他们^6.甲基化调控的AFF4促进膀胱癌干细胞的自我更新

摘要

动态N^6.-methyladenosine (m^6.a）mRNA的修饰在调节基因表达和确定细胞命运方面发挥作用。但是，m的功能^6.尚未描述膀胱癌干细胞（BCSCs）中的mRNA改性。在这里，我们显示全球RNA M^6.丰富和米的表达^6.a -形成酶metttl3在膀胱癌(BCa)细胞中高于非cscs。耗尽Mettl3.抑制BCSCs的自我更新，其表现为ALDH活性和成球能力下降。机械上，metttl3调节m^6.一个修饰并由此表达的AF4/FMR2家族成员4 (AFF4)，敲低其中的表型复制Mettl3.消融和减少BCSCs的肿瘤启动能力在活的有机体内。AFF4与启动子区域结合并维持转录SOX2.和我的C它们在BCSCs中具有重要的生物学功能。总的来说，我们的结果证明了m的关键作用^6.通过METTL3-AFF4-SOX2/MYC新信号轴修饰BCSCs的自我更新和致瘤性。

1.介绍

肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs，又称肿瘤启动细胞)是一种相对少见的癌细胞群体，具有自我更新能力、致瘤能力和多能性等特点，是肿瘤发生和转移的驱动力。这些干细胞特性使CSCs对传统化疗产生耐药性，并导致后续复发，导致临床治疗失败[1］．目前迫切需要针对CSCs的有效治疗和策略，而我们对CSCs的了解尚不完全。

膀胱癌（BCA）是最常见的恶性肿瘤之一，其特征在于快速进展和复发风险高2那3.］．为了更好地理解并最终消除膀胱癌干细胞（BCSCs），我们和其他基团已成功鉴定出几种不同的BCSCs并确定其在BCA进展中的作用在活的有机体内[4.-7.］．此外，我们发现低剂量的地西他滨(一种DNA甲基转移酶抑制剂)可以降低BCSCs的干性，而不会造成严重的细胞毒性[8.，提示表观遗传调控在BCSCs中发挥重要作用。

除了DNA甲基化之外，最近我们还发现了异常的n^6.-methyladenosine (m^6.A)甲基化也与BCa进展有关[9.-11.］．RNA M.^6.A是在大约25%的真核信使rna中观察到的最普遍的化学标记[12.-14.］．在哺乳动物细胞中，这种动态修饰是由一个甲基转移酶复合物催化的，该复合物由几个“作者”组成，包括甲基转移酶样3 (METTL3)、METTL14、Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)、VIRMA (KIAA1429)和RBM15 [15.-19.]，并被两个“橡皮擦”除去：脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO）[20.]和烷基化修复同源蛋白5 (ALKBH5) [21］．异常硕士^6.修改在不同类型癌症的进展中起着至关重要的作用[22]，特别是作为乳腺癌CSC的调节剂[23),胶质母细胞瘤(24那25]和白血病[26那27］．然而，其调控CSCs的功能和机制似乎与环境相关，目前尚未在BCSCs中进行描述。

在我们之前的研究中，我们发现m^6.丰富的两种我的C和AFF4通过BCA细胞中的异常表达MetT13调节mRNA [11.］．作为超伸长率复合物（秒）的核心组分，AFF4参与了编码多能因因素的许多基因的转录伸长的调节[28那29］．例如，AFF4可以上调SOX2.转录促进头部鳞状细胞癌（HNSCC）的肿瘤起始能力[30.]， 和我的C是另一种已知的AFF4目标[11.那31］．受这些结果的启发，我们假设m^6.A通过调节AFF表达来发挥促进BCA细胞茎的作用。

在这里，我们提供了明确的证据，即MetT13和RNA M的表达^6.CSC在相对于BCA的非CSCs中的水平显着较高;MetT13通过调节mRNA m来促进BCSCs的自我更新能力^6.水平，因此表达AFF4，这反过来与启动子区域结合SOX2.和我的C激活他们的转录。我们的研究结果揭示了RNA m的作用和机制^6.一种调节BCSCs的茎干，并将在临床治疗中激发有关其应用的未来研究。

