 (5 ′ -GCTCTGGCAAGATGGAGAGT-3 ′ ,5 ′ -CCAGGTTGACCAACTTGACC-3 ′ ),τ(5 ′ -CCCTGGAGGAGGGAATAAGA-3 ′ ,5 ′ -GCAGACACTTCATCGGCTAGT-3 ′ ),分析了无(5 ′ -TGATCTTGTCGTCGGACTGTGT-3 ′ ,5 ′ -CTTCGCCAGACGTTCAGATCT-3 ′ )。引物序列都是通过建立基因库序列。重复使用pcr被放大 β肌动蛋白(5 ′ -TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ′ ,5 ′ -TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3 ′ ,392个基点)作为评估PCR的控制效率和随后的琼脂糖凝胶电泳分析。

总RNA提取使用试剂盒试剂按照制造商的指示。治疗后RNase-free DNase我(表达载体)删除基因组DNA污染,RNA (1 μg)使用Moloney反向转录成cDNA小鼠白血病病毒逆转录酶(美国麦迪逊Promega)。实时PCR进行使用电力SYBR绿色PCR反应混合液(美国应用生物系统公司,培育城市,CA) 7500年ABI棱镜实时周期计(应用生物系统公司)。目标基因的mRNA水平是标准化的 β肌动蛋白。融化曲线建立了用解离曲线软件以确保只有一个产品被放大。根据Livak和Schmittgen的方法,相对表达的强度是基于2− ΔΔCT方程。引物的序列PCR列出如下:泽特(5 ′ -TGCCTTTTATATCGCCTCCTAC-3 ′ ,5 ′ -CAGTTGCCAGTGTTCCAAGA-3 ′ ),MAP2 (5 ′ -TCAGGAGACAGGGAGGAGAA-3 ′ ,5 ′ -GTGTGGAGGTGCCACTTTTT-3 ′ ), β3-tubulin (5 ′ -CATGGACAGTGTTCGGTCTG-3 ′ ,5 ′ -CGCACGACATCTAGGACTGA-3 ′ ),SV2a (5 ′ -GGTTCACGACACCAACATGC-3 ′ ,5 ′ -ACTTTGGTTCGGGCTGCATA-3 ′ )和SNAP-25 (5 ′ -CGCAATGAGCTGGAGGAGAT-3 ′ ,5 ′ -TCCCTTCCTCAATGCGTTCC)。

细胞细胞溶解与裂解缓冲(50 mM Tris-Base 100毫米氯化钠5毫米EDTA, EGTA 1毫米,5毫米MgCl₂、10%甘油、1% Triton x - 100和罗氏的完整的蛋白酶抑制剂的平板电脑),在14000×g离心20分钟在4°C。50 μg蛋白的上层清液由8% - -12% sds - page凝胶分离,转移到PVDF膜。与多克隆抗体进行免疫印迹,聊天,GAP43, Hes5, Mash1,了无,τ, β分别肌动蛋白。孵化后peroxidase-conjugated二级anti-immunoglobulin抗体,膜是用皮尔斯西部开发的Pico化学发光方法。

目前全细胞记录,细胞修补如前所述(37)。浴的解决方案包含150 (mM)氯化钠,氯化钾,MgCl₂1,CaCl₂2.2,玫瑰,用氢氧化钠和pH值7.3,渗透性被调整至310 mOSM葡萄糖。吸管的解决方案包含(毫米)天冬氨酸盐钾120年MgCl₂5、EGTA 0.5,消息灵通的10,ATP 2, 0.3三磷酸鸟苷,用KOH和pH值7.3,调整到295 mOSM渗透性。下获得了全细胞电流电压钳Axopatch 200 b放大器(轴突工具);软件使用pClamp 8.1(轴突仪器)。当前在10千赫采样和过滤1 kHz。泄漏是减去在线使用P / 4协议。是1 - 2米使用的吸管 Ω通常,串联电阻< 5米 Ω和75%的补偿。控股可能被设定为-70 mV和去极化的不同电压唤起通道开放。

