RSP5正调节间充质的成骨分化通过激活的Akt的K63连接的泛素化干细胞

抽象

间充质干细胞（MSCs）是具有很强的成骨细胞分化的能力的多能干细胞。然而，分子机制MSC的成骨分化基础仍然很大程度上是未知的，因而阻碍了对骨修复在诊所基于MSC的细胞疗法的进一步发展。RSP5，也称为NEDD4L（NEDD4样E3泛素蛋白连接酶），属于HECT（同源的E6-AP羧基末端）E3连接酶家族结构域的。然而，尽管许多研究已进行了阐明RSP5的各种生物过程中的作用，其对成骨作用仍然难以捉摸。在这项研究中，我们表明，RSP5的表达MSC的成骨过程中升高和正通过诱导K63连接的多泛素化和Akt途径的活化调节的MSC的成骨能力。总之，我们的研究结果表明，RSP5可以是通过使用骨再生和修复的MSCs，以提高治疗效率的承诺目标。

1.介绍

间充质干细胞（MSCs）是具有很强的成骨细胞分化的能力的多能干细胞[1,2]。由于其在成骨分化的强大潜力，间充质干被认为是组织工程技术用于骨的再生与修复[最有前途的细胞类型1,2]。然而，调节MSCs的成骨分化在很大程度上仍然未知，因此分子机制阻碍了骨修复在临床上基于MSC的细胞疗法的进一步发展。因此，对于用在治疗性应用中MSC的，需要的成骨分化的基础的机制的进一步探索。

RSP5，也称为NEDD4L（NEDD4样E3泛素蛋白连接酶），属于HECT（同源的E6-AP羧基末端）E3连接酶家族结构域的[3.,4]。以前的研究已经表明，含有HECT域家族在骨的形成中起重要作用。例如，Smurf1 / 2负MSC的成骨分化通过降解的Smad1和Runx2的，而NEDDL4正通过激活pSmad2和磷酸化ERK1 / 2途径[调节MSC的成骨调节5- - - - - -8]。然而，尽管许多研究已经阐明了RSP5在各种生物过程中的作用，但其对骨形成的影响仍不明确[9,10]。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt的参与了生物功能的许多方面，如细胞增殖，代谢，细胞周期，和转移[11]。多项研究证实，Akt信号通路在成骨重要的作用[12,13]。Akt的活化是通过Akt磷酸化的Thr308处和Ser473上[调节11]。然而，最近的研究主要集中在Akt磷酸化表明，泛素化和Akt的去泛素化也通断开关的Akt活性[11]。例如，坏死因子受体相关因子6（TRAF6）和Skp2的-SKP-滞-F含有料箱（SCF）调节Akt活化作为E3通过Lys63（K63）在胰岛素样生长Akt的多泛素化 - 连接的连接酶因子1（IGF-1）和ErbB受体信号传导，分别[11,14]。虽然成骨过程中多研究探索Akt磷酸化和激活，Lys63（K63）成骨过程中Akt的 - 连接多泛素化的具体机制仍知之甚少。

在这项研究中，我们专注于探索对MSCs的成骨潜能RSP5的效果，并进一步明确了具体机制。我们的目的是确定是否可以RSP5细胞命运的关卡作用为调节MSCs的成骨分化。

2。材料和方法

2.1。道德声明

本研究符合《赫尔辛基宣言》，经广东省人民医院伦理委员会批准。研究招募了9名年龄在20到30岁之间的健康捐赠者。在研究之前，所有健康的供体被告知所有手术的临床要求和可能的风险，并签署了知情同意书。

2.2。细胞分离与扩增

骨髓愿望是由熟练的医生进行。骨髓样品中的MSC使用密度梯度离心法立即隔离。Briefly, the bone marrow samples were transferred to low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco) containing 10% fetal calf serum (FBS, Gibco) to a total volume of 10 ml and then added to 10 ml Percoll (Pharmacia Biotech) at a density of 1.073 g/ml. The mononuclear cells were isolated by gradient centrifugation at 900 g for 30 min. The isolated mononuclear cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and then seeded in a culture flask with low-glucose DMEM supplemented with 10% FBS. The cells were cultured at 37°C and 5% CO₂，每2天更换一次培养基。培养至90%融合时传代MSCs。实验使用传代2的MSCs。

2.3。表面标志识别

MSCs were digested using 0.25% trypsin containing 0.53 mM EDTA, and the reaction was terminated with FBS. After the MSCs were washed by PBS three times, they were incubated with antibodies against CD14, CD29, CD44, CD45, CD105, and HLA-DR (Miltenyi Biotec) for 30 min according to the protocols. MSCs were washed with PBS three times, and the positive rate of the surface markers was detected by a BD Influx cell sorter (BD Biosciences).

