老化导致p53 / p21 Genioglossus肌肉干细胞和增强上呼吸道损伤

文摘

人口老龄化带来相关的社会问题,如肌肉衰减和再生障碍增加老化。肌肉修复和再生取决于肌肉干细胞(音乐)。阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)老龄化上升。阻塞性睡眠呼吸暂停综合症导致缺氧和上呼吸道肌肉损伤。然而,很少有人知道年龄增加和缺氧的影响上气道肌肉。genioglossus (GG)的主要扩张器是肌肉保持上呼吸道开放。这里,我们报道,肌肉纤维和音乐功能下降与衰老GG。年龄增加也减少了GG音乐的迁移和扩散。p53、p21高表达在肌肉组织和GG音乐。我们进一步发现缺氧抑制GG音乐核扩散和降低肌原性的分化。然后,缺氧增强抑制衰老的增殖和分化的影响。 Finally, we investigated that hypoxia and aging interact to form a vicious circle with upregulation of p53 and p21. This vicious hypoxia plus aging damage accelerated upper airway muscle injury. Aging and hypoxia are the major damage elements in OSA patients, and we propose that the damage mechanism of hypoxia and aging in GG MuSCs will help to improve upper airway muscle regeneration.

1。介绍

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的根本来源是在睡眠期间反复缺氧(1,2,在老年阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的发病率高(3,4]。Genioglossus (GG),一个主要的上呼吸道扩张器,是阻塞性睡眠呼吸暂停综合症病理生理学的关键。与其它骨骼肌相比,genioglossus比重高氧氧化肌肉纤维和敏感的5]。上呼吸道肌肉更容易与衰老(6),是一种与年龄相关的变化的光纤类分布上呼吸道肌肉(7]。然而,年龄的增加,GG功能的影响及相关机制还有待阐明。

肌肉干细胞(音乐)负责肌肉的生长和损伤修复的整个生命周期(8]。刺激后,音乐可以分化成细胞,然后相互融合来修复受损的肌肉(9,10]。肌肉是自我调节的组织和可以忍受每日磨蚀修复和再生11]。随着年龄的增加,逐步削弱和再生功能障碍的重要原因是肌肉音乐功能下降(12]。在老化细胞,也有灭活抗氧化途径,增加了活性氧,细胞凋亡(13]。GG修复和再生阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的病人是非常重要的。然而,老化的影响GG音乐仍然是未知的。

p53是一个著名的肿瘤抑制和变异在一个大比例的癌症14]。与此同时,p53是一个转录因子参与许多细胞过程,如细胞循环控制、DNA修复,细胞凋亡,细胞应激反应(15]。p53也是衰老和缺氧信号通路的下游成员(16,17]。p53增加骨骼肌衰老的扩张和鼓励。凋亡环境鼓励p53在肌肉组织(18]。然后,p53缺氧敏感,可能抑制肌肉细胞增殖与p21交互和低氧诱导因子- 1α(HIF-1α)[19]。p21在损伤后肌肉分化中起着重要的作用[20.]。有限的报道表明,缺氧促进自噬和调节线粒体功能的GG音乐1,2]。然而,衰老机制的GG音乐在缺氧和p53、p21是否参与这个过程仍不清楚。

反复气道崩溃和阻塞性睡眠呼吸暂停患者的缺氧造成的阻塞。这缺氧加剧上呼吸道肌肉损伤。肌肉损伤进一步增加阻塞,形成一个恶性循环。有研究表明,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的患病率随老化(3,4]。我们以前的工作表明,缺氧抑制GG音乐,导致肌肉的肌原性的分化障碍(21- - - - - -23]。然而,老化的机理和缺氧损伤GG音乐几乎没有报道。在这项研究中,我们假设老化和缺氧可能伤害GG音乐上调p53、p21。

2。材料和方法

2.1。动物和伦理问题

C57BL / 6小鼠(男,1到12个月大)从上海得到Bikai生物技术。老鼠在自然衰老动物屋的条件设施,与十二12 h光明与黑暗周期。所有的动物都是麻醉和安乐死。鼠标GG被移除,然后在液态氮冷冻和储存在−80°C迅速为后续定量聚合酶链反应(qPCR)测量。这项研究符合上海口腔医院的动物伦理委员会,复旦大学。

