SCI. 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/8849218 8849218 研究文章 m6甲基化调控的AFF4促进膀胱癌干细胞的自我更新 高 钱 1 郑 斤 2 你 Zegui. 1 太阳 Pengli 1 杨 聪聪 1 程 毛生 1 吴 明清 1 张 秀红 1 元 林 2 https://orcid.org/0000-0002-0235-8087 张 莹隐林 1 https://orcid.org/0000-0002-9725-8774 李 杨 1 元 拱 1 遗传系 生命科学学院 安徽医科大学 合肥 安徽230031. 中国 ahmu.edu.cn 2 病理学部 上海综合医院 上海交通大学医学院 海宁路100号 虹口区 上海200080年 中国 shsmu.edu.cn. 2020. 2 7 2020. 2020. 25 4 2020. 9 6 2020. 11 6 2020. 2 7 2020. 2020. 版权所有©2020钱Gao等。 这是在Creative Commons归因许可下分发的开放式访问文章，其允许在任何介质中不受限制地使用，分发和再现，只要正确引用了原始工作。

动态N6- 甲基壬酸（M.6a）mRNA的修饰在调节基因表达和确定细胞命运方面发挥作用。但是，m的功能6尚未描述膀胱癌干细胞（BCSCs）中的mRNA改性。在这里，我们显示全球RNA M6丰富和米的表达6BCSC的形成酶MetT13比膀胱癌（BCA）细胞的非CSCs中的酶。枯竭 METTL3抑制BCSCs的自我更新，其表现为ALDH活性和成球能力下降。机械上，metttl3调节m6修改，从而表达AF4 / FMR2家族成员4（AFF4），禁止苯上的敲低 METTL3并降低BCSCs的肿瘤启动能力 在活的有机体内．AFF4与启动子区域结合并维持 SOX2和 我的C它们在BCSCs中具有重要的生物学功能。总的来说，我们的结果证明了m的关键作用6通过MetT13-AFF4-SOX2 / MYC的新型信号轴进行BCSCs自我更新和致瘤性的修饰。

 安徽省自然科学基金 1808085 qh266 安徽大学自然科学研究项目 KJ2019A0236 国家自然科学基金项目 31501838 81802391. 81672776 81872313 1.介绍

癌症干细胞（CSC，也称为肿瘤引发细胞），具有相对罕见的癌细胞群体，具有自我更新能力，致瘤能力和多能性的特征，这有助于肿瘤发生和转移的驱动力。这些茎秆特性使CSC耐抗常规化疗，并导致随后的复发，导致临床治疗失败[ 1］.目前迫切需要针对CSCs的有效治疗和策略，而我们对CSCs的了解尚不完全。

膀胱癌（BCA）是最常见的恶性肿瘤之一，其特征在于快速进展和复发风险高 2， 3.］.为了更好地理解并最终消除膀胱癌干细胞（BCSCs），我们和其他基团已成功鉴定出几种不同的BCSCs并确定其在BCA进展中的作用 在活的有机体内［ 4- - - - - - 7］.此外，我们发现低剂量的DeeTabine（DNA甲基转移酶抑制剂）可以减少BCSCs的茎，而不会引起严重的细胞毒性[ 8]，表明表观遗传调控在BCSCs中的重要作用。

除了DNA甲基化，最近我们和其他人发现异常的N6- 甲基壬酸（M.6a）甲基化也涉及BCA进展[ 9- - - - - - 11］.RNA M.6A是在大约25%的真核信使rna中观察到的最普遍的化学标记[ 12- - - - - - 14］.在哺乳动物细胞中，该动态改性由甲基转移酶复合物催化，该甲基转移酶复合物组成，其包括甲基转移酶样3（MetT13），MetT14，Wilms肿瘤1-相关蛋白（WTAP），Virma（KiaA1429）和RBM15 [ 15- - - - - - 19]，并被两个“橡皮擦”除去：脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO）[ 20.]和烷基化修复同源蛋白5（ALKBH5）[ 21］.异常的米6修改在不同类型癌症的进展中起着至关重要的作用[ 22]，特别是作为乳腺癌CSCs的调节剂[ 23]，胶质母细胞瘤[ 24， 25]和白血病[ 26， 27］.然而，其调控CSCs的功能和机制似乎与环境相关，目前尚未在BCSCs中进行描述。