2。材料和方法

２.１.细胞培养，流式细胞术和球形成试验

BCa细胞株5637 (ATCC NO。HTB-9)和UM-UC-3 (ATCC NO. 9)CRL-1749)购自中国细胞资源中心(上海，中国)研究院，并如前所述进行维护[32］．常规测试细胞系的支原体，不超过20个通道。根据制造商的说明，通过Lipofectamine TM rnaimax转染试剂（13778-075）将特异性siRNA转染到细胞中。

对于流式细胞术分析，根据制造商的说明，使用Aldefluor测定试剂盒（Stemcell Technologies）染色BCA细胞。然后使用Beckman Moflo XDP（Beckton Dickson，Ca）进行采集和分类。使用未染色和同种型对照建立荧光分馏的栅极。

对于球形形成测定，在24孔超级附着板（Corning Inc.，Corning，NY，USA）中培养FACS分选细胞，密度为每孔1,000个细胞。将细胞培养在补充生长因子EGF的无血清DMEM / F12中，β-FGF和IGF-1浓度为20 ng/ml (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)。直径超过20的球体μ电镀后7天计数。

2.2。检测基因表达

采用Trizol试剂(Invitrogen)提取BCa细胞总RNA，检测mRNA水平。使用PrimeScript™RT试剂试剂盒与gDNA Eraser (Takara, RR047A)进行互补DNA (cDNA)合成，使用1μ每个样品G RNA。使用TBGreen®预混物EXAQ TM（Takara RR820A）进行QPCR反应，以确定mRNA转录水平。用于QRT-PCR的引物在补充表中列出S1，siRNA用于击倒METTL3，并在补充表中列出AFF4表达S2。

Western blotting采用标准方法，用RIPA缓冲液裂解BCa细胞。然后将细胞裂解液与负载缓冲液混合，在100°C孵育5分钟，并进行常规Western分析。抗体列于补充表S3。使用密度测定法定量蛋白质的相对水平，用凝胶专业分析仪（媒体网络网络，Rockville，USA）。目标带致密量地量化并在每个带下表示。

２.３.m^6.一个量化

用m^6.RNA定量试剂盒(Epigentek, P-9005)，根据制造商的协议。简单地说，将每个样本的总RNA 200 ng结合到96孔板的条带孔上，然后将m^6.抗体捕获和洗涤。与底物共孵育5分钟后停止反应，用microplate reader (Multiskan FC, Thermo Scientific)在450nm处读取每孔的吸光度。

2.4。芯片测定

根据制造商的指示，使用简单的芯片测定试剂盒（Cell Signal Technology，Danvers，MA）进行染色质免疫沉淀（芯片）测定。通过QPCR纯化沉淀的DNA样品并测量。结果显示为输入控制的百分比。用于芯片测定的引物和抗体被列在补充表中S1和表格S2， 分别。

2.5。限制稀释移植检测

稳定的AFF4敲除5637细胞和对照细胞被连续稀释( - ），resuspended 50μL matrigel（康宁，354230），并皮下注射到Balb / caslac-nu裸鼠（上海实验室动物中心，SLAC）中。每周监测随后的肿瘤，直至小鼠呈现痛苦的迹象，并处死小鼠。所有动物程序都按照安徽医科大学实验室动物中心批准的一份议定书进行。

来自异种移植物的样品的链烷烃部分检索，阻塞和加工，如前所述检索，堵塞和加工。33］．通过Image-Pro加6.0图像分析软件（媒体网络网络）测量免疫染色强度。通过将平均集成光密度（IOD）与总所选择的感兴趣区域（AOI）标准化来计算每个图像的强度。

