我们在这项研究中使用的msc是孤立的兔子脐带沃顿商学院的果冻。隔离、文化和成骨分化msc是前一篇文章中描述的 3]。14天后文化在成骨的介质(含10 nM地塞米松,10毫米 β抗坏血酸甘油磷酸酯钠,50毫克/毫升、10 nM 1, 25-dihydroxy维生素D3, Sigma-Aldrich,美国),成骨的WJ-MSCs被用于以下实验。

在无菌条件下,PLGA支架(诺琦,重庆,中国)削减的规模 40 毫米 × 15 毫米 × 0.1 毫米 。成骨的msc使胰蛋白酶化和resuspended媒体的浓度 1 × 10 6 /毫升。然后,100年 μl细胞悬液是用移液器吸取每个支架的一侧,在培养皿中培养孵化器在37°C下5%的股份有限公司₂的气氛。2小时后,成骨的介质是补充说,所有结构都是放置在成骨的媒介被固定在生物反应器前8小时。

的设置条件CSFP生物反应器是如下:流速,6厘米/秒;频率,3赫兹。CSFP +成骨的MSC的集团结构被夹固定在脉动管CSFP生物反应器。成骨的MSC的集团结构被夹固定在控制管CSFP生物反应器。我们使用未分化的msc播种在PLGA支架的对照组中存在的分析。24小时后,构造被VEGF-A的存在分析和免疫荧光试验(图 2)。

协议是由动物实验的伦理委员会批准的复旦大学(排名20150482 a168)。我脚手架的hydroxyapatite-collagen是买的北京allgen医疗科技有限公司有限公司在无菌条件下,hydroxyapatite-collagen我支架的大小 10 毫米 × 8 毫米 × 1 毫米 。2周后成骨的媒介文化的osteo-differentiated msc使胰蛋白酶化和resuspended媒体的浓度 1 × 10 6 /毫升。然后,100年 μl细胞悬液是用移液器吸取每个支架的一侧,30分钟后,100年 μl细胞悬液是用移液器吸取在另一边。所有结构都是放置在植入前成骨的中了一个星期。

为了观察支架上的细胞活性,支架的成骨的msc沾住/死亡(美国热费希尔)和原子核与DAPI复染色(美国南部生物技术)。和结构共焦显微镜下观察(蔡司)。

48个2个月大的雄性兔子重 2.25 ± 0.25 公斤被随机分为CSFP集团( n = 24 )和Non-CSFP集团( n = 24 )。动物与戊巴比妥钠麻醉(1毫升/公斤腹腔内)。兔模型的外科手术在下面描述。

兔子CSFP组,我们位于第五腰椎棘突的脊椎动物解剖学标志和纵向3厘米的皮肤切口。浅筋膜和肌肉paraspinal收回公开棘突,当时公开本机薄片中删除。最后,骨头缺陷测量 10 毫米 × 8 毫米 被咬骨钳上创建本地薄片暴露硬脑膜。删除本地薄片左两个肉松质骨测量结束 10 毫米 × 2 毫米 。电话是固定在骨缺损(图 1 (b))。

兔子Non-CSFP组,我们删除了paraspinal肌肉的剥离器暴露棘突和薄片,然后删除了棘突咬骨钳。通过移除棘突,松质骨测量结束 10 毫米 × 4 毫米 ,类似于CSFP集团( 10 毫米 × 2 毫米 × 2 ),同时保留硬脑膜表面皮层薄层。电话是固定在叶片缺陷(图 1 (c))。

MSC-PLGA构造、构造和3%多聚甲醛固定在PBS 10分钟。非特异性结合当时降低孵化细胞5% BSA(美国Gibco) 30分钟。VEGF-A然后贴上其特定的初级抗体(Abcam;猫。不。ab1316;5 μg / ml) 12小时在4°C。细胞被洗PBS和孵化与兔子anti-mouse辣根peroxidase-conjugated二级抗体(美国杰克逊ImmunoResearch实验室有限公司;稀释,1:100)为1小时和DAPI Fluoromount G(美国南部生物技术)5分钟。每个样本然后使用荧光倒置显微镜成像系统(德国徕卡)和双重作用。

组织标本中收获2^nd4^th,8^th,12^th周后植入,立即就被固定在刚做好的4% ( w / v 多聚甲醛。的骨标本使用微ct检查在上海公共卫生临床中心。3 d模型重建手动使用GEHC MieroView2.0 + ABA的软件。所有样本的阈值设定在1000年,除了Non-CSFP组的样品2^nd周( 阈值 = 500年 )。