2.4。三谱系分化潜能分析

培养诱导间充质干细胞进行三联分化:成骨分化、软骨分化、脂肪分化。成骨分化时，将MSCs接种于12孔板，密度为 细胞/平方厘米²在含DMEM的成骨分化培养基中，加入10%胎牛血清，100 IU/ml青霉素，100 IU/ml链霉素，0.1μ10 M地塞米松,mMβ- 甘油磷酸盐，和50 μ中号抗坏血酸（Sigma）中。将培养基每三天更换，和成骨分化潜能通过茜素确定红S（ARS）和碱性磷酸酶（ALP）染色和定量。对于脂肪形成分化，如上所述，在含有含10％FBS，1脂肪形成分化培养基中培养接种的MSC μ10 M地塞米松,μg/ml胰岛素(西格玛)，0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(西格玛)，0.2 mM吲哚美辛(西格玛)。诱导3天后，每3天更换培养基，油红O染色测定其脂肪分化潜能。chondrogenic分化, MSCs were centrifuged at 600 g for 5 min in 15 ml polypropylene conical tubes to form pellets as previously described [15]。微球在含100iu /ml青霉素、100iu /ml链霉素、1%伊红预混剂(康宁)、50m抗坏血酸(西格玛)、1mm丙酮酸钠(西格玛)、0.1 M地塞米松、10ng /ml转化生长因子-的成软骨分化培养基中培养β3 (R&D)。这种培养基每三天更换一次。球团经阿利新蓝染色，以确定软骨分化潜能。

2.5。细胞增殖分析

MSCs的增殖速率根据制造商的方案通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Dojindo公司）测定来确定。介质缺乏的MSC被用作阴性对照。

2.6。ARS试验

ARS染色固定MSCs, 1% ARS染色10 min。PBS洗涤细胞3次。染色细胞的图像在显微镜下拍摄。将细胞与10%氯化十六烷基吡啶(CPC, Sigma-Aldrich)共培养30分钟，轻轻摇匀，进行ARS定量。用微平板阅读器(Thermo Fisher)在562 nm处测定提取的上清液的吸光度。

2.7。ALP测定

对于ALP活性，在间充质干RIPA裂解缓冲液（赛默飞世）含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（Roche）的裂解。The lysate was centrifuged at 12,000 rpm at 4°C for 30 min. The supernatant was extracted, and the ALP activity in the protein supernatant was detected using ALP activity kits (Nanjing Jiancheng Biotech) according to the manufacturer’s protocol. For ALP staining, MSCs were fixed in a citrate-acetone-formaldehyde fixative and then treated with an alkaline dye (Sigma-Aldrich) for 15 min in the dark. Images of stained cells were taken under a microscope.

2.8。油红O染色

4%多聚甲醛固定MSCs 15 min。PBS洗涤3次后，油红O工作液染色15 min。将染色的细胞的图像是在显微镜下拍摄的。

2.9。阿辛蓝染色

将细胞沉淀用4％多聚甲醛，然后包埋在石蜡中，以片段。The sections were stained using Alcian blue solution for 30 min and washed with PBS three times. Images of the stained cells were taken under a microscope.

2.10。西方墨点法

上述[如所述萃取MSC的总蛋白16]。使用BCA检测试剂盒(Sigma-Aldrich)检测上清液中的蛋白浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后转移到聚偏氟乙烯膜(微孔)上。将膜与GAPDH、RSP5、Smad1、磷酸化的Smad1/5/9、总连环蛋白、非磷酸化的连环蛋白、Akt和磷酸化的Akt (1: 1000, Abcam)的初级抗体孵育过夜。用TBST缓冲液冲洗后，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1:30 00,Abcam)孵育1 h。利用固定器在HRP底物(微孔)上进行特异性抗体-抗原复合物的检测。

2.11。敲低和过表达慢病毒感染

对于敲除慢病毒构建，我们设计了4个RSP5的siRNA，并选择了最有效的siRNA来构建敲除慢病毒。RSP5的序列为5 -ACGTCTCGCATTTGAGCAGGG-3 ,和阴性对照的序列是5 -TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3 。对于过表达慢病毒，构建RSP5的完整核苷酸序列。由吉玛公司公司产生了两个击倒和过表达慢病毒。慢病毒（10⁹你/毫升)5μ将g/ml的聚戊二烯与MSCs孵育24小时，MOI为50。在成骨分化第14天进行相关实验。