2.6。统计数据

除非另有说明，否则所有实验均至少进行三次。数据显示为 (S.D.)或标准误差(S.E.)。所有的统计分析都使用Excel(微软，雷德蒙德，华盛顿州)或Prism (GraphPad Software Inc.， La Jolla, CA)进行。双尾学生的 -使用测试，以及一个值<0.05被认为是显着的。为了限制稀释测定，如前所述进行统计测试[34］．

结果

3.1。RNA M.^6.A水平在BCSCs中升高

估计RNA m的潜在作用^6.在调节BCa茎性的修饰中，我们检测了全球RNA m^6.BCa的CSCs和非CSCs的A水平。以乙醛脱氢酶1家族成员A1 (ALDH1A1)为标记物分离BCSCs [35]通过流式细胞术，来自两种成熟的癌细胞系，5637和UM-UC-3（图1（a）)和RNA m^6.甲基化丰度由m^6.RNA定量试剂盒。结果表明，m^6.Aldh1阳性的RNA /总RNA（ALDH1⁺5637和UM-UC-3细胞明显高于aldh阴性(ALDH1^-)比例(图1（b）)．然后检查已知m的表达式模式^6.一个作家(例如,Mettl3.那Mettl14.， 和WTAP)和橡皮擦(即:FTO.和ALKBH5)的定量RT-PCR，以确定哪些亚基可以解释m^6.cscs的失调，发现表达了Mettl3.ALDH1，而不是其他调节因素明显升高⁺BCA细胞（图1（c）)．进一步证实ALDH1中METTL3蛋白水平较高⁺BCA细胞通过Western Blot（WB）（图1（d）)．所有这些数据表明MetT13在BCSCS中上调，并且可以涉及自我更新。

３．２．靶向metttl3表达损害BCSC自我更新

为了确定MetT13对BCSC自我更新是重要的，我们将两个不同的siRNA（Si-MetT13-1和Si-MetT13-2）用来在5637和UM-UC-3细胞中烧蚀MetT13表达。与Nontargeting对照siRNA（Si-GFP）相比，特异性siRNA均显着降低MetT3 mRNA和蛋白质水平（图2（a）和2（b）)．鉴定BCSC的群体的两个特征是当在超级粘附板（球体测定）和高ALDH活性上培养时产生子细胞簇的能力，该高ALDH活性可以使用荧光基底通过流式细胞术量化[7.］．

SiRNA转染36小时后，通过流式细胞术检查具有高ALDH活性的细胞，并将来自不同转染基团的高ALDH活性的细胞进一步转移到具有干细胞介质的超级粘附板。一周后，计算形成的球体的数量。具有高ALDH活性的细胞百分比（图2（c）和2（d））和球形形成频率（图2（e）和2（f））显着下降Mettl3.击倒。通过上述证据，我们得出结论，BCSC自我更新需要METTL3体外。

3.3。AFF4由BCSCS的METTL3调节

在以前的研究中，我们进行了转录组测序和m^6.测序后跟5637个细胞中的串联验证，证明了m^6.修改和表达AFF4MetT13直接调节mRNA [11.］．为了确定AFF4也是BCSCs中METLL3的靶标，我们将检查ALDH1中的AFF4 mRNA和蛋白质水平⁺和Aldh1.^-分别为5637和UM-UC-3的细胞。毫不奇怪，在ALDH1中观察到显着更高水平的AFF4表达⁺与相应的ALDH1相比较^-BCa细胞中的对应物(图3（a）和3（b）)．此外，基因特异性m^6.a-qpcr使用引物扩增m^6.峰值区域(由m表示^6.a测序结果)或对照(非峰)区显示m^6.丰富的AFF4在Aldh1中的mRNA⁺BCA细胞（数字3（c）和3（d）)，提示CSCs与非CSCs之间AFF4表达的差异受mettl3介导的m调控^6.修改为主。来验证是否AFF4我们进一步分析了AFF4缺失对BCa自我更新的影响，采用类似于metttl3敲除的策略。在5637和UM-UC-3细胞中，sirna有效地消蚀AFF4的表达(图)4（a）和4（b）)，两者的ALDH活性(图4（c）和4（d））和球形形成频率（图4（e）和4（f））显着下降AFF4敲低，模仿MetTL3敲低产生的表型，并表明BCSC自更新中的AFF4和MetT1之间的监管关系。

