脑脊液脉动应激促进组织工程椎板血管生成

摘要

背景。血管生成是组织工程技术成功实现骨再生的先决条件。以往的研究表明，脑脊液脉动(CSFP)应激在重建组织工程椎板中的作用。在这项研究中，我们研究了CSFP应激在组织工程薄片血管生成中的作用。方法。为了体外研究中，采用CSFP生物反应器研究了CSFP应激对成骨间充质干细胞(MSCs)的影响。为了在活的有机体内将48只新西兰兔随机分为CSFP组和非CSFP组。两组分别用羟基磷灰石- I型胶原支架和成骨间充质干细胞制作组织工程层板(TEL)，植入缺损层板。采用组织学染色、qRT-PCR和放射学分析检测新生薄片的血管生成和成骨能力。结果。的体外研究表明，CSFP应激可促进成骨间充质干细胞血管内皮生长因子A (VEGF-A)表达水平。在动物实验中，CSFP组血管生成标志物的表达水平高于非CSFP组;此外，在CSFP组中，它们在硬脑膜表面的表达水平也高于在椎骨旁肌肉表面，而硬脑膜表面更接近CSFP应力刺激。CSFP组的成骨标志物表达水平也高于非CSFP组。结论。CSFP应激可促进成骨间充质干细胞的血管生成能力，从而促进组织工程片的血管生成。CSFP生物反应器预处理成骨间充质干细胞可能对组织工程技术的椎板重建具有重要意义。

1.背景

组织工程技术已成功应用于椎板缺损的修复。重建的人工椎板可以重建脊柱后柱结构，有效减少硬膜外瘢痕组织、神经根粘连、脊柱退化的发生[1,2]。

前人研究了生物和机械因素对人工椎板形成的影响。结果表明，骨端释放的生物因子可启动人工椎板的早期成骨，脑脊液脉动(CSFP)应激的机械刺激可促进人工椎板的成骨和重塑[3.,4]。

利用组织工程技术修复骨缺损时，血管生成是骨再生成功的先决条件[5]。许多策略已被用于增强组织工程骨的血管化，如特殊的支架设计，添加干细胞或血管生成因子，体外组织工程骨的血管形成，以及在活的有机体内prevascularization [6- - - - - -13]。间充质干细胞（MSC）是最有希望的干细胞类型用于血管组织工程中，并已在所有被广泛用于上述的策略[6,7,9]，因为的MSC不但可以转分化成三个胚层的所有细胞谱系，包括从胚层组织产生血管细胞，但也能分泌一系列血管生成因子，诸如血管内皮生长因子（VEGF），单核细胞趋化蛋白1（MCP-1），白介素（IL-6），外来体，和miRNA的[6,7]。在MSC成骨过程中VEGF-A的表达水平也升高[14]。以前的研究已经表明，机械刺激，尤其是流体剪切应力和循环应变，可以诱导向血管分化和MSCS的MSC表达的血管生成因子[7]。但目前关于脉动应激，特别是CSFP应激对间充质干细胞血管生成能力的研究还很少。

CSFP是由心跳和呼吸的连续脉动应力，并且将其与心脏和呼吸节律[改变15]。在兔子身上，硬脑膜像血管一样泵出，脑脊液在里面流动，造成脑脊液脉动压力。而之前的研究证实腰椎的CSFP应力范围为10 ~ 20mm水压，频率为3 ~ 4 Hz [3.]。因此，我们推测CSFP应激可促进间充质干细胞血管生成因子的表达，进而促进组织工程片的血管生成(图)1(一)）。

因此，在这个研究中，我们旨在探讨CSFP应力对成骨MSC和羟基磷灰石胶原我支架构建组织工程薄片（TEL）的血管生成能力的作用。为了体外研究中，我们使用CSFP生物反应器来研究CSFP应激对成骨沃顿果冻间充质干细胞(MSCs)的影响。为了在活的有机体内在研究中，我们在CSFP组和非CSFP组都将TEL植入椎板缺损部位。然后，用组织学染色、qRT-PCR和放射学分析方法检测新生薄片的血管生成和成骨能力，持续12周。

