SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/7073805 7073805 研究文章 RSP5积极调节间充质干细胞的成骨分化激活K63-Linked Akt的泛素化 梁 Changxiang 梁 国研 郑 小青 黄 Yongxiong 黄 Shuaihao https://orcid.org/0000 - 0003 - 4581 - 5011 阴 越南盾 弗里斯 杰斯 脊柱外科学系 广东省人民医院 广州 中国 510080年 gdghospital.org.cn 2020年 6 4 2020年 2020年 05年 01 2020年 08年 03 2020年 18 03 2020年 6 4 2020年 2020年 版权©2020 Changxiang梁等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

间充质干细胞(msc)多功能干细胞有很强的成骨分化能力。然而,成骨分化的分子机制msc在很大程度上仍是个未知数,从而阻碍了进一步发展MSC-based骨修复的细胞治疗诊所。RSP5,也叫做NEDD4L (NEDD4-like E3泛素蛋白连接酶),属于HECT(同源E6-AP羧基末端)domain-containing E3连接酶家族。然而,尽管许多研究已经进行了阐明RSP5在各种生物过程的作用,它对骨的影响仍然是难以捉摸的。在这项研究中,我们表明,RSP5的表达升高在msc的骨的成骨的能力和积极监管msc诱导K63-linked polyubiquitination和Akt通路的激活。综上所述,我们的研究表明,RSP5可能是一个有前途的目标来提高治疗效率利用msc对骨再生和修复。

 1。介绍

间充质干细胞(msc)多功能干细胞有很强的成骨分化能力( 1, 2]。由于其强大的成骨分化的潜力,msc被认为是最有前途的细胞用于组织工程骨再生和修复技术 1, 2]。然而,成骨分化的分子机制,调节msc在很大程度上仍是个未知数,从而阻碍了进一步发展MSC-based骨修复的细胞治疗诊所。因此,使用msc在治疗应用程序中,机制的进一步探索成骨分化是必要的。

RSP5,也叫做NEDD4L (NEDD4-like E3泛素蛋白连接酶),属于HECT(同源E6-AP羧基末端)domain-containing E3连接酶家族( 3, 4]。先前的研究已经证明了HECT domain-containing家族在骨形成起着重要的作用。例如,Smurf1/2负调控msc的成骨分化Smad1退化和Runx2,虽然NEDDL4积极调节骨生成的msc激活pSmad2和pERK1/2通路( 5- - - - - - 8]。然而,尽管许多研究已经进行了阐明RSP5在各种生物过程的作用,其作用在骨形成仍然是难以捉摸的 9, 10]。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激酶参与生物功能的许多方面,如细胞增殖、代谢、细胞周期,和转移 11]。多个研究证实了一种蛋白激酶信号通路起着重要的作用在骨 12, 13]。一种蛋白激酶的激活是通过一种蛋白激酶磷酸化调节Thr308和Ser473 [ 11]。然而,最近的研究集中在一种蛋白激酶磷酸化表明泛素化和Akt deubiquitination也开关Akt活动( 11]。例如,坏死因子receptor-associated因子6 (TRAF6)和Skp2-Skp-cullin-F-box-containing (SCF)调节Akt激活为E3连接酶通过Lys63 (K63)联系polyubiquitination Akt的胰岛素样生长因子1 (igf - 1)和ErbB受体信号,分别是( 11, 14]。尽管多个研究探索一种蛋白激酶磷酸化和激活骨生成期间,Lys63的具体机制(K63)联系polyubiquitination Akt在骨在很大程度上仍是个未知数。

在这项研究中,我们专注于探究RSP5对msc的成骨潜能的影响,进一步阐明具体的机制。我们旨在确定RSP5可以作为一个检查点调控msc的成骨分化细胞的命运。

 2。材料和方法 2.1。道德声明

这项研究符合赫尔辛基宣言,伦理委员会批准广东省人民医院。九岁的健康的捐赠者中加入了20到30岁的研究。在这项研究之前,所有健康的捐赠者被告知临床需求和可能的风险的所有操作,并签署了知情同意。