3.4。AFF4直接规定我的C和SOX2.BCa细胞的基因表达

作为SEC的重要组成部分，AFF4可以直接与DNA结合，调控许多基因的转录伸长。众所周知的CSCs多能因子MYC和SOX2已被报道在BCa中受AFF4调控[11.]及HNSCC [30.]， 分别。为了调查MICC和SOX2是否是REF4在调节BCSCs的自我更新能力方面的效果，我们在5637年和UM-UC-3细胞中进行了芯片测定，并直接绑定了AFF4我的C和SOX2.推动者区几乎无法检测到AFF4击倒(图5（a）)．此外，我们还证实了MYC和SOX2的表达AFF4qRT-PCR和Western blot检测。结果表明，该方法能有效抑制AFF4显著降低了这两个基因在mRNA水平和蛋白水平的表达(图)5（b）和5（c）)．

3．5．AFF4促进bccsc自我更新体内并且是BCA患者的负预后因素

以进一步评估AFF4关于BCSCS的自我更新能力的消耗在活的有机体内，我们进行了限制性稀释移植试验，这是一种广泛用于评估癌症干细胞含量的方法。AFF4在5637个细胞中，通过短发夹RNA（SH-AFF4）稳定消融的表达，然后将其皮下注射到免疫缺陷小鼠中，并随时间测量肿瘤生长。与之一致体外结果，aff4缺陷的细胞表现出明显低于构成肿瘤体积的对照细胞(sh-GFP)的肿瘤传播潜能(图)6（a）和6（b）)．术后ALDH1染色和FACS分析表明ALDH阳性比例缩短（图6 (c)）以及AFF4，SOX2和MYC表达，在异叶移植物中由SH-AFF4 5637细胞产生相对于对照肿瘤（图6 (d))．

BCSCs的肿瘤干细胞特性有助于化疗耐药、转移和复发，这通常与不良的临床结果有关。我们查询了癌症基因组图谱(TCGA)数据库，并借助GEPIA在线工具分析了BCa的生存曲线[36］．metttl3高表达组的无病生存率低于metttl3低表达组价值显示出某种趋势（图6 (e)那 ），虽然更高的表达AFF4明显是BCa预后不良的重要指标(图6 (e)那 )．此外，SOX2的表达量较高(图6 (e)那 ）和myc（图6 (e)那 ）也与更严重的整体生存率有显着相关。携带在一起，AFF4的异常表达与肿瘤散装中的BCSC相关，这可能导致预后差。

4.讨论

我们在我们之前的研究中表明MetT13通过积极调节IKBKB，Rela，AFF4和Myc的表达，在BCA的发病机制中发挥着关键作用^6.基于划分的术语监管[11.］．在这里，我们证明了mRNA m^6.修改对于维持BCSC自我更新和肿瘤发育至关重要。击倒Mettl3.表达降低了BCSCs的自我更新。新兴数据表明，全球m^6.A及其调控因子的表达水平，包括写者、擦除者和读者，在各种类型的癌症中通常是失调的，并且对癌症的开始、进展、转移、耐药性和癌症复发至关重要[22］．有趣的是，m^6.考虑到FTO、ALKBH5和metttl3在胶质母细胞瘤干细胞中的作用，不同类型的癌症中CSCs的失调是不同的[24那25以及metttl14和FTO在白血病干细胞中的作用[26那27］．在BCa中，我们的数据显示，metttl3是唯一异常表达的调节剂，对BCa发病和BCSC维持至关重要。这项研究揭示了mRNA m的重要作用^6.调节BCSCs自我更新和肿瘤鉴定的修饰。然而，异常的原因Mettl3.BCa中的表达尚不清楚，有待进一步研究。