2.2。细胞培养和增殖化验

在无菌条件下,GG被切除。首先,组织切成1毫米³大小。接下来,肌浆I型胶原酶消化与0.1%(美国Gibco)和0.05% trypsin-EDTA (Gibco、加拿大)37°C每30分钟。然后,消化了杜尔贝科的添加修改鹰介质(英国Gibco DMEM)补充10%胎牛血清(Gibco的边后卫,新西兰)。最后,细胞被镀在培养皿中,重复两次微分附件治疗被用于去除成纤维细胞。在接下来的实验中,为了避免成纤维细胞接管另一个细胞群,成为主要的细胞类型的文化中,我们仅仅使用音乐从通道1。一旦细胞融合达到了90%,他们被孵化分化2%马血清DMEM(美国Hyclon)。CoCl₂溶解到200μ米在DMEM实际使用。

GG音乐是评估使用的增殖细胞计数kit-8 (CCK-8、Dojindo、日本)化验。简单地说,细胞被播种在96 -孔板的密度 细胞每口井。6天培养后,细胞治疗在DMEM CCK8 2 h为10%。光密度(OD)的测量在430 nm标在37°C。

2.3。伤口愈合试验和Transwell细胞迁移试验

对于伤口愈合实验,GG音乐从四个年龄组被播种在6孔板。nearly100%融合之后,创建一个伤口无菌200μl塑料吸管小费的中心,然后用PBS洗两次去除细胞碎片和由1%的边后卫在DMEM培养24小时。伤口在0和24小时被捕。伤口愈合的大小是衡量软件使用图像1.5 J。

迁移试验,GG音乐( )被播种的transwell插入(配角、中国、孔隙尺寸:8毫米)。迁移细胞的检测和计算进行了如前所述[24]。在37°C孵化后24 h, GG音乐剩余在参议院和棉签膜被移除。迁移的细胞被固定在冰冷的4% PFA 10分钟和沾1%结晶紫溶液10分钟。被俘100×5场放大图像。

2.4。GG肌肉的肌电图(EMG)_GG)

肌电图_GG如前所述(收购和分析25]。总之,老鼠与1%戊巴比妥麻醉,然后我们把腹肌和暴露了genioglossus肌肉。接下来,两个Teflon-insulated线圈电极被用来记录肌电图_GG。的肌电图_GG信号放大、带通滤波从1到1000赫兹(ADInstrument澳大利亚),和数字化采样率为1000 Hz (LabChart 8)。肌电图_GG纠正,1 s时间常数应用计算移动平均(LabChart 8)。

2.5。马森苏木精和伊红三色的染色

GG收集从四个年龄组男性C57BL / 6小鼠和PFA固定在冰冷的4%。然后,GG是嵌入在石蜡,切成4μ米厚的部分由石蜡切片机。部分是安装在玻璃幻灯片,然后被苏木精和伊红染色(圆),Solarbio,北京)染色观察肌肉纤维形态,马森和三色的染色(Servicebio、武汉、中国)进行分析肌肉纤维胶原蛋白含量。

2.6。免疫组织化学(包含IHC)和免疫荧光(如果)试验的组织

对于包含IHC检测,4μ米部分嵌入在石蜡deparaffinized和水化。然后,幻灯片孵化与10%山羊血清封闭(美国罗福斯生物制品)溶液在室温下30分钟。接下来,幻灯片是孵化主要抗体p53(1: 500年,圣克鲁斯生物技术)和p21在一夜之间(1:500年,圣克鲁斯生物技术)在4°C。然后,幻灯片是孵化与第二抗体(Abcam 1: 1000年,英国)在室温下1 h。酶共轭是申请在室温下10分钟紧随其后发展原子能委员会(Solarbio,北京)。每个部分被捕三次使用光学显微镜。消极的控制,PBS代替主要抗体。

如果化验,4μ米部分患者。冻干后,PBS Triton x - 100 0.25%被用作膜透性代理。然后,部分被封锁10%山羊血清在室温下密封解决方案为30分钟。接下来,幻灯片是孵化主要抗体Ki67(1: 1000年,热科学)和Pax7 (Abcam 1: 250年,英国)一夜之间在4°C,然后幻灯片孵化与anti-rabbit二级抗体(Abcam 1: 10000年,英国)在黑暗中在室温下1 h。最后,部分与4孵化 ,DAPI 6-diamidino-2-phenylindole(1: 10000年,Abcam,英国)10分钟,并使用荧光显微镜照相。

2.7。免疫荧光检测的细胞

细胞被播种在冰冷的24孔板和彩色4% PFA在室温下10分钟第三天。与PBS细胞被洗了三次,0.25% Triton x - 100作为膜透性代理。接下来,细胞被封锁5%牛血清白蛋白(BSA) 1 h和初级抗体Ki67, Pax7, HIF-1α罗福斯生物制品(1:300年,美国)在4°C 48 h。磷酸盐(PBS)是控制主要抗体。然后,细胞被洗了三次磷酸盐Tween-20 (PBST),孵化与第二抗体1 h在黑暗中在室温下。最后,细胞与DAPI孵化8分钟,照片是被荧光显微镜。