2.12。定量实时PCR

MSC的总RNA，使用RNA-快速纯化试剂盒（一山Biotech公司）按照协议萃取。所提取的RNA使用PrimeScript RT™试剂盒（TAKARA）合成为cDNA。定量实时PCR使用SYBR®预混实施例的Taq试剂盒™（TaKaRa公司）一个的LightCycler？480 PCR系统（Roche）的执行。使用2每个基因的相对表达水平进行分析^{- Ct}方法并归一化为β肌动蛋白的表达。每个基因的正向和反向引物序列如下(表)1)。

2.13。Akt通路阻塞

AZD5363（塞莱克）以5的浓度加入 μM as间充质干细胞成骨分化。诱导第10天进行相关实验。

2.14。免疫共沉淀分析

按上述方法提取间充质干细胞蛋白[17]。蛋白质上清液与抗RSP5，AKT，或在4℃过夜的IgG（Abcam公司）对照抗体温育。The protein-G agarose beads were then added to the mixture and incubated at 4°C for 3 h. The beads were collected and washed five times, followed by resuspension, and boiling in buffer containing 50 mM Tris, 2% sodium dodecyl sulfonate (SDS), 10% glycerol, 10 mM dithiothreitol (DTT), and 0.2% bromophenol blue. All the samples were detected using western blotting assays as described above [17]。

2.15。质粒构建和转染

pcDNA3.1(+)-HA-UB、pcDNA3.1(+)-HA-K63-UB、pcDNA3.1(+)-HA-K48-UB、pcDNA3.1(+)-Myc-RSP5、pcDNA3.1(+)-Flag-Akt均购自Obio Technology Corp, Ltd。质粒转染时，将293个T细胞接种于6孔板。总共2个μ克/孔的每个具有5质粒 μl (Lipo3000)和5μl of P3000 were added and incubated with 293 T cells for 2 days. The proteins of the 293 T cells were extracted after treatment with 10 μM环己酰亚胺，然后，IP和western blotting测定如上所述。对Flag-Tag、Myc-Tag、HA-Tag的初级抗体均来自Abcam。

2.16。统计分析

所有数据都表示为 （SD）。采用SPSS (SPSS, Inc.)进行统计学分析，采用Bonferroni检验和Pearson相关检验进行单因素方差分析。小于0.05为差异有统计学意义。所有的结果都是基于包含三份重复样品的三个独立实验确定的。

3.结果

3.1。间充质干细胞的表型和三系分化能力

为了识别MSC和确定它们的纯度，我们发现通过流式细胞术的细胞表型。结果表明，所述的MSC阳性CD29，CD44，和CD105但阴性CD14，CD45，和HLA-DR，这与在以前的报告中所观察到的表型的典型一致（图1(一)）18]。此外，间充质干细胞呈纺锤形和成纤维细胞样。这些细胞可在特定的诱导培养基中诱导成骨分化、软骨分化和脂肪分化(图)1 (b))。这些结果表明，满足的MSC细胞疗法国际协会的识别准则和很高纯度的[18]。

3.2。成骨分化过程中MSCs中RSP5的表达

为了检测MSC成骨分化过程中RSP5的表达，我们首先诱导MSC成骨分化，并通过不同时间点的ARS和ALP测定其成骨分化能力。如图所示2(一个)通过ARS染色钙结节的数量从第0天增加至感应14。ARS逐渐染色定量上涨诱导后，显示出的MSCs进行成骨分化。的ALP测定显示一致的结果（图图2（b）)。此外，RSP5的表达随着骨髓间充质干细胞的成骨分化而增加(见图)图2（c）)。此外，不同的MSC的RSP5表达水平呈正相关的成骨分化能力，如通过ARS和ALP测定法测定，表明（图中的MSC RSP5表达和成骨分化之间的密切关系图2（d）和图2（e）)。