微ct检查后,组织标本用10%乙二胺四乙酸脱钙4周。组织部分与6 μ米厚度减少切片机和挂载玻片上。部分加工常规组织学分析均由hematoxylin-eosin(他)染色和免疫组织化学染色(包含IHC)。

烘烤2 h后60°C,部分与二甲苯脱蜡,然后患者通过一系列的分级乙醇蒸馏水。内源性过氧化物酶活性被0.3%的过氧化氢为30分钟37°C。抗原检索,部分被淹没在柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)10分钟,然后孵化与正常山羊血清为30分钟37°C减少非特异性结合。鼠标anti-PECAM1(表达载体;猫。不。ma5 - 13188), anti-bFGF (Abbiotec猫。不。250559)和anti-BMP2 (Abcam猫。不。 ab6285) were applied at the dilution of 1 : 50 overnight at 4°C and followed by incubation with horseradish peroxidase- (HRP-) conjugated secondary antibodies (Changdao, China). After rinsing, staining was performed with DAB and counterstained with hematoxylin to display the nucleus. Each slide was imaged using the inversion microscope system (Leica, Germany). The images were analyzed by the software of Image J.

免疫荧光分析,处理上面的幻灯片是一样的。PECAM1然后贴上其特定的初级抗体(Servicebio;猫。不。GB13063;稀释,1:50)12小时在4°C。然后,部分是用PBS和孵化驴anti-rabbit辣根peroxidase-conjugated二级抗体(Servicebio;猫。不。GB21404; dilution, 1 : 300) for 1 hour and DAPI (Servicebio; cat. no. G1012) for 10 min. The slides were sealed with antifluorescence quenching sealant. Each slide was imaged using a fluorescence inversion microscope system (Leica, Germany) with dual excitations.

MSC-PLGA构造,总RNA提取使用试剂盒从构造®试剂(生活技术,美国)。所有RNA样本然后对待RNase-free DNase我(试剂盒,瓦伦西亚,CA)消化基因组DNA。整除500 ng总RNA的反向转录cDNA使用PrimeScriptTM RT大师混合(豆类、日本)。定量实时PCR(存在)是使用一个7900执行实时PCR系统(应用生物系统公司)电力SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)。相对基因表达计算使用以下方程: Δ Ct = Ct (VEGF-A) - ct ( ACTB); Δ Δ Ct = Δ Ct (CSFP +成骨的msc /成骨的msc) ΔCt(未分化的msc); 褶皱 改变 = 2 − Δ Δ Ct 。

在动物研究中,组织标本中收获2^nd4^th,8^th,12^th周后植入并立即沉浸在试剂盒®试剂(生活技术,美国)。本机薄片也收获在0^th随着正常的薄层。组织标本被停飞,直到没有明显的组织残留。建立组织的总RNA提取使用试剂盒®试剂。下面的程序是相同的如上所述。相对基因表达计算使用以下方程: Δ Ct = Ct (测试基因)- ct ( ACTB); Δ Δ Ct = Δ Ct (人工薄片) ΔCt(正常的薄层); 褶皱 改变 = 2 − Δ Δ Ct 。

gene-specific引物用于 PECAM-1, VEGF-A, OCG-3, Osterix, ACTB表中列出 1。

每个实验重复三次。统计分析使用SPSS 19.0版Windows。单向方差分析(方差分析)是用来证实比较的变量。被认定为重大意义 p 值小于0.05。 ∗ 代表 p 值< 0.05。

的 VEGF-A信使rna表达水平CSFP +成骨的MSC组显著高于成骨的MSC组和未分化组。如果染色VEGF-A也表明CSFP +成骨的MSC组有更高的VEGF-A表达式(图 3)。

生活/死染色显示,几乎所有的成骨的msc移植后存活7天hydroxyapatite-collagen我支架,细胞严格坚持的骨小梁结构支架。支架有蓝色的自体荧光(图 4)。

CSFP组,人工薄层逐渐增加骨结束双方的中间,和骨缺损也相应缩小。的12^th星期,人工硬脑膜的表面薄层意识到联合,与类似的拱门和平滑度与本机薄片,而人工paraspinal肌肉表面的薄层没有意识到联合(数字 5(一)- 5(d))。