2.8。定量实时聚合酶链反应测定

细胞或组织的总RNA提取使用试剂盒(美国Ambion)试剂,然后反向转录cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(Tiangen,中国)。定量rt - pcr进行20μl反应混合物SYBR绿色PCR反应混合液(光周期计,美国)。目标基因的引物序列表中列出1。每个基因的相对表达水平计算使用方法。RNA表达规范化β肌动蛋白的表达。

2.9。免疫印迹分析

细胞被收集的2 x裂解缓冲。然后,30μl总蛋白质的10% sds - page凝胶分离,和蛋白质在凝胶转移到0.45μm聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。膜被浸泡在5%的牛奶在室温下1 h。接下来,膜与初级孵化抗体p53(1: 1000年,Proteintech), p21(1: 1000年,Abcam) MyHC (1:50 0, DSHB) MyoD(1: 500年,微孔)β肌动蛋白(Absin 1: 10000年,中国)一夜之间在4°C。后 TBST洗,二次抗体(1:10000年,细胞信号)在室温下2 h和模具的强度与p53、p21控制所有其他的乐队。软件数据分析图像1.5 J。

2.10。统计分析

统计分析是由GraphPad Prism 7.0 (GraphPad软件,拉霍亚,CA)。所有的结果都显示为 从至少三个独立的实验。测量值的小动物——一张长有学生的统计学意义 - - - - - -测试和数据的计算是通过Excel。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。结果

3.1.1。上呼吸道肌肉的结构和功能受到年龄增加的影响

上呼吸道变得更可折叠的老化,和genioglossus (GG)是主要的上呼吸道肌肉维持术后咽(6]。因此,GG的结构和功能发挥重要作用在阻塞性睡眠呼吸暂停综合症。新一代纤维与肌肉力量赤字和易疲劳性(26]。与其它骨骼肌相比,genioglossus比重高的氧化肌肉纤维和氧气敏感5]。调查GG肌肉是否改变通过增加年龄,我们首先检查肌纤维的横截面积(CSA)来自四个年龄组。我们的研究结果表明,6个月或12个月大的老鼠相比,2个月大的老鼠和一个CSA减少显著减少(图相比,出生2个月大的老鼠1(一))。类似的结果在胶原蛋白被发现GG的内容,这表明,丽江鼠标genioglossus胶原蛋白含量最高,胶原蛋白含量少6和12个月大的老鼠相比,2个月大的老鼠(图1 (b))。

然后,我们使用肌电图分析如果肌肉损伤随着年龄的增长而变化。肌电图是一种潜在的变化,发生在骨骼肌兴奋是因为一代,动作电位的传导和扩散的肌肉纤维。我们麻醉小鼠的不同年龄(出生,2个月大,6个月大,和12个月大),然后检查genioglossus肌(EMG活动_GG这些老鼠。结果表明,四个指标的肌电图_GG积分,包括振幅、最大振幅、频率、平均和最大频率,减少与衰老,除了出生是最弱的(图1 (c))。这些发现表明,GG的结构和功能在成年小鼠随着年龄的增长而显著减少。

3.1.2。更新能力下降,p53、p21增加衰老GG

为了调查年龄的增加影响了自我更新功能是否GG的音乐Pax7,配对类型同源框转录因子的表达,被认定为可量化的干细胞的标志(27]。因此,我们使用Pax7检测GG音乐的自我更新功能。免疫荧光检测显示,Pax7-positive老化细胞逐渐减少(图2(一个))。我们发现GG Pax7-positive细胞的百分比明显下降在12个月大(1.8%)比其他年龄组在图2 (e)(1 m: 3.7%;2 m: 2.5%;和6 m: 2.0%)。

在细胞增殖的能力也发现类似的结果在GG。调查是否年龄增加修复细胞的增殖能力GG, Ki67标记蛋白对细胞增殖,测试(图2 (b))。结果表明,GG Ki67-positive细胞减少在12个月大(0.8%)与其他年龄组相比,在图2 (f)(1 m: 2.5%;2 m: 1.5%;和6 m: 1.0%)。因此,我们得出结论,GG的更新功能下降与衰老。