 2.2。细胞隔离和扩张

骨髓的愿望是由熟练的医生。msc在骨髓样本孤立立即使用密度梯度离心方法。短暂,骨髓样本转移到低杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Gibco)含10%胎牛血清(的边后卫,Gibco)总量的10毫升,然后添加到10毫升Percoll(法玛西亚生物技术)密度为1.073 g / ml。单核细胞是由梯度离心法分离30分钟的900克。孤立的单核细胞用磷酸盐(PBS),然后洗净去籽的培养瓶低糖DMEM补充10%的边后卫。细胞培养在37°C和5%的股份有限公司2,培养基每2天更换一次。msc confluency时通过文化达到了90%。msc在通道2被用于实验。

 2.3。表面标记识别

msc包含0.53毫米EDTA是用0.25%胰蛋白酶消化,和反应是终止的边后卫。msc被PBS洗了三次后,他们孵化与抗体CD14、CD29、CD44、CD45、CD105, HLA-DR (Miltenyi研究)30分钟根据协议。msc与PBS洗了三次,并积极的表面标记发现了BD涌入细胞分选仪(BD生物科学)。

 2.4。Trilineage分化潜力分析

msc是培养和诱导接受trilineage分化:成骨分化,chondrogenic分化,分化脂肪形成的。成骨分化,msc被播种在12-well板的密度 1。5 × 10 4 细胞/厘米2和包含DMEM培养的成骨分化中10%的边后卫,100国际单位/毫升青霉素、链霉素100国际单位/毫升、0.1 μM地塞米松,10毫米 β甘油磷酸,50 μ抗坏血酸(σ)。媒介是每三天更换一次,成骨分化潜能是由茜素红S (ARS)和碱性磷酸酶(ALP)染色和量化。脂肪形成的差异化,msc被播种如上所述,在脂肪形成的分化培养基培养包含DMEM和10%的边后卫,1 μ10 M地塞米松, μg / ml胰岛素(σ),0.5毫米3-isobutyl-1-methylxanthine(σ),吲哚美辛和0.2毫米(σ)。经过3天的感应,媒介是每三天更换一次,脂肪形成的分化潜能是由油红O染色。chondrogenic分化, 2。5 × 10 5 msc在600 g离心5分钟15毫升聚丙烯锥形管形成颗粒(如前所述)( 15]。球是在chondrogenic分化培养基培养含100单位/毫升青霉素、链霉素100国际单位/毫升、1% ITS-Premix(康宁),50米抗坏血酸(σ),1毫米丙酮酸钠(σ),0.1 M地塞米松,10 ng / ml转化生长因子- β3 (R&D)。媒介是每三天更换一次。的小球受到阿尔新蓝染色确定chondrogenic分化潜能。

 2.5。细胞增殖实验

msc的增殖率是决定通过细胞计数Kit-8 (CCK-8 Dojindo)分析根据制造商的协议。媒介缺乏msc被用作消极的控制。

 2.6。农业研究所化验

ARS染色,msc固定和沾1% ARS 10分钟。这些细胞被洗用PBS 3次。染色细胞在显微镜下拍摄的图像。ARS量化,细胞培养有10%氯化十六烷吡啶一水(中国共产党,Sigma-Aldrich) 30分钟温柔颤抖。提取上清液的吸光度被标以562海里(热费希尔)。

 2.7。高山化验

对于高山活动,msc细胞溶解在里帕裂解缓冲(热费希尔)含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(罗氏)。溶菌产物是离心机在4°C 12000 rpm 30分钟。提取上清液,高山蛋白质的活动浮在表面的检测使用高山活动试剂盒(南京建成生物技术)根据制造商的协议。高山染色,msc在citrate-acetone-formaldehyde固定剂固定,然后用碱性染料(Sigma-Aldrich)在黑暗中15分钟。染色细胞在显微镜下拍摄的图像。

 2.8。油红O染色

msc与4%多聚甲醛固定15分钟。msc与PBS洗了三次后,他们沾油红O工作15分钟的解决方案。染色细胞在显微镜下拍摄的图像。

 2.9。阿尔新蓝染色

细胞颗粒与4%多聚甲醛固定,然后嵌入在石蜡切片成部分。使用阿尔新蓝染色的部分解决方案30分钟和PBS洗3次。染色细胞在显微镜下拍摄的图像。

 2.10。西方墨点法

总蛋白的msc提取如上所述 16]。上层清液中的蛋白质浓度测定用BCA分析工具包(Sigma-Aldrich)。蛋白质被钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳分离,随后转移到聚偏二氟乙烯膜(微孔)。膜是孵化主要抗体GAPDH, RSP5, Smad1,磷酸化Smad1/5/9,总连环蛋白,nonphosphorylated连环蛋白,一种蛋白激酶和磷酸化Akt在一夜之间(1:1000年,Abcam)。膜清洗后由TBST缓冲区,这是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(1:3000年,Abcam) 1 h。具体antibody-antigen复合物西方化学发光检测使用止动剂合衬底(微孔)。