在我们之前的研究中，我们发现m6丰富的两种 我的C和 AFF4.通过BCA细胞中的异常表达MetT13调节mRNA [ 11］.作为超伸长率复合物（秒）的核心组分，AFF4参与了编码多能因因素的许多基因的转录伸长的调节[ 28， 29］.例如，AFF4可以上调 SOX2转录促进头部鳞状细胞癌（HNSCC）的肿瘤起始能力[ 30.),而 我的C是另一种已知的AFF4目标[ 11， 31］.受这些结果的启发，我们假设m6A通过调节AFF表达来发挥促进BCA细胞茎的作用。

在这里，我们提供了明确的证据，即MetT13和RNA M的表达6CSC在相对于BCA的非CSCs中的水平显着较高;MetT13通过调节mRNA m来促进BCSCs的自我更新能力6一个水平，因此AFF4的表达，这反过来结合到启动子区域 SOX2和 我的C来激活它们的转录。我们的发现揭示了RNA m的作用和机制6一种调节BCSCs的茎干，并将在临床治疗中激发有关其应用的未来研究。

 2.材料和方法 2.1。细胞培养物，流式细胞术和球形形成测定

BCa细胞株5637 (ATCC NO。HTB-9)和UM-UC-3 (ATCC NO. 9)CRL-1749)购自中国细胞资源中心(上海，中国)研究院，并如前所述进行维护[ 32］.常规测试细胞系的支原体，不超过20个通道。根据制造商的说明，通过Lipofectamine TM rnaimax转染试剂（13778-075）将特异性siRNA转染到细胞中。

对于流式细胞术分析，根据制造商的说明，使用Aldefluor测定试剂盒（Stemcell Technologies）染色BCA细胞。然后使用Beckman Moflo XDP（Beckton Dickson，Ca）进行采集和分类。使用未染色和同种型对照建立荧光分馏的栅极。

对于球形成试验，facs分选的细胞在24孔超低附着板(Corning Inc.， Corning, NY, USA)中培养，密度为每孔1000个细胞。细胞培养在无血清DMEM/F12中添加生长因子EGF， β-FGF和IGF-1浓度为20 ng/ml (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)。直径超过20的球体 μ.电镀后7天计数。

 2.2。检测基因表达

采用Trizol试剂(Invitrogen)提取BCa细胞总RNA，检测mRNA水平。使用PrimeScript™RT试剂试剂盒与gDNA Eraser (Takara, RR047A)进行互补DNA (cDNA)合成，使用1 μ.每个样品G RNA。使用TBGreen®预混物EXAQ TM（Takara RR820A）进行QPCR反应，以确定mRNA转录水平。用于QRT-PCR的引物在补充表中列出 S1，siRNA用于击倒METTL3，并在补充表中列出AFF4表达 S2 ．

Western blotting采用标准方法，用RIPA缓冲液裂解BCa细胞。然后将细胞裂解液与负载缓冲液混合，在100°C孵育5分钟，并进行常规Western分析。抗体列于补充表 S3.．使用密度测定法定量蛋白质的相对水平，用凝胶专业分析仪（媒体网络网络，Rockville，USA）。目标带致密量地量化并在每个带下表示。

 ２.３.6 m <一口> < /一口>量化

RNA M6a水平由m评估6根据制造商的协议，RNA定量试剂盒（EPigentek，P-9005）。简而言之，每个样品的200ng总RNA与96孔板的条带阱结合，然后是m6抗体捕获和洗涤。与底物共孵育5分钟后停止反应，用microplate reader (Multiskan FC, Thermo Scientific)在450nm处读取每孔的吸光度。

 2.4。芯片测定

根据制造商的指示，使用简单的芯片测定试剂盒（Cell Signal Technology，Danvers，MA）进行染色质免疫沉淀（芯片）测定。通过QPCR纯化沉淀的DNA样品并测量。结果显示为输入控制的百分比。用于芯片测定的引物和抗体被列在补充表中 S1和表格 S2， 分别。