此外,p53、p21不仅是著名的肿瘤抑制,而且衰老和缺氧的下游信号通路成员(16,17]。GG的衰老是由p53、p21水平评估。免疫组织化学分析表明,蛋白质p53、p21水平更高的GG 12个月大的老鼠比年轻的老鼠(数字2 (c)和2 (d))。与此同时,p53、p21 mRNA在12个月大的最高( 和 )在所有年龄组(图2 (g))。这些研究结果发现p53、p21增加老化GG。

3.1.3。GG音乐表现出更糟到老年人的迁移和扩散的能力

阻塞性睡眠呼吸暂停综合症引起的缺氧和GG肌肉损伤。当肌肉受伤,音乐经历分化成细胞和相互融合为了修复受伤的肌肉。因此,音乐是重要的功能性细胞GG。探索是否老化GG音乐功能受损,我们GG音乐来自四个年龄组的老鼠(图3(一个))。这些细胞被固定后培养3天。免疫荧光染色显示约87%的孤立的细胞被Pax7-positive和80%的细胞MyoD-positive(图3 (b)),这是音乐的标记。伤口愈合和transwell迁移商会GG音乐(图所示3 (c)和3 (d))。伤口愈合试验表明,迁移的GG音乐从12个月大的明显低于其他三组(图3 (e))。transwell迁移室试验表明,GG音乐都是四个年龄组(图中具有统计学意义3 (e))。第四天,出生仅老鼠的细胞增殖是跑得最快的在四个年龄组(图3 (f))。GG的音乐从12个月大的老鼠表现出细胞增殖能力下降。这些结果表明,老化受损的GG音乐的迁移和扩散能力。

3.1.4。p53、p21参与缺氧和衰老增强GG音乐缺氧反应

阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的特征是在睡眠期间缺氧。为了模仿阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的缺氧,细胞治疗0μ米和200μM CoCl₂,一个典型的化学缺氧模型。p53、p21不仅是著名的肿瘤抑制,也属于一个衰老的下游信号通路和缺氧16,17]。首先,我们检测到p53、p21的水平。结果表明,p53、p21在GG音乐增加缺氧。p53、p21水平严重增加了起来。而出生(数字4(一)和4 (b))。同时,p16和伯灵顿增加缺氧,尤其在老化GG音乐,而bcl - 2减少(图4 (c))。这些结果表明p53、p21和p16函数调节参与GG缺氧下音乐。这些基因表达更明显在GG音乐来源于衰老肌肉。

3.1.5。缺氧增强衰老在GG音乐增殖的抑制作用

探讨缺氧是否影响的扩散GG音乐,GG音乐培养在normoxia (0μM CoCl₂)和缺氧(200μM CoCl₂)。结果表明,细胞缺氧下数量下降到大约40%的细胞培养在normoxia(图5(一个))。然后,我们执行HIF-1免疫荧光染色α,主转录因子在细胞缺氧反应28]。我们的研究结果表明,CoCl₂治疗诱导HIF-1的高表达α。数据证实了其核CoCl本地化₂治疗组,虽然没有荧光检测控制细胞(图5 (b))。与此同时,结果表明,Pax7-positive细胞在缺氧的比例(87.78%)高于normoxia下细胞(83.53%)。它表明,缺氧促进音乐自我更新功能(图5 (b))。Ki67标记蛋白质的核糖体RNA转录,这对细胞增殖是必要的(29日]。结果表明,Ki67-positive细胞饭在normoxia出生相比显著降低,并减少高于缺氧(图下观察5 (c))。主要负对照组没有抗体的结果(图所示5 (d))。在一起,我们的数据表明缺氧的毒性和暗示缺氧GG音乐的扩散和提升自我更新功能下降,特别是在老年细胞。

3.1.6。缺氧的影响加强老化的分化GG音乐和p53、p21表达增加

当GG肌肉受损,GG音乐分化成肌管,在修复受损组织中扮演一个重要的角色30.]。探讨衰老和GG音乐分化之间的关系,我们检查了MyHC和MyoD的水平。结果表明,缺氧下,肌管的数量GG音乐是远低于normoxia之下。重要的是,肌管的数量也少老化GG音乐相比,年轻的(图6(一))。随着衰老,MyHC没有显著变化,但缺氧抑制MyHC表达式。MyoD由缺氧非常压抑,尤其是在衰老细胞(数字6 (b)和6 (c))。缺氧、p53、p21蛋白积累。这种积累更明显的衰老细胞(图6 (c))。mRNA p53、p21缺氧下显著增加。MyHC MyoD信使rna也减少,减少比年轻更严重老化细胞(图6 (c))。总之,缺氧加重衰老的增殖和分化的影响GG音乐和p53、p21参与这个过程。