鼠标的编码区Mash-1被克隆到pREP10向量使用方便限制网站。PCR产物Mash1消化了 Kpn我和 Xho我,纯化和结扎消化pREP10表达载体。bHLH域Mash-1然后融合到V5抗原决定基。所有结构由PCR被测序验证之前使用,证实了和蛋白质表达蛋白免疫印迹Mash-1抗体和抗原决定基标记V5。

5 × 10 5 细胞被播种100毫米组织培养菜肴和允许转染前一夜之间成长。30 μ60克的质粒DNA混合 μl 2000年Lipofectamine试剂来初始化复杂的形成。转染是直接通过增加细胞的混合物。细胞被提取并化验posttransfection 3天。

免疫荧光染色,细胞被播种Lab-Tek室幻灯片和固定在-20°C precold甲醇为3分钟。然后,细胞permeabilized tritonx 0.2% - 100在PBS 15分钟和屏蔽10%正常山羊血清在PBS在室温下30分钟。主要抗体的细胞培养在37°C 1 h,与PBS洗两次,然后是孵化与适当的荧光素isothiocyanate-conjugated二级抗体为30分钟。最后,这些细胞被安装一个antifluorescence淬火密封液体荧光显微镜下观察。

所有数据了 的意思是 ± 标准 错误 的 的 的意思是 (SEM)。学生 t 个人之间以及用于确定意义的比较。单向方差分析测试与Bonferroni调整用于多重比较。计算使用SPSS 11.0统计软件进行。 P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

鼠标bmsc与股骨骨的老鼠,在DMEM培养补充10%的边后卫,penicillin-streptomycin FCS的10%,和1%。纤维母细胞群最终获得了4 - 5个段落之后,这个细胞群可以长连续50多通道实验条件下而不失去其可塑性和健康。细胞生长速率较低在早期文章由于来自其他细胞类型的竞争,和一个稳定阶段的同质细胞群后达到4 - 5个段落。细胞形态学通道6 - 50的跟踪显示一致的表型和同质性(图水平 1(一))。据报道,长期的细胞特性和可塑性可能不同 在体外文化( 33]。因此,我们研究了几个细胞表面标记bmsc在不同的段落。流式细胞术结果显示这些细胞表现出高水平的本来就( 34),一个干细胞标记和CD44 ( 35),跨通道6间叶细胞标记,25、50(图 1 (b))。怀疑,所有造血细胞标记、CD90.1, CD34、CD45和CD117察觉或不善表达bmsc通道(图 1 (b))。我们还发现了其他CD105标记bmsc的识别在不同的通道,这是积极的怀疑(图 1 (c))。这些数据表明,这种高度均匀的细胞群在表示段落表现出间充质干细胞标记和无明显造血细胞污染。

确定bmsc的multilineage分化能力,细胞受到一系列分化向间叶细胞的起源,即脂肪细胞,软骨细胞和成骨细胞。如图 2,细胞在6 - 25通道可以分化成脂肪细胞和软骨细胞由生化测试,而细胞通道50可以分化成所有三种细胞类型。这些结果与之前的观察一致,bmsc与脂肪细胞分化的能力有很高的集落形成能力( 36),可能更长的寿命和可塑性。虽然默认的bmsc的承诺是进行成骨分化,这种现象只是观察到bmsc的早期发展阶段。