 2．5．极限稀释移植试验

稳定的AFF4敲低5637细胞和对照细胞连续稀释（ 1 × 10 5 - 2.7 × 10 6 ），重新悬浮于50  μ.l，并皮下注射BALB/cASlac-nu裸鼠(上海实验动物中心，SLAC)。随后的肿瘤每周监测一次，直到小鼠出现痛苦迹象，然后将小鼠处死。所有动物手术均按照安徽医科大学实验动物中心批准的协议进行。

来自异种移植物的样品的链烷烃部分检索，阻塞和加工，如前所述检索，堵塞和加工。 33］.采用image - pro Plus 6.0图像分析软件(Media Cybernetics)测量免疫染色强度。通过将平均积分光密度(IOD)与总感兴趣区域(AOI)归一化，计算出图像的强度。

 2.6。统计数据

除非另有说明，否则所有实验均至少进行三次。数据显示为 方法 ± 标准 偏差 (S.D.)或标准误差(S.E.)。所有的统计分析都使用Excel(微软，雷德蒙德，华盛顿州)或Prism (GraphPad Software Inc.， La Jolla, CA)进行。双尾学生的 t -test被使用，a p 值<0.05被认为是显着的。为了限制稀释测定，如前所述进行统计测试[ 34］.

 结果 3.1。RNA m <sup> 6 </ sup>水平在bcscs升高

估计RNA m的潜在作用6调节BCA茎干的修饰，我们研究了全球RNA M6BCa的CSCs和非CSCs的A水平。以乙醛脱氢酶1家族成员A1 (ALDH1A1)为标记物分离BCSCs [ 35通过流式细胞术检测5637和UM-UC-3两种已建立的癌细胞(图 1(一))和RNA m6甲基化丰度由m6RNA定量试剂盒。结果表明m的比率6Aldh1阳性的RNA /总RNA（ALDH1+5637和UM-UC-3细胞明显高于aldh阴性(ALDH1-)比例(图 1 (b)）.然后检查已知m的表达模式6作家（即， METTL3， Mettl14.， 和 WTAP.）和橡皮擦（即， FTO.和 ALKBH5)的定量RT-PCR，以确定哪些亚基可以解释m6CSCs的异常调节，并发现 METTL3ALDH1，而不是其他调节因素明显升高+BCa细胞(图 1 (c)）.MetT13的蛋白质水平进一步验证在ALDH1中更高+Western blot检测BCa细胞(图 1 (d)）.这些数据表明metttl3在BCSCs中上调，可能与自我更新有关。

差速器6A水平之间的CSCs和非CSCs的BCa。(a) aldh1染色5637和UM-UC-3细胞FACS分选的代表性门控方案。(b) m的量化6aldh1阳性和aldh1阴性BCa细胞A水平( * p < 0.05 ， * * p < 0.01 、学生 t 以及)。(c) RNA m . mRNA水平6aldh1阳性和aldh1阴性BCa细胞的书写者和橡皮擦( * * p < 0.01 、学生 t 以及)。（d）RNA m的蛋白质水平6Aldh1阳性和Aldh1阴性BCA细胞中的甲基转移酶MetT13。

 3.2。瞄准MettL3表达损害BCSC自我更新

为了确定METTL3对BCSC自我更新是否重要，我们使用了两种不同的sirna (si- metttl3 -1和si- metttl3 -2)来消融METTL3在5637和UM-UC-3细胞中的表达。与非靶向对照siRNA (si-GFP)相比，这两种特异性siRNA都显著降低了METTL3 mRNA和蛋白水平(图) 2（a）和 2（b））.鉴定BCSC的群体的两个特征是当在超级粘附板（球体测定）和高ALDH活性上培养时产生子细胞簇的能力，该高ALDH活性可以使用荧光基底通过流式细胞术量化[ 7］.