 2.11。击倒和超表达慢病毒感染

为可拆卸的慢病毒建设、四siRNAs RSP5被设计出来,并选择最有效的核构造可拆卸的慢病毒。RSP5的序列是5 ′ -ACGTCTCGCATTTGAGCAGGG-3 ′ 负控制序列,是5 ′ -TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3 ′ 。超表达慢病毒的完整的核苷酸序列RSP5构造。击倒和超表达慢病毒都GenePharma生成的公司。慢病毒(109你/毫升)5 μg / ml聚凝胺与msc孵化24 h的莫伊50。相关实验进行所述14天的成骨分化。

 2.12。定量实时聚合酶链反应

msc的总RNA提取使用RNA-Quick净化设备(我国生物技术)根据协议。提取的RNA合成成cDNA使用PrimeScript™RT试剂盒(豆类)。定量实时PCR进行LightCycler®480 PCR系统(罗氏)使用SYBR®预混料交货Taq™工具(豆类)。每个基因的相对表达水平进行了分析使用2- - - - - - Δ Δ Ct方法和规范化 β肌动蛋白的表达。正向和反向引物的序列如下所示(表为每一个基因 1)。

引物序列。

基因 正向引物(5 ′ 3 ′ ) 反向引物(5 ′ 3 ′ )
β肌动蛋白 CATGTACGTTGCTATCCAGGC CTCCTTAATGTCACGCACGAT
Runx2 TCAACGATCTGAGATTTGTGGG GGGGAGGATTTGTGAAGACGG
骨钙素( OCN) CACTCCTCGCCCTATTGGC CCCTCCTGCTTGGACACAAAG
骨桥蛋白( OPN) GAAGTTTCGCAGACCTGACAT GTATGCACCATTCAACTCCTCG
2.13。Akt通路阻塞

AZD5363 (Selleck)的浓度增加了5 μM msc接受成骨分化。相关实验进行10天的归纳。

 2.14。Coimmunoprecipitation化验

MSC蛋白质提取如上所述[ 17]。上层清液的蛋白质与RSP5抗体孵化,Akt或免疫球蛋白(Abcam)控制在4°C。的protein-G琼脂糖珠被添加到混合,在4°C的环境3 h。珠子被收集和洗五次,其次是再悬浮、和沸腾在缓冲区包含50毫米三,2%十二烷基磺酸钠(SDS)、10%甘油,10毫米二硫苏糖醇(德勤),和0.2%的溴酚蓝。所有的样品都用免疫印迹检测化验(如上所述 17]。

 2.15。质粒建设和转染

等表达质粒pcDNA3.1 (+) -HA-UB pcDNA3.1 (+) -HA-K63-UB pcDNA3.1 (+) -HA-K48-UB pcDNA3.1 (+) -Myc-RSP5,和pcDNA3.1 (+) -Flag-Akt都购自Obio科技集团有限公司为质粒转染293 T细胞被播种在6-well盘子。总共2 μ克/每一个质粒,5 μl Lipo3000和5 μl P3000被添加和孵化293 T细胞2天。293 T细胞的蛋白质提取的治疗后与10 μ环己酰亚胺,然后,IP和免疫印迹分析进行如上所述。主要的抗体Flag-Tag、Myc-Tag HA-Tag都从Abcam。

 2.16。统计分析

所有数据都表示为 的意思是 ± 标准 偏差 (SD)。 T 测试和单向方差分析其次是Bonferroni试验和皮尔逊相关试验进行统计分析使用SPSS (SPSS, Inc .)。 P 值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有的结果都包含一式三份样品确定基于三个独立的实验。

 3所示。结果 3.1。表型和msc Trilineage分化能力

识别msc和决定他们的纯洁,我们通过流式细胞仪检测细胞表型。结果表明,msc是积极CD29、CD44、和CD105但- CD14、CD45、HLA-DR,符合典型的表型观察在先前的报道(图 1(一))[ 18]。此外,msc是呈纺锤状细胞。可以诱导这些细胞进行成骨分化,chondrogenic分化,分化脂肪形成的特定的诱导培养基(图所示 1 (b))。这些结果表明,msc满足国际社会的细胞疗法的识别标准,纯度高的 18]。