2。材料和方法

2.1。CSFP生物反应器中成骨MSCs的干预

本研究中使用的间充质干细胞是从兔沃顿脐带果冻中分离得到的。骨髓间充质干细胞的分离、培养和成骨分化已在前一篇文章中描述[3.]。在含10nm地塞米松、10mm的成骨培养基中培养14天后β-甘油磷酸钠，50 mg/ml抗坏血酸，10 nM 1,25-二羟基维生素D3, Sigma-Aldrich，美国)，成骨WJ-MSCs用于以下实验。

在无菌条件下，将PLGA支架(中国重庆诺奇)切至 。将成骨间充质干细胞胰蛋白酶化并重悬于浓度为 /毫升。然后,100年μ将l细胞悬液移至各支架的一侧，在37℃、5% CO的培养箱培养皿中培养₂的气氛。2小时后加入成骨培养基，将所有构建物置于成骨培养基中8小时后固定于生物反应器中。

CSFP生物反应器的设置条件为:流速，6cm /s;频率,3赫兹。CSFP+成骨间充质干细胞组，将构建物用夹子固定在CSFP生物反应器内的脉动管上。成骨间充质干细胞组用夹子固定在CSFP生物反应器的控制管上。我们将接种于PLGA支架上的未分化MSCs作为对照组进行qRT-PCR分析。24小时后，取出构建物进行qRT-PCR分析和VEGF-A免疫荧光检测(图)2）。

2.2。组织工程施工椎板

该方案获得了复旦大学动物实验伦理委员会(20150482A168)的批准。羟基磷灰石- I型胶原支架购自北京美根斯医疗科技有限公司。在无菌条件下，将羟基磷灰石- I型胶原支架切至大小 。在成骨培养基中培养2周后，将骨分化间充质干细胞胰蛋白酶化并重悬于浓度为的培养基中 /毫升。然后,100年μl细胞悬液在每个支架的一侧移行，30 min后，移行100μ另一侧取l细胞悬液。植入前，所有构建物在成骨培养基中再放置一周。

为了观察支架上的细胞活性，支架内成骨间充质干细胞用活/死染色(Thermo Fisher, USA)，核用DAPI反染色(Southern Biotech, USA)。并在ZEISS共聚焦显微镜下进行观察。

2.3。CSFP和非CSFP兔模型的构建

48只2个月大的雄性兔子，体重 kg随机分为CSFP组( )及非计划生育组( ）。用戊巴比妥钠(1ml /kg腹腔)麻醉动物。兔模型制作的手术步骤如下。

CSFP组的家兔，我们通过解剖标志定位第五腰椎的棘突，在皮肤上纵切3cm。将浅筋膜和椎旁肌缩回以显露棘突，然后将棘突移除以显露原生椎板。最后，进行骨缺损的测量 是由咬骨钳在原生层上咬出硬脑膜的。去除原生层片后，只留下两个肉松质骨端量 。支架固定在骨缺损处(图)1 (b)）。

对于非csfp组的家兔，我们用离断器取出椎旁肌，显露棘突和椎板，然后用咬合器取出棘突。通过去除棘突，测量松质骨的末端 ，类似于CSFP小组( ）同时保留硬脑膜表面的薄层皮层。TEL被固定在板缺损部位(图)1 (c)）。

2.4。免疫荧光分析

对于构建的MSC-PLGA，构建物用3%多聚甲醛在PBS中固定10分钟。然后将细胞与5%牛血清白蛋白(Gibco, USA)孵育30分钟，减少非特异性结合。然后VEGF-A用其特异性一抗(Abcam;猫。不。ab1316;5μg/ml)在4℃下放置12小时。然后用PBS洗涤细胞，并与兔抗小鼠辣根过氧化物酶结合的二抗孵育(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)。美国;稀释1:100)1小时，DAPI Fluoromount G (Southern Biotech, USA) 5分钟。然后使用双激发荧光倒置显微镜系统(德国莱卡)对每个样品进行成像。

2.5。微ct(计算机断层扫描)检查

2 .取组织标本^nd4^th, 8^th, 12^th植入后数周，立即用新鲜制备的4% ( )多聚甲醛。在上海市公共卫生临床中心用微ct检查骨形成。使用GEHC MieroView2.0+ABA软件手工重建三维模型。除非csfp组的样本在2处外，所有样本的阈值都设置为1000^nd周( ）。