MetT13需要维持BCA细胞的自我更新。在mRNA（（a）通过QRT-PCR）和蛋白质水平，验证特异siRNA（Si-MetT13-1和Si-MetT13-2）在5637和UM-UC-3细胞中的敲低效应（（a））（（b）通过Western Blot）。ALDH活性高的细胞比率(c, d);标记转染sirna的BCa细胞在干细胞培养基(e, f)中形成的球的数量和大小，并给出具有代表性的图像。 * * p < 0.01 与争夺群体相比，由学生 t 以及。秤栏，250  μ.m。

SiRNA转染36小时后，通过流式细胞术检查具有高ALDH活性的细胞，并将来自不同转染基团的高ALDH活性的细胞进一步转移到具有干细胞介质的超级粘附板。一周后，计算形成的球体的数量。具有高ALDH活性的细胞百分比（图 2（c）和 2（d））和球形形成频率（图 2（e）和 2（f）)显著降低 METTL3可拆卸的。综上所述，我们得出BCSC自我更新需要metttl3的结论 在体外．

 3.3。AFF4由BCSCS的METTL3调节

在以前的研究中，我们进行了转录组测序和m6测序后跟5637个细胞中的串联验证，证明了m6修改和表达 AFF4.mRNA直接受metttl3调控[ 11］.为了确定AFF4是否是BCSCs中METLL3的靶点，我们检测了ALDH1中AFF4的mRNA和蛋白水平+和ALDH1-分别为5637和UM-UC-3的细胞。毫不奇怪，在ALDH1中观察到显着更高水平的AFF4表达+与相应的ALDH1相比较-BCA细胞的对应物（图 3(一个)和 3 (b)）.此外，基因特异性m6利用引物进行A-qPCR扩增6峰值区域(由m表示6a测序结果)或对照(非峰)区显示m6丰富的 AFF4.信使rna在ALDH1+BCA细胞（数字 3 (c)和 3（d）），这表明CSC和非CSC之间的AFF4表达差异由MetT13介导的M调节6修改为主。来验证是否 AFF4.我们进一步分析了AFF4缺失对BCa自我更新的影响，采用类似于metttl3敲除的策略。在5637和UM-UC-3细胞中，sirna有效地消蚀AFF4的表达(图) 4（a）和 4（b）)，两者的ALDH活性(图 4（c）和 4（d））和球形形成频率（图 4 (e)和 4 (f)）显着下降 AFF4.敲低，模仿MetTL3敲低产生的表型，并表明BCSC自更新中的AFF4和MetT1之间的监管关系。

差异表达水平和m6一级 AFF4.在BCA的CSC和非CSC之间。ALDH1阳性和ALDH1阴性BCA细胞中AFF4的mRNA水平（a）和蛋白质水平（b）。米6特定地区的修改 AFF4.通过基因特异性M测试AldH1阳性和AlDh1-阴性5637（C）和UM-UC-3（d）细胞中的转录物6A-QPCR测定。 * p < 0.05 ， * * p < 0.01 与争夺群体相比，由学生 t 以及。

AFF4.模仿…的表型 METTL3在调节BCSCs的茎秆。特定sirnas的敲低效应（si- AFF4.1和si - AFF4.-2)在mRNA ((a)通过qRT-PCR)和蛋白水平((b)通过Western blot)进行验证。ALDH活性高的细胞比率(c, d);标记转染sirna的BCa细胞在干细胞培养基(e, f)中形成的球的数量和大小，并给出具有代表性的图像。 * p < 0.05 ， * * p < 0.01 与争夺群体相比，由学生 t 以及。秤栏，250  μ.m。

 3.4。AFF4直接调节<斜视> myc </斜体>和<斜视> sox2 </斜体>基因表达在BCA细胞中

作为SEC的基本组分，AFF4可以直接与DNA结合并调节许多基因的转录伸长。据报道，MYC和SOX2，CSC的众所周知的多能因子因素，由BCA中的AFF4监管[ 11]和HNSCC [ 30.),分别。为了研究MYC和SOX2是否在调节BCSCs的自我更新能力中发挥AFF4的效应，我们对5637和UM-UC-3细胞进行了CHIP检测，发现AFF4直接与BCSCs结合 我的C和 SOX2推动者区几乎无法检测到 AFF4.击倒(图 5（a））.此外，我们还确认了Myc和Sox2的表达以响应 AFF4.qRT-PCR和Western blot检测。结果表明，该方法能有效抑制 AFF4.显著降低了这两个基因在mRNA水平和蛋白水平的表达(图) 5（b）和 5（c））.