bFGF鼠标BMSC神经元分化的模型( 15)建立了神经分化的分子机制的阐明鼠标bmsc在生理条件下。鼠标bmsc对待bFGF仅为3至6天表现出典型的神经元形态就是明证细胞体和细长的细胞萎缩过程(图 3(一个))。胆碱O-Acetyltransferase(聊天)是酶的生物合成乙酰胆碱,而目前最具体的标志识别胆碱能神经元在中枢和周围神经系统。生长相关蛋白43 (GAP)是一种多肽诱导的神经元轴突生长。特异性神经元烯醇酶(研究)是一种二聚的同种型糖酵解酶烯醇酶的主要发现在神经元,这是相对特定的神经细胞。τ蛋白是一种蛋白质中发现神经元,主要在中枢神经系统,这与微管蛋白相互作用加强神经元的轴突的神经导管。为了收集更多的证据神经细胞表型,我们通过rt - pcr检查这些神经元分化标记。如图 3 (b)聊天信使rna水平、GAP-43了无,τ显著调节bFGF治疗。相似的蛋白质水平的表达模式也观察到这些基因(图 3 (c))。完全未经审查的免疫印迹图像中提供补充数据 1。一贯bFGF治疗后,分化的神经细胞表现出电生理特征属性由全细胞膜片箝技术。如图 3 (d),典型的全细胞电流跟踪中检测出日神经元分化细胞。我们还发现其他相关标记。羟色胺转运体(泽特)是一个关键的5 -羟色胺转运体在血清素激活的神经元的功能,作为一种生物标志物的血清素激活的神经传递的中枢神经系统。Microtubule-associated蛋白质(地图)2被认为是参与微管装配,这是一种神经发生必不可少的一步。 β3-Tubulin是六之一 β微管蛋白亚型,高表达在轴突引导和成熟,是一个伟大的神经元标记。确定这些标记,存在法,和一个高水平的泽特,MAP2, β3-tubulin表达式被发现(图 3 (e))。我们还利用免疫荧光染色测试这些蛋白质,和结果表明,bmsc bFGF处理表现出高的表达neurogenesis-related标记,包括GAP43了无,τ,MAP2, β3-tubulin(图 3 (f))。作为我们的数据显示这些数据,我们发现在bFGF-induced聊天和泽特都是诱导bmsc,显示这些细胞有一个潜在的能力对胆碱能神经元和血清素激活的神经元分化。所有这些数据表明bFGF治疗后,bmsc区分向神经元方向。

鼠标bmsc的基因表达谱进行了分析通过微阵列分析试图收集更多完整的基因参与神经元分化和确定分子负责bmsc转化为神经细胞。因为我们以前观察到神经元表型可以强烈诱导72小时post-bFGF治疗( 15],总rna提取后从bmsc 0, 4, 24日由bFGF和72小时的治疗,分别代表的是神经开始,这些分化细胞表型分化和成熟阶段。否则,呈bmsc开始改变它的形态类似于神经细胞表型在24小时后处理(图 4(一)),这些变化是跟踪进一步包括neurite-like结构的观察结果,甚至在一定程度上加入并结合邻分化细胞在72小时,这表明时间点设计适合检测早期表达基因。相邻细胞肺癌模仿的动作成熟神经元形成突触信息传递和已经能够观察到这样一个连接在我们的神经细胞分化为证据提供的希望这些可能最终成为功能性神经元分化细胞。反转录后cDNA、样本与DNA寡核苷酸芯片杂交代表约21000个基因(安捷伦科技)。为了确保结果,两个独立的神经分化实验和微阵列分析进行。甚至从基因表达值在不同的时间点,确定了1148个基因的表达水平超过双重改变一个或多个时间点与未经处理的样品相比。这些基因与层次聚类分组根据他们的表达模式和彩色栏表示(图所示 4 (b))。

如上所述,鼠标bmsc开始表现出神经形态学post-bFGF 24小时治疗,我们认为选择的时间点可以反映了神经感应,分化和成熟的bmsc 0, 4日,24日,分别和72小时的bFGF治疗。列出几种典型基因在每组的具体表达率在不同时间点相比,未经处理的细胞(图 5)。因此,基因表达的改变被分组为早期调节(图 5A组),中间调节(图 5调节(图B组),迟了 5C组)和既定调节(图 5D组)折叠的基础上归纳在这些时间点。自也显示差别基因对这些参与bmsc的神经元分化 12),两个表达下调组也上市,中间表达下调(图 5E组)和既定表达下调(图 5F组)基因的表达。