Non-CSFP组异位人工薄片从paraspinal肌肉对本机薄片。从2^nd12周的^th周,骨骨小梁paraspinal肌肉表面的人工异位薄层逐渐增加,而几乎没有骨小梁形成原生薄层一侧(数字 5(e) - 5(h))。

CSFP组,人工薄片从双方的骨头中间。骨头硬铝表面的增长率高于paraspinal肌肉表面。在8^th星期,叶片缺陷不到200 μm;骨小梁数量的人工硬脑膜的表面薄层高于paraspinal肌肉表面(图 6(b))。的12^th一周,硬铝表面上的薄层完全开发,显示相似的骨小梁结构和曲率本机薄片;然而,人工paraspinal肌肉表面的薄层仍处于骨(数字 6(c), 6(g) 6(h))。

Non-CSFP组,人工异位薄层从paraspinal肌肉对本机薄片。骨小梁密度和数量的人工异位paraspinal肌肉表面的薄层是高于本地薄片。从4周、12周,骨小梁数量的增加,但骨小梁的排列总是混乱(数字 6(d) - 6(f))。此外,骨生成过程类似于软骨内骨化(图 6(d))。

分析了两组的血管生成的蛋白表达水平PECAM-1 bFGF和mRNA的表达水平 PECAM-1和 VFGF-A。他们表现出类似的表达趋势。

包含IHC染色显示PECAM-1 CSFP组的表达水平增加了2^nd星期8^th然后从12个减少^th上周,尽管PECAM1 Non-CSFP组的表达水平从2增加缓慢^nd12周的^th,PECAM1 CSFP组的蛋白表达水平明显高于Non-CSFP组在2^nd4^th,8^th周( p < 0.05 )(数据 7(一)- 7(g))。

CSFP组bFGF蛋白表达水平增加的2^nd星期8^th然后从12个减少^th上周,虽然Non-CSFP组bFGF的表达水平增加的2^nd12周的^th周;CSFP组bFGF的表达水平明显高于那些Non-CSFP组2^nd和图4^th周( p < 0.05 )。(数据 8(一)- 8(e))。

的mRNA表达趋势 PECAM-1和 VFGF-A符合的蛋白表达趋势PECAM-1和bFGF和信使rna表达水平的 PECAM-1和 VFGF-ACSFP组明显高于Non-CSFP组在2^nd4^th,8^th周( p < 0.05 )(数据 7(h)和 8(f))。

此外,CSFP组bFGF蛋白表达水平高于硬铝表面paraspinal肌肉表面的8^th周(图 8(a))。的12^th上周,未开发的人工paraspinal肌肉表面的薄层显示的PECAM-1表达水平高于发达人工硬脑膜的表面薄层(数据 7(b), 7(e) 7(f))。

免疫荧光染色显示,CSFP集团丰富的组织小型船舶在人工薄片8^th周,血管变得更发达的12^th的一周。Non-CSFP集团几个本地附近的血管形成薄层在异位人工薄片8^th一周,许多小型船舶paraspinal表面附近形成异位人工薄片12^th周(图 9)。

分析了两组的骨成骨的标记的蛋白质或信使rna表达水平BMP-2, Osterix, OCG-3。

包含IHC染色显示BMP-2 CSFP组的表达水平增加了2^nd星期8^th在12周和减少^th一周,而其表达水平Non-CSFP组从2增加缓慢^nd12周的^th周,BMP-2 CSFP组的表达水平明显高于那些Non-CSFP组2^nd4^th,8^th周( p < 0.05 )(数据 10(一)- 10(f)和 10(我))。

mRNA的表达 Osterix从2增加^nd12周的^th星期,mRNA的表达水平 OsterixCSFP组明显高于Non-CSFP组在2^nd4^th,8^th周( p < 0.05 )(图 10(j))。信使rna表达水平 OCG-3CSFP组增加的2^nd12周的^th周两组;信使rna表达水平 OCG-3CSFP组明显高于Non-CSFP组的8^th和12^th周( p < 0.05 )(图 10(k))。

此外,在CSFP集团的蛋白质表达水平BMP-2硬铝表面上高于paraspinal肌肉表面8^th周(图 10(b))。的12^th上周,未开发的人工paraspinal肌肉表面的薄层显示的BMP-2表达水平高于发达人工硬脑膜的表面薄层(数据 10(c), 10(g) 10(h))。