AFF4调节BCA细胞中的SOx2和MYC表达。（a）芯片测定显示招聘AFF4 我的C和 SOX2在转染48小时后，5637和UM-UC-3细胞的启动子区域被指示sirna转染。MYC和SOX2在转染sirna的5637和UM-UC-3细胞中的表达 AFF4.1和si - AFF4.-2）在mRNA（（b）通过qRT-PCR）和蛋白质水平（（c）通过蛋白质印迹验证。 * p < 0.05 ， * * p < 0.01 相对于由学生组成的争夺组 t 以及。

 3.5。AFF4促进BCSC自我更新<斜体>体内</斜体>，是BCA患者的负预后因素

进一步评估效果 AFF4.关于BCSCS的自我更新能力的消耗 在活的有机体内，我们进行了限制性稀释移植试验，这是一种广泛用于评估癌症干细胞含量的方法。 AFF4.在5637个细胞中，通过短发夹RNA（SH-AFF4）稳定消融的表达，然后将其皮下注射到免疫缺陷小鼠中，并随时间测量肿瘤生长。与之一致 在体外结果，aff4缺陷的细胞表现出明显低于构成肿瘤体积的对照细胞(sh-GFP)的肿瘤传播潜能(图) 6(一)和 6 (b)）.ALDH1染色和FACS分析显示aldh阳性比率明显降低(图 6 (c)）以及AFF4，SOX2和MYC表达，在异叶移植物中由SH-AFF4 5637细胞产生相对于对照肿瘤（图 6 (d)）.

AFF4对于BCA肿瘤繁殖至关重要 在活的有机体内．将肿瘤小鼠的百分比（a）和量化（b）在皮下注射不同稀释5637细胞或对照细胞的免疫缺陷小鼠（ n ＝ 6 每次稀释）。（c）来自异种移植物的ALDH阳性细胞的比例。 * * p < 0.01 由学生 t 以及。(d) AFF4稳定敲低的BCa细胞和对照细胞产生的异种移植物中AFF4、SOX2和MYC表达的定量测量和代表性图像。（ * * p < 0.01 由学生 t 以及)。规模的酒吧,50 μ.m. (e) TCGA数据集中BCa患者metttl3、AFF4、SOX2、MYC mRNA表达与生存的相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线分析高表达组和低表达组的无病生存或总生存，采用log-rank检验进行比较。

BCSCs的癌症茎秆特性有助于化学抑制，转移和复发，其通常与临床结果不良有关。我们询问癌症基因组Atlas（TCGA）数据库，并在Gepia在线工具的帮助下分析了BCA的存活曲线[ 36］.在MetT13高表达组中发现了比MetT13低表达组的差异更差的无病生存期，以及 p 价值显示出某种趋势（图 6 (e)， p ＝ 0.11 )，而较高的表达 AFF4.明显是BCa预后不良的重要指标(图 6 (e)， p ＝ 0.008 ）.此外，SOX2的表达更高（图 6 (e)， p ＝ 0.02 ）和myc（图 6 (e)， p ＝ 0.009 ）也与更严重的整体生存率有显着相关。携带在一起，AFF4的异常表达与肿瘤散装中的BCSC相关，这可能导致预后差。

 4.讨论

我们在我们之前的研究中表明MetT13通过积极调节IKBKB，Rela，AFF4和Myc的表达，在BCA的发病机制中发挥着关键作用6基于划分的术语监管[ 11］.在这里，我们证明了mRNA m6修改对于维持BCSC自我更新和肿瘤发育至关重要。击倒 METTL3表达降低了BCSCs的自我更新。新兴数据表明，全球m6其监管机构的A和表达水平，包括作家，橡皮擦和读者，通常在各种类型的癌症中赘言，对癌症起始，进展，转移和耐药性和癌症复发至关重要[ 22］.有趣的，m的原因6CSC中的缺点在各种类型的癌症中是不同的，考虑到FTO，AlkBH5和MetT13在胶质母细胞瘤干细胞中的作用[ 24， 25以及metttl14和FTO在白血病干细胞中的作用[ 26， 27］.在BCA中，我们的数据显示METT13是对BCA发病机制和BCSC维护的异常表达和关键的唯一调节器。本研究发现MRNA M的关键作用6调节BCSCs自我更新和肿瘤发生的修饰。然而，原因异常 METTL3BCA中的表达仍然是未知的并且等待进一步调查。