4所示。讨论

多细胞生物的组织内稳态和器官功能逐渐丧失与衰老。作为老化,干细胞功能逐步下降(31日]。因此,组织内稳态的减少可以归因于下降与年龄相关的干细胞(12]。genioglossus,上呼吸道扩张器,有丰富的血液供应和高比重的氧化对氧气和快速收缩肌肉纤维和敏感与其它骨骼肌相比(5]。在这项研究中,我们在GG衰老和缺氧的影响特征损伤和研究p53、p21在这个过程(图中的作用7)。

我们首先研究了组织功能,如横截面积、胶原蛋白含量,genioglossus肌活动,Pax7-positive细胞和genioglossus Ki67阳性细胞,减少与衰老。信使rna和蛋白质p53、p21增加GG肌肉组织。我们还显示,GG的扩散和迁移音乐减少老化。因此,我们建议衰老GG和它的音乐功能受损。我们进一步证实缺氧的影响音乐来源于衰老GG。我们的数据表明,迁移,增殖,分化能力GG音乐拒绝与衰老。缺氧进一步加强这种抑制效应通过增加p53、p21的水平。

先前的报道表明,上呼吸道与老化变得更可折叠的5]。IIa纤维有明显降低,IIb纤维老化上呼吸道的增加肌肉(7]。有一些与年龄相关的变化和耐力在GG肌肉纤维,和老年大鼠显示减少对低氧诱导应力(7,32]。我们小组报告说,缺氧抑制了GG音乐[增殖和分化23,33]。然而,很少关注重点是缺氧的互动和老化对上呼吸道的肌肉恶性循环。我们的研究首先证明了衰老的机制和缺氧在分子水平上的上呼吸道。

我们证明了GG音乐从丽江老鼠有异常变化与其他年龄组。p53、p21在四个年龄组中最低的。这可能与青少年的行为。在青春期,大脑的发展变化可以是动态的(34,35]。大脑神经突触和修剪髓鞘形成与成熟。这些过程都假定按照宏观结构发生变化。GG肌肉是由舌下神经的支配。舌下神经刺激时,GG肌肉的生理状态的变化(36]。我们推测GG音乐的变化从丽江老鼠可能是因为青少年的发展从舌下神经刺激。

我们的结果可能丰富的治疗理论和提供一些治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者老龄化。临床上,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者定期接受机械扩张上呼吸道症状的缓解气道崩溃。这些机械扩张方法有很多缺点,如病人的依从性差、并发症多。老有一个贫穷的预后治疗上呼吸道尤其是机械扩张。因此,需要更多的证据来阐明衰老之间的相互作用的潜在机制和GG肌肉缺氧。

我们的研究结果表明,缺氧和衰老相互作用形成一个恶性循环的upregulation p53、p21和这种恶性缺氧+老化损伤加速上呼吸道肌肉拉伤。然而,我们知之甚少的机制的神经肌电图的控制_GG。改变神经控制的GG的主要机制可能是阻塞性睡眠呼吸暂停综合症(37]。因此,与年龄相关的因素改变神经控制GG在老年人可能是重要的。与此同时,更多的研究将探索老化GG的神经控制机制。

总之,我们的研究显示,GG肌肉和音乐的功能是衰老过程的影响。与此同时,缺氧加重衰老的增殖和分化的影响通过增加p53、p21 GG音乐。我们的研究结果表明p53、p21的重要作用GG肌肉在老化过程中,它可以提供治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合症上呼吸道损伤修复的基础。

5。结论

阻塞性睡眠呼吸暂停综合症是一种严重的上呼吸道阻塞的问题。超过1亿人口的宽容这种疾病。阻塞性睡眠呼吸暂停综合症带来缺氧和上呼吸道肌肉损伤。然而,缺氧的损害机理和老化genioglossus仍然是未知的。在这项研究中,我们首先发现GG音乐衰老和缺氧的影响,显示详细的属性分析的鼠标GG音乐。我们发现老化影响GG的功能组织和它的音乐。缺氧抑制老鼠GG音乐的扩散,特别是在音乐来源于衰老GG,通过增加p53、p21的表达水平。p53、p21的识别功能鼠标GG音乐可能有助于了解细胞衰老。我们的研究可能受益减少气道阻塞和阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的治疗中获益。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们感谢Zhi-Wen张周和玲玲的知识帮助在这个项目。纸是由中国国家自然科学基金资助(81901031和81901031),上海自然科学基金资助(19 zr1445400),一般项目上海市卫生和计划生育委员会授予(201740091),上海科学技术和创新行动项目Commission-laboratory动物模型(批准号15140903500)。

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