2.6。组织学染色

显微ct检查后，组织标本用10%乙二胺四乙酸脱钙4周。组织切片为6μ用切片机切下m厚度，装在玻片上。切片经苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫组织化学(IHC)染色进行常规组织学分析。

2.7。包含IHC染色

在60℃下烘烤2小时后，切片用二甲苯脱蜡，然后通过一系列分级乙醇再水合成蒸馏水。内源性过氧化物酶活性被0.3%的过氧化氢阻滞了30分钟，温度为37℃。为了提取抗原，切片在柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中浸泡10 min，然后与正常山羊血清在37℃下孵育30 min，以减少非特异性结合。小鼠抗pecam1 (Invitrogen;猫。不。抗bfgf (Abbiotec, cat)不。和抗bmp2 (Abcam, cat。不。 ab6285) were applied at the dilution of 1 : 50 overnight at 4°C and followed by incubation with horseradish peroxidase- (HRP-) conjugated secondary antibodies (Changdao, China). After rinsing, staining was performed with DAB and counterstained with hematoxylin to display the nucleus. Each slide was imaged using the inversion microscope system (Leica, Germany). The images were analyzed by the software of Image J.

免疫荧光检测，载玻片处理与上述相同。然后用其特异性一抗(Servicebio;猫。不。GB13063;稀释1:50)在4℃下浸泡12小时。PBS冲洗切片，用驴抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗(Servicebio;猫。不。GB21404; dilution, 1 : 300) for 1 hour and DAPI (Servicebio; cat. no. G1012) for 10 min. The slides were sealed with antifluorescence quenching sealant. Each slide was imaged using a fluorescence inversion microscope system (Leica, Germany) with dual excitations.

2.8。定量实时聚合酶链反应

对于构建的MSC-PLGA，使用TRIzol®试剂(Life Technologies, USA)从构建物中提取总RNA。所有RNA样本用无rnase的DNase I处理(Qiagen, Valencia, CA)以消化基因组DNA。使用PrimeScriptTM RT Master Mix (TaKaRa, Japan)将500ng总RNA的片段逆转录为cDNA。实时定量PCR (qRT-PCR)使用7900实时PCR系统(Applied Biosystems)和Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK)进行。相对基因表达量计算公式如下: （VEGF-A）-Ct（ACTB); (CSFP+成骨MSCs/成骨MSCs) -ΔCt(未分化的msc); 。

在动物实验中，取组织标本^nd4^th, 8^th, 12^th植入数周后立即浸入TRIzol®试剂(Life Technologies, USA)。当地的薄层也在0^th周如正常纹层。然后将组织标本压实，直到没有明显的组织残留。使用TRIzol®试剂从扎根组织中提取总RNA。以下步骤与上述步骤相同。相对基因表达量计算公式如下: （测试基因）-Ct（ACTB); (人工薄片)ΔCt(正常的薄层); 。

基因特异性引物用于PECAM-1,VEGF-A,OCG-3,Osterix,ACTB列于表1。

2.9。统计分析

每个实验重复三次。使用Windows版本的SPSS 19.0进行统计分析。使用单因素方差分析(ANOVA)来确认变量之间的比较。显著性为a值小于0.05。代表值< 0.05。

3.结果

3.1。CSFP生物反应器

的VEGF-ACSFP+成骨间充质干细胞组的mRNA表达水平明显高于成骨间充质干细胞组和未分化组。VEGF-A IF染色也显示，CSFP+成骨间充质干细胞组VEGF-A表达较高(图)3.）。

3.2。电话建设

活/死染色表明，几乎所有的成骨间充质干存活植入羟基磷灰石胶原支架我7天后，细胞紧密地附着到支架的小梁结构。该支架具有蓝色自发荧光（图4）。

3.3。显微CT检查

CSFP组人工椎板从骨端两侧逐渐向中间生长，骨缺损相应变窄。的12^th周，硬膜表面人工椎板已实现联合，与原生椎板具有相似的拱形和平滑性，而椎旁肌表面人工椎板未实现联合(图)5(一)-5(d))。