3.3。抑制RSP5的表达降低了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力

为了阐明RSP5在msc成骨分化中的作用，我们构建了针对RSP5 (Lv-RSP5)的shRNA编码的慢病毒，并在诱导成骨14天后进行了以下实验，探索RSP5在成骨分化中的作用。western blotting结果证实了其抑制作用(见图)图3（a）)。在成骨诱导过程中，敲除RSP5并不影响MSCs的生长曲线(补充图)1A)。RSP5表达的抑制后，不仅ARS染色和定量而且ALP活性和MSC的染色均减少相比，这些感应组和对照慢病毒组无论是在显著（图图3（b）和图3（c）)。RUNX2,OCN,OPN是骨髓间充质干细胞成骨的重要标志[1]。在基因水平上，Lv-RSP5组所有标记物的表达水平也均下降(图)3（d）)。此外，这些标记物在蛋白水平上的表达结果与western blotting的结果一致(见图)3 (e))。这些结果表明，RSP5促进MSC的成骨分化的能力，并且降低RSP5表达抑制成骨MSC。

3.4。RSP5表达加速MSC成骨分化

为了进一步证实RSP5对MSC的成骨分化的影响，我们再构造的另一种慢病毒过表达RSP5（OE-RSP5）。用OE-RSP5转染后，MSC的RSP5表达比对照组的几乎2.5倍高（图图4（a）)。过表达RSP5不影响成骨诱导期间MSC的（生长曲线补充图1A)。此外，与诱导和控制慢病毒组相比，ee - rsp5组的ARS和ALP染色和定量要高得多(见图)4 (b)和4 (c))。此外,RUNX2,OCN,OPN转染OE-RSP5的MSCs在基因和蛋白水平上表达均显著增加(见图)4 (d)和4 (e))。这些结果证实，RSP5加速MSC的成骨分化能力。

3.5。RSP5通过Akt信号通路介导的MSCs的成骨分化

然后，我们检测到的Akt蛋白，连环蛋白的活化水平，和Smad信号通路，已被报道与MSCs的成骨。虽然的Smad1的磷酸化水平/ 5/9或非磷酸化连环蛋白的水平保持在与吕RSP5或OE-RSP5，Akt信号传导途径的磷酸化水平的吕RSP5组中显著减少，但增加了转染的MSCs不变在OE-RSP5组（图5(一个)），表明可以RSP5正调控Akt信号传导途径的活化。AZD5363是Akt信号传导途径的是成骨诱导条件下降低MSC的生长曲线（补充图的抑制剂1B)。此外，AZD5363基本上减少ARS和ALP染色和定量与OE-RSP5转染的MSC（图5 (b)和5 (c))。成骨标记物的表达，其中包括RUNX2,OCN,OPN在OE-RSP5基团的间充质干也降低到正常水平治疗后AZD5363（图图5（d）)。这些结果证实，RSP5促进MSC成骨分化通过Akt信号通路，阻断Akt信号传导途径可以抑制RSP5这些影响。

3.6。RSP5诱导k63连接的Akt泛素化

以前的研究已经表明，Akt的K63连接的泛素化起着Akt信号通路的磷酸化和活化中起重要作用。我们首先探讨RSP5和Akt是否互相影响。倒数共同IP /蛋白质印迹测定法表明，内源性RSP5和Akt彼此MSC中相互作用（图图6（a）)。然后，我们共表达HA-泛素的Myc-RSP5，和标志化Akt在MSC和发现的Myc-RSP5显著诱导标志-Akt的泛素化（图图6（b）)。此外，RSP5介导的Akt代替K48连接的遍在蛋白化的K63连接的遍在蛋白化（图图6（c）和图6（d）)。综上所述，这些数据表明RSP5可能通过诱导k63连接的Akt泛素化而促进Akt信号通路的磷酸化和激活。

4.讨论

在本研究中，我们证明了RSP5在msc成骨分化过程中表达升高，并且RSP5通过E3泛素连接酶介导k63连接的泛素化和Akt的激活而对这一过程进行了正向调控。这些结果提示RSP5可能是利用MSCs进行骨再生和修复以提高治疗效率的一个有希望的靶点。

MSC是多能间充质祖细胞，可以作为各种细胞，包括成骨细胞，软骨细胞的分化长期前体，以及脂肪细胞[19]。特别是，MSC的成骨分化已广泛，因为在多种生理和病理过程[其至关重要的作用研究20,21]。例如，唐Y等。证明来自患者的全身性红斑狼疮（SLE）的MSC表现出成骨减少容量和在这些患者[的骨质疏松症中起重要作用20]。刘X等。证明了在患者后纵韧带（OPLL）的骨化的MSC具有朝向骨生成的高倾向和MSCs的成骨分化的抑制是有效的在这种条件下处理骨赘形成[21]。此外，msc被认为是组织工程技术中最有希望用于骨再生和修复的细胞类型[22]。因此，研究MSC的成骨分化的调节机制是寻找新的目标有帮助，并在临床应用价值。