AFF4是一个核心组件，是SEC稳定性和活性所必需的，通过充当脚手架来组装SEC [ 37， 38］.表明AFF4可能在调节多能性中发挥作用的证据包括它参与了人间充质干细胞的成骨分化[ 28人牙髓细胞的牙突化分化[ 29］.在头颈部鳞状细胞癌中，干细胞样细胞的肿瘤启动能力也需要AFF4 [ 30.］.在我们以前的一项研究中，AFF4由我们的转录组和M表示6测序数据作为METTL3在BCa细胞中的直接靶标;然后我们证明了这一点 AFF4.METTL3调控mRNA表达6依赖的方式[ 11］.在目前的研究中，我们揭示了两者6丰富和表达水平 AFF4.mRNA在BCSC中升高，这与MetT13的表达模式一致。此外，ALDH活性和球形能力 在体外以及引发肿瘤的能力 在活的有机体内都被废除了吗 AFF4.可拆卸的。此外，AFF4表达和BCA入侵潜力之间存在明显的相关性[ 11，这是另一种常用的致瘤指标。综上所述，我们的数据表明AFF4是一个 善意的MetTL3针对调节BCSCs自我更新能力的目标。

我们之前的工作证明了SOX2作为BCA的干燥肿瘤细胞的标记物 在活的有机体内［ 7］.此外，有证据表明，C-Myc的下调抑制了BCA中的CSC分化，并且C-MYC的过度表达增加了干细胞标志物的水平，包括SOX2 [ 39］.因此，SOX2和MYC都是CSC的自我更新和分化的主调节因子，对BCA启动和进展至关重要。 SOX2据报道，mRNA含有m6胚胎干细胞的修饰[ 40]和胶质母细胞瘤干细胞[ 24]和m6修改 我的C在急性髓性白血病的CSC中发现mRNA。实际上，我们还确认MELLT3可以通过促进m来调节MYC表达6BCa细胞中其mRNA的修饰[ 11］.可能是METTL3通过m促进SOX2和MYC表达6基于转录后调控和aff4介导的转录水平调控，增强信号激活BCa细胞的肿瘤启动和自我更新能力。同时，甲基转移酶metttl3对多种rna具有全局效应;与AFF4/SEC一样，MYC和SOX2通过与DNA的多个位点结合，对多种多能性相关基因的表达产生广泛的影响。因此，METTL3调控BCSCs的作用可能不仅仅依赖于AFF4。其他可能参与BCa起始和自我更新的靶基因还有待研究。

总之，我们找到m6修改 AFF4.在BCSCs中，METTL3上调RNA表达，进而促进SOX2和MYC的表达，增强BCa的成瘤和起瘤能力。我们的研究结果表明，AFF4可能作为BCa患者的生物标志物和治疗的潜在靶点。

 数据可用性

安徽医科大学生命科学学院遗传学系李阳博士，安徽合肥230031;电话:86 551 - 65160327;电子邮件： liyang@ahmu.edu.cn;和迎民张，安徽医科大学生命科学学院遗传学系，安徽230031;电话：86 551-65169646;电子邮件： liyang@ahmu.edu.cn．

 利益冲突

所有的作者都宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

钱高和金铮同样贡献了这项工作。

 致谢

作者感谢安徽医科大学和生命学院设施科学研究中心，在我们的实验中有价值的帮助。这项工作得到了中国国家自然科学基金（81872313和81672776至YL，81802391至QG和31501838至Xh Z）的支持，是安徽大学自然科学研究项目（KJ2019A0236至YY Z），以及安徽省自然科学基金会（1808085Q266至QG）。

 补充材料

补充表1:引物信息。补充表2:sirna信息。补充表3:抗体信息。补充图1:用于shRNA构建的质粒主干。

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