在非csfp组，异位人工椎板从椎旁肌侧向原生椎板侧生长。从2^nd第十二周^th周，人工异位椎板椎旁肌面骨小梁数量逐渐增多，原生椎板侧骨小梁形成较少(图)5(e) -5(h))。

3.4。他染色

在CSFP组中，人工椎板从骨头两端到中间生长。硬脑膜表面的骨生长速率高于椎旁肌肉表面。在8^th周，椎板缺损小于200μm;硬脑膜表面人工椎板的小梁数量高于椎旁肌表面(图)6（B））。的12^th周，硬膜表面片层发育完整，与原生片层具有相似的小梁结构和弯曲;然而，椎旁肌表面的人工椎板仍在成骨过程中(如图)6(c),6(g)6(h))。

在非csfp组，人工异位椎板从椎旁肌侧向原生椎板侧生长。椎旁肌面人工异位椎板的小梁密度和数量均高于原生椎板侧。4 ~ 12周小梁数目增加，但小梁骨排列无组织(图示)6(d) -6(f))。此外，骨形成过程类似于软骨内成骨(图)6(d))。

3.5。血管生成

通过两组的PECAM-1、bFGF蛋白表达水平及的mRNA表达水平来分析两组的血管生成情况PECAM-1和VFGF-A。他们表现出类似的表达趋势。

免疫组化染色显示，CSFP组的PECAM-1表达水平高于2^nd第一周到第8周^th然后从12周减到12周^th而非csfp组的PECAM1表达水平从2开始缓慢升高^nd第十二周^th2周，CSFP组的PECAM1蛋白表达水平明显高于非CSFP组^nd4^th, 8^th周( )(数据7(一)-7(g))。

CSFP组bFGF蛋白表达水平从2开始升高^nd第一周到第8周^th然后从12周减到12周^th周，而非csfp组bFGF表达水平从2开始升高^nd第十二周^th周;2 . CSFP组bFGF表达水平明显高于非CSFP组^nd和图4^th周( ）。(数据8(一)-8(e))。

的mRNA表达趋势PECAM-1和VFGF-A是否符合PECAM-1和bFGF的蛋白表达趋势，以及PECAM-1和VFGF-A该CSFP组中明显高于非CSFP组在2显著更高^nd4^th, 8^th周( )(数据7(h)和8(f))。

另外，CSFP组中，bFGF的硬脑膜表面上的蛋白质表达水平比在椎旁肌表面在8较高^th周(图8(a))。的12^th周，椎旁肌表面未发育好的人工椎板比硬膜表面发育好的人工椎板表现出更高的PECAM-1表达水平(图)7(b),7(e)7(f))。

免疫荧光染色显示，该CSFP组，丰富的组织小血管中的人工椎板在8^th周，和血管变得更发达在12^th的一周。在非csfp组中，在异位人工层中，在原生层侧形成的血管较少^th周，在靠近椎旁面侧的异位人工椎板处形成了许多小血管^th周(图9）。

3.6。骨生成

观察两组成骨标志物BMP-2、成骨体、OCG-3的蛋白或mRNA表达水平，分析两组成骨情况。

免疫组化染色显示，CSFP组BMP-2的表达水平高于2^nd第一周到第8周^th周和周下降在12^th而在非csfp组，其表达水平从2开始缓慢升高^nd第十二周^th2周，CSFP组BMP-2表达水平明显高于非CSFP组^nd4^th, 8^th周( )(数据10(一)-10(f)和10(我))。

的mRNA表达Osterix从2增加^nd第十二周^th周，和mRNA的表达水平Osterix该CSFP组中明显高于非CSFP组在2显著更高^nd4^th, 8^th周( )(图10(j))。的mRNA表达水平OCG-3CSFP组从2增加^nd第十二周^th两组的周数;的mRNA表达水平OCG-3该CSFP组中明显高于非CSFP组在8显著更高^th和12^th周( )(图10(k))。

此外，在CSFP组中，硬膜表面BMP-2蛋白表达水平高于8组椎旁肌表面^th周(图10（B））。的12^th周，在椎旁肌表面不发达人工薄层表明BMP-2的比硬脑膜表面上的发达人工薄片更高的表达水平（图10(c),10(g)10(h))。