从列表中基因的调节通过bFGF,大约300 neural-related基因至少5倍upregulation被确定在一个或多个时间点。这些基因可以分为两组,早期基因和连续调节神经调节神经基因(表 1)。主要有四种基因在第一组,突触囊泡2糖蛋白(SV2a)趋化因子(碳碳主题)受体1 (CCR1) synaptosomal-associated蛋白质25 (SNAP-25)和γ-氨基丁酸(GABA)受体。SV2a已经证明参与贩卖泡胞外分泌,对神经传递过程至关重要,起着至关重要的作用在调节epileptogenesis [ 37]。CCR1-mediated信号转导是至关重要的招聘效应免疫细胞并导致神经炎症早期阿尔茨海默氏症和特殊的标记( 38]。SNAP-25是一个关键的蛋白质参与神经的形成可溶性N-ethylmaleimide-sensitive因素附件蛋白受体(陷阱),它负责calcium-dependent胞外分泌的神经递质,神经传递的主要步骤和大脑的正常功能( 39]。GABA受体在中枢神经系统参与抑制性突触( 40]。主要有四种基因在连续调节神经基因群,包括5 semaphorin P2-activated激酶1,假定的神经细胞粘附分子,作用6。Semaphorin 5是一个双功能为轴向运动神经元轴突引导提示( 41]。假定的细胞粘附分子膜Vstm5调节神经元形态和迁移在中枢神经系统( 42]。Nrf2缺血性神经元通过监管促进视网膜血管再生的semaphorin 6 ( 43]。

同样如上分析,约300 neural-related基因至少2倍upregulation一个或多个时间点也确定了。这些基因可以分为几组根据相关神经功能(表的可能性 2)。第一组参与神经发展,代表基因是纤维母细胞生长因子受体(FGFR)、巢蛋白,Chordin,空空的呼吸孔同族体1。神经干细胞巢蛋白是一种广泛使用的标志,表示在神经元分化的早期阶段( 16, 44]。Chordin short-gastrulation的相同器官 果蝇,已经被证明可以刺激神经感应在非洲爪蟾蜍 45]。FGFR证明神经发生中发挥重要作用[ 46),我们还发现,FGFR-1 bmsc诱导的神经元分化需要bFGF [ 15]。转录因子基因在第二组颈板( 47],比如achaete-scute复杂homolog-like 1 (Mash-1),毛,提高分割5 (Hes-5),神经元不是domain-2和3,和神经D4(神经源性分化4)。Mash-1,也称为achaete-scute家庭bHLH转录因子1 (ASCL1),是由Notch信号( 29日]。Mash-1功能在控制代祖细胞在中枢神经系统(CNS)和外部周围神经系统的感觉器官(pn) [ 48, 49]。这个基因编码bHLH的转录因子家族的成员。蛋白质转录激活绑定到E箱(5 ′ -CANNTG-3 ′ )。二聚作用与其他bHLH需要有效的DNA结合蛋白质。这种蛋白质在神经承诺和分化中发挥作用和嗅觉神经元和自主的一代 50]。有趣的是,Hes-5基因显示抑制饲料家庭的功能,促进细胞增殖通过Notch信号( 51, 52]。神经元D4, NeuroD家族中的一员,在神经发育中起着神经测定的影响,过度Neurogenin1可以诱导neuronal-like表型在人类间充质干细胞( 53, 54]。神经元不是域蛋白质显示参与bFGF-stimulated成年神经发生( 55]。总之,这两个组织的基因upregulation表明他们可能参与bmsc的神经发生。第三组代表轴突,包括基因如Dynein-4和-10年,Netrin-1轴突创世纪。动力蛋白家族因素的关键汽车轴突的生长( 56]。Netrin是一个强有力的轴突生长因子( 57)和被观察诱导20多个折叠在这项研究。总体而言,这些群体的基因可能导致细胞形态变化报告。