表型和msc trilineage分化能力。(一)msc阳性CD29、CD44、CD14和CD105但负面,CD45和HLA-DR。(b)的msc诱导前纺锤状。可以诱导msc进行成骨分化,chondrogenic分化,分化脂肪形成的。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。 n = 3 用3种不同的MSC行独立实验。

 3.2。在成骨分化RSP5表达式在msc

检测RSP5表达式在MSC成骨分化,我们第一次骨髓间充质进行成骨诱导分化,和成骨分化能力是由ARS高山在不同时间点检测。如图 2(一个),钙结节染色的ARS增加感应的从0到14天。量化的ARS染色感应”后逐渐上升,表明msc接受成骨分化。高山试验显示一致的结果(图 2 (b))。此外,RSP5表达增加与msc接受成骨分化(图 2 (c))。此外,RSP5表达水平不同的msc呈正相关,其成骨分化能力由农业研究所和高山化验表明强烈的msc RSP5表达式和成骨分化之间的关系(数据 2 (d)和 2 (e))。

在成骨分化RSP5表达式在msc。(a)的染色ARS成为感应的黑暗从0到14天。量化的ARS染色也增加感应的从0到14天。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。(b)的染色高山也深从0到14天的感应。高山活动增加感应的从0到14天。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。(c) RSP5在蛋白水平的表达逐渐增加在MSC成骨分化。(d) RSP5表达水平呈正相关的ARS量化msc在10天的感应。(e) RSP5表达水平呈正相关的高山活动msc诱导的第十天。 ∗ 表明 P < 0.05 。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。 n = 3 用3种不同的MSC行独立实验。

 3.3。抑制RSP5表达式msc的成骨分化能力下降

澄清的作用RSP5 msc的成骨分化,我们构建慢病毒编码的shRNA RSP5 (Lv-RSP5),和下面的实验探索RSP5在成骨分化成骨的14天后进行了归纳。抑制效应证实了免疫印迹结果(图 3(一个))。推倒RSP5并不影响msc在成骨诱导的生长曲线(补充图 1)。RSP5抑制后的表达,不仅ARS染色和量化,而且高山活动和染色相比显著降低的msc诱导组和控制慢病毒组(数字 3 (b)和 3 (c))。 Runx2, OCN, OPN骨生成的标记msc(至关重要 1]。所有这些标记物的表达水平Lv-RSP5组也在基因水平降低(图 3 (d))。此外,一致的结果,这些标记蛋白的表达水平经免疫印迹试验(图 3 (e))。这些结果表明,RSP5 MSC的成骨分化能力,和减少RSP5表达抑制MSC成骨。

抑制RSP5表达式msc的成骨分化能力下降。(一)Lv-RSP5显著抑制RSP5表达式在msc。(b)的ARS染色和量化Lv-RSP5组相比被削弱的NC组。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。(c)的高山染色和活动Lv-RSP5组相比降低NC组。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。(d) Runx2 OCN, OPN表达在基因水平Lv-RSP5组低于NC组。(e) Runx2 OCN, OPN蛋白表达水平也低于Lv-RSP5组数控组。 ∗ 表明 P < 0.05 。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。 n = 3 用3种不同的MSC行独立实验。诱导组表明msc进行成骨分化没有其他治疗。数控组表明msc与控制慢病毒转染接受成骨分化。Lv-RSP5组表明msc与慢病毒转染编码的shRNA RSP5接受成骨分化。

 3.4。RSP5过度加速MSC成骨分化

进一步证实RSP5对msc的成骨分化的影响,然后建立另一个慢病毒中RSP5 (OE-RSP5)。与OE-RSP5转染后,RSP5 msc的表情几乎是2.5倍高于对照组(图 4(一))。Overexpressing RSP5并不影响msc在成骨诱导的生长曲线(补充图 1)。此外,农业研究所和高山染色和量化OE-RSP5组远高于感应和控制慢病毒组(数字 4 (b)和 4 (c))。此外, Runx2, OCN, OPN表达式在msc转染OE-RSP5在基因和蛋白质含量显著增加(数据 4 (d)和 4 (e))。这些结果证实,RSP5加速的成骨分化能力msc。