AFF4是一个核心组件，是SEC稳定性和活性所必需的，通过充当脚手架来组装SEC [37那38］．表明AFF4可能在调节多能性中发挥作用的证据包括它参与了人间充质干细胞的成骨分化[28]及人类牙髓细胞的牙源性分化[29］．在头颈部鳞状细胞癌中，干细胞样细胞的肿瘤启动能力也需要AFF4 [30.］．在我们以前的一项研究中，AFF4由我们的转录组和M表示^6.测序数据作为METTL3在BCa细胞中的直接靶标;然后我们证明了这一点AFF4mRNA由METTL3在M中调节^6.依赖的方式(11.］．在目前的研究中，我们揭示了两者^6.丰富和表达水平AFF4mRNA在BCSC中升高，这与MetT13的表达模式一致。此外，ALDH活性和球形能力体外以及引发肿瘤的能力在活的有机体内都废除了AFF4击倒。此外，AFF4表达和BCA入侵潜力之间存在明显的相关性[11.]，这是致瘤性常用的常用指标。我们的数据建议我们的数据建议是一个善意的MetTL3针对调节BCSCs自我更新能力的目标。

我们之前的工作证明了SOX2作为BCA的干燥肿瘤细胞的标记物在活的有机体内[7.］．此外，有证据表明，C-Myc的下调抑制了BCA中的CSC分化，并且C-MYC的过度表达增加了干细胞标志物的水平，包括SOX2 [39］．因此，SOX2和MYC都是CSCs自我更新和分化的主要调控因子，对BCa的启动和进展至关重要。SOX2.据报道，mRNA含有m^6.胚胎干细胞的修饰[40]和胶质母细胞瘤干细胞[24]和m^6.一个修改我的C在急性髓性白血病的CSC中发现mRNA。实际上，我们还确认MELLT3可以通过促进m来调节MYC表达^6.其MRNA在BCA细胞中的修饰[11.］．MetT13很可能通过m促进SOX2和MYC的表达^6.基于A的后颅面调节以及转录水平的AFF4介导的调节，增强了激活BCA细胞的肿瘤启动和自我更新能力的信号。同时，甲基转移酶Mettl3对许多RNA具有全球影响;就像AFF4 / SEC一样，MYC和SOX2通过与DNA的多个位点结合来对各种多能性相关基因的表达产生广泛影响。因此，MetT3调节BCSCs的作用可能不仅仅依赖于AFF4。需要调查参与BCA启动和自我更新的其他潜在的靶基因。

总之，我们找到m^6.一个修改AFF4在BCSCs中，METTL3上调RNA表达，进而促进SOX2和MYC的表达，增强BCa的成瘤和起瘤能力。我们的研究结果表明，AFF4可能作为BCa患者的生物标志物和治疗的潜在靶点。

数据可用性

安徽医科大学生命科学学院遗传学系李阳博士，安徽合肥230031;电话:86 551 - 65160327;电子邮件：liyang@ahmu.edu.cn.;和迎民张，安徽医科大学生命科学学院遗传学系，安徽230031;电话：86 551-65169646;电子邮件：liyang@ahmu.edu.cn.。

的利益冲突

所有作者宣布没有利益冲突。

作者的贡献

钱高和金铮同样贡献了这项工作。

致谢

作者感谢安徽医科大学科学研究中心和生命科学学院设施对我们实验的宝贵帮助。国家自然科学基金项目(no . 81872313, no . 81672776; no . 81802391; no . 31501838);安徽大学自然科学研究项目(no . KJ2019A0236, no . YY Z);安徽省自然科学基金项目(no . 1808085QH266, no . QG)

补充材料

补充表1:引物信息。补充表2:sirna信息。补充表3:抗体信息。补充图1:用于shRNA构建的质粒主干。（补充材料）

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