基因涉及神经活动或功能可以分为神经递质分子(第四组)或离子运输(第五集团)或信号肽(表 2)。典型的神经递质分子Complexin-1,胞质分子,可以绑定到拍照与受体( 58]。两个突触融合蛋白家族成员,突触融合蛋白3和4,也调节在这项研究。突触融合蛋白家族成员表达只在神经系统和涉及对接的突触囊泡( 59]。最高的表达分子离子运输氨基丁酸受体α6。这个家族基因在神经细胞去极化发挥非常重要的作用[ 60]。的几名成员semaphorin调节bFGF在这项研究。Semaphorin是细胞膜上表达,并通过调节增长指导玉米( 61年]。

一组也明显调节受体基因,如G-protein-coupled受体(第六组)(表 2)。G-protein-coupled受体也证明nonneuronal功能。例如,GRP54参与生殖发展( 62年)和GRP65信号级联( 63年]。此外,阿片受体是众所周知的调节吗啡作用[ 64年]。

神经元分化涉及复杂的基因调控,相关的分子信号转导和基因转录起到至关重要的作用。我们因此建议以下神经元分化与基因调控网络模型完成后考虑我们的发现在神经元基因诱导bFGF和神经分化过程。在决定中起着重要作用的基因池bmsc转变成神经细胞,我们决定专注于从第一个两类基因,参与神经发生和也与基因转录。在颈板基因,哺乳动物achate-schute同族体1 (Mash-1),一个基本的helix-loop-helix转录因子,进一步证明显著的调节。Mash-1脱颖而出,因为它是调节超过4折叠在4小时到达另一个8折72小时后处理,分别(表 2)。

rt - pcr分析Mash-1进行评估我们的芯片结果的可信度在mRNA水平。这一步是确保芯片的结果不是由于工件或不受监管的信号放大处理样品。如图 6(一)(左面板)的转录水平Mash-1增加对bFGF的回应。Mash-1明显新兴的蛋白质含量,增加了24小时后,观察,证明了免疫印迹(图 6(一)右面板)。完全未经审查的免疫印迹图像中提供补充数据 2。neuronal-related基因的表达,包括GAP43 Hes5,也检测bFGF治疗后,也是调节,但后来比Mash-1 mRNA水平(图 6(一)),表明Mash-1可能发挥主动作用在推动bmsc的神经元分化。我们还利用免疫荧光染色测试Mash1。结果表明,综合处理bFGF 72 h后表现出的高表达Mash1, neurogenesis-related标记,包括GAP43和Hes5,也表达了对这些细胞(图 6 (b))。确定proneuronal bmsc Mash-1效果,我们克隆转染Mash-1 bmsc成老鼠。转染后,Mash-1-overexpressing bmsc展出neuron-like形态、由细长的证明和神经突胞体铸件(图 6 (c))。生化分析显示更高的神经元标记表达式,分析了无,Mash-1-overexpressing bmsc(图 6 (d))。了无神经营养和神经保护属性在中枢神经系统神经元广泛。我们还发现synaptic-associated基因的表达,包括SV2a和SNAP-25(图 6 (e))。SV2a是一个重要的囊膜蛋白表达在几乎所有的突触和突触密度可以作为一个合适的目标。SNAP-25是N-ethylmaleimide-sensitive融合蛋白受体之一,参与突触泡对接和后续的融合与目标膜。数据显示SV2a和SNAP-25高度诱导Mash-1-overexpressing bmsc,显示一个潜在的在这些细胞突触功能。所有这些结果结合我们的观察表明,Mash-1早些时候可能是一个至关重要的proneuronal分化因子在bFGF治疗。