RSP5过度加速MSC成骨分化。(一)OE-RSP5显著增加RSP5表达式在msc。(b)的ARS染色和量化的OE-RSP5组高于数控组。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。(c)的高山染色和活动OE-RSP5组也高于数控组。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。(d) Runx2 OCN, OPN表达基因层面增加OE-RSP5组。(e) Runx2 OCN, OPN蛋白表达水平也增加了OE-RSP5组。 ∗ 表明 P < 0.05 。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。 n = 3 用3种不同的MSC行独立实验。诱导组表明msc进行成骨分化没有其他治疗。数控组表明msc与控制慢病毒转染接受成骨分化。OE-RSP5组表明msc与慢病毒转染overexpressing RSP5接受成骨分化。

 3.5。RSP5调控msc的成骨分化,通过一种蛋白激酶信号通路

然后我们发现了一种蛋白激酶的激活水平,连环蛋白,Smad信号通路,已报告与msc的骨生成。虽然Smad1/5/9的磷酸化水平或水平nonphosphorylated连环蛋白保持不变的msc转染Lv-RSP5或OE-RSP5,磷酸化水平的一种蛋白激酶信号通路Lv-RSP5组明显减少,但增加OE-RSP5组(图 5(一个)),这表明RSP5可以积极调节一种蛋白激酶信号通路的激活。AZD5363是一种蛋白激酶信号通路的抑制剂,减少msc成骨诱导条件下的生长曲线(补充图 1 b)。此外,AZD5363大幅减少农业研究所和高山染色和量化与OE-RSP5 msc转染(数字 5 (b)和 5 (c))。成骨的标记物的表达,包括 Runx2, OCN, OPN的msc OE-RSP5组治疗后也降低到正常水平与AZD5363(图 5 (d))。这些结果证实,RSP5提升MSC分化成骨的通过一种蛋白激酶信号通路,阻断一种蛋白激酶信号通路可以抑制这些RSP5的影响。

RSP5调控msc的成骨分化,通过一种蛋白激酶信号通路。(一)一种蛋白激酶的磷酸化水平降低Lv-RSP5组,但增加OE-RSP5组。Smad和连环蛋白的磷酸化水平可比Lv-RSP5组和OE-RSP5组。(b) OE-RSP5增加ARS染色和量化。AZD5363这些值返回到正常水平的数控组。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。(c) OE-RSP5高山染色和活动增加。AZD5363逆转这些影响到正常水平的数控组。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。(d) OE-RSP5增加Runx2 OCN, OPN表达。AZD5363这些标记物的表达降低到正常水平的数控组。 ∗ 表明 P < 0.05 。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。 n = 3 用3种不同的MSC行独立实验。诱导组表明msc进行成骨分化没有其他治疗。数控组表明msc与控制慢病毒转染Lv-RSP5或OE-RSP5接受成骨分化。OE-RSP5组表明msc与慢病毒转染overexpressing RSP5接受成骨分化。

 3.6。RSP5诱导的K63-Linked Akt的泛素化

先前的研究已经表明,K63-linked泛素化的一种蛋白激酶磷酸化中扮演着重要的角色,一种蛋白激酶信号通路的激活。我们首先探讨RSP5和Akt是否相互作用。互惠Co-IP /免疫印迹分析表明,内生RSP5和Akt msc(图中相互作用 6(一))。然后我们coexpressed HA-Ubiquitin Myc-RSP5, Flag-Akt msc,发现Myc-RSP5显著诱导Flag-Akt的泛素化(图 6 (b))。此外,RSP5介导K63-linked泛素化Akt代替K48-linked泛素化(数字 6 (c)和 6 (d))。总之,这些数据表明RSP5可以促进一种蛋白激酶的磷酸化和激活信号通路通过诱导K63-linked Akt的泛素化。

RSP5诱导的K63-linked Akt的泛素化。(一)Coimmunoprecipitated混合物分离通过sds - page和评价西方的污点。内源性RSP5和Akt msc与彼此互动。(b) Myc-RSP5显著诱导Flag-Akt的泛素化。(c) Myc-RSP5显著诱导K63-linked Flag-Akt泛素化。(d) Myc-RSP5并不影响K48-linked Flag-Akt泛素化。

 4所示。讨论

在这项研究中,我们表明,RSP5的表达升高的msc及成骨分化过程中RSP5积极监管这一过程通过充当E3泛素连接酶调