4.讨论

MSCs是血管组织工程中最有前途的干细胞类型之一，既能提供种子细胞，又能为血管形成提供有利的细胞因子[6]。首先，间充质干细胞可分化为多种血管细胞表型，包括内皮细胞和平滑肌细胞。其次，间充质干细胞还能分泌多种血管生成细胞因子，如VEGF、MCP-1、IL-6、外泌体等，促进内皮细胞的增殖和迁移。的在活的有机体内骨髓间充质干细胞的微环境不仅包含生化因子，还发挥生物力学作用，影响其血管生成能力[7]。在本研究中，我们研究了CSFP，一种特殊的脉动力，在成骨间质干细胞和羟基磷灰石-胶原支架制作的组织工程薄片的血管生成能力中的作用。

剪应力或循环应变对不同类型间充质干细胞的影响已有研究。例如，许多物种的骨髓间充质干细胞在生理剪切应力或循环应变条件下受到刺激后可分化为内皮样细胞[16- - - - - -18]。剪切应力可诱导MSCs释放VEGF-A，HGF，bFGF和IGF-1 [19]。此外，剪应力还可诱导间充质干细胞释放外泌体，外泌体可通过转移遗传物质和血管生成分子，成为血管生成的重要介质[7]。在这项研究中，我们使用了CSFP生物反应器来模拟兔CSFP，刺激成骨的MSCs，发现该CSFP可以促进成骨MSC的血管生成因子的表达。动物研究还发现，CSFP组表达多种血管生成因子比非CSFP组;另外，CSFP基，硬脑膜表面新生儿薄片也在8表示多种血管生成因子比椎旁肌表面（靠近CSFP的机械刺激）在^th的一周。这些结果表明，CSFP应激可促进间充质干细胞的血管生成活性和新生薄片的血管生成。

已有研究表明，CSFP可以促进新生椎板的成骨[4]。在本研究中，我们还检测了几种成骨标志物，与非CSFP组相比，CSFP组也显示了更高的BMP-2、成体和OCG-3表达。硬膜表面的椎板联合更接近CSFP的机械刺激，先于椎旁肌表面。因此，我们再次明确，CSFP应激可以促进骨形成，但其作用是直接的还是由于更好的血管形成尚不清楚。血管和骨的形成并不是孤立的过程，它们是由一种特殊的血管亚型(H型血管)紧密连接的，该亚型高表达CD31 (PECAM-1)和Emcn [20.]。H型内皮细胞可通过Notch信号通路调控血管生成和成骨[21]。血管生成与成骨的关系有待进一步研究。在本研究中，我们还发现BMP-2的蛋白表达水平下降^th而成体和OCG-3的mRNA表达水平仍然升高。的12^th周，硬膜表面人工层实现联合，BMP-2在该区域无表达;BMP-2主要表达于椎旁肌表面，仍在骨形成过程中;因此，与8相比，BMP-2表达水平下降^th的一周。蛋白表达和mRNA表达的差异也很常见[22]。此外，从12个^th本周，人工椎板开始重塑过程，和骨吸收远远超过骨形成[3.]。这些可能对BMP-2的表达水平的CSFP组下降解释。

由于生物材料的不同，本研究存在一定的局限性在活的有机体内和体外研究。在以往的研究中[3.,4]，我们已经成功地使用微孔羟基磷灰石胶原支架我来重建人工椎板，让我们继续用它作在活的有机体内研究。然而，生物反应器的研究需要使用具有弹性模量的膜生物材料，它可以响应模拟的CSFP应力。此外，为了保证CSFP对细胞的胁迫的一致性，MSCs必须以单层附着在细胞膜表面。微孔羟基磷灰石- I型胶原支架不满足这些要求，所以我们选择了具有弹性模量的PLGA膜作为支架体外研究。

5.结论

综上所述，CSFP应激可促进成骨间充质干细胞的血管生成能力，从而促进组织工程薄片的血管生成和成骨。CSFP生物反应器预处理成骨间充质干细胞可能对组织工程技术的椎板重建具有重要意义。

数据可用性

在当前研究中使用的数据集可从通讯作者在合理的要求。

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

这项研究是由中国国家自然科学基金（81672179）的支持。

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