RSP5，也称为NEDD4L，属于HECT结构域的E3连接酶家族[9]。多项研究已经证实，RSP5的表达在多种组织器官的发育及生理过程中发挥重要作用[10,23,24]。例如，Manunta P等。证明RSP5相互作用与α-内收蛋白来控制血压[23]，和Kaminska J等。表明RSP5影响的肌动蛋白骨架中体内和体外形态[24]。近日，HECT结构域的E3连接酶家族，包括NEDD4，Smurf1和SMURF2的成员，已被证明可以调节MSC成骨过程。NEDD4 MSCs的成骨分化负性调节，而这个功能是一个叫做SNHG1 [长非编码RNA的控制下25]。此外，抑制smurf1表达加速MSC的成骨分化，并促进骨再生[26]。此外，SMURF2参与由介导的MSCs的成骨分化NF-κ信号传导途径[27]。然而，RSP5是否在成骨过程中起作用还未见报道。在本研究中，我们证实了RSP5在诱导MSCs成骨过程中表达升高，并且通过调控TRAF4的表达显著改变了MSCs的成骨能力。这些结果表明，RSP5和其家族中的其他成员一样，可能是通过调节MSCs的成骨过程来调节骨骼发育的潜在靶点。

为了进一步探索RSP5调控MSCs成骨过程的机制，我们首先评估了敲除或过度表达RSP5后几个典型信号通路的激活情况。我们证明，在调控RSP5表达后，Smad1/5/9的激活水平和catenin信号通路保持相对稳定。然而，敲除RSP5显著降低了Akt信号通路的磷酸化和激活，而过表达RSP5则明显增加了Akt信号通路的磷酸化和激活。过度表达RSP5可通过抑制Akt信号通路的激活而阻断其促骨形成作用。综上所述，这些结果表明RSP5通过激活Akt信号通路促进MSCs成骨。近几十年来，许多研究证实Akt信号通路促进成骨[7,13]。对Akt，T308在激活结构域，或T环两个关键的残基的磷酸化，在C端疏水基序中的催化蛋白激酶芯和S473的，需要用于激酶的最大活化[11]。此外，Akt在多个不同的Lys残基上泛素化[11]。不同的泛素连接酶是情侣K63连接的泛素于Akt起到调节Akt激活。例如，各种生长因子的TRAF6的引导学生激活和Skp2的E3连接酶在pH值的Akt域目标的Lys残基，而这些修改增强膜定位，从而活化28,29]。然而，大多数研究只关注Akt在成骨过程中的磷酸化，很少有研究探讨k63连接的Akt泛素化在msc成骨分化过程中的作用。如前所述，在大多数生理和病理条件下，RSP5作为E3连接酶发挥作用[9,三十,31]。例如，Belgareh N证明RSP5泛素化ERMES元件可以控制mitophagy [10]。在我们的研究中，我们证明了RSP5和Akt的相互作用与对方，这RSP5显著诱导的Akt的K63连接的泛素激活Akt信号通路。据我们所知，这可能是第一个研究的MSCs的成骨分化过程中探索的Akt的K63连接的泛素化。因此，我们的研究可能有助于进一步扩大Akt信号通路的网络。

总之，我们的研究不仅扩展了RSP5的骨骼发育知识，但也提供了骨骼的再生和修复的潜在目标。然而，仍然有本研究的一些局限性。首先，骨重塑过程是由成骨细胞以及破骨细胞[控制32,33]。虽然我们已经证实RSP5可以正向调控MSCs的成骨分化过程，但RSP5在破骨细胞发生中的作用还未被探索。第二，虽然我们发现RSP5在体外可以正向调控MSCs的成骨分化，但在体内RSP5在骨发育中的具体作用还有待进一步探索。为了克服上述限制，我们需要在成骨细胞谱系和破骨细胞谱系中使用特定敲除或敲除RSP5的转基因小鼠。因此，构建这些转基因小鼠是我们未来的目标。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的数据都包含在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

昌良，梁国炎，和小青正进行的实验。畅享靓，黄Shuaihao和永雄黄写的手稿的初稿。董银和昌良促成概念理念，研究的实验设计和手稿的编辑。

补充材料

补充图1（A）既不的MSC的降低，也不过度表达ofRSP5影响了这些细胞在成骨培养基中的生长曲线。（B）在AZD5363成骨诱导条件减少MSC的生长曲线。指示 。 3个不同MSC系的独立实验。(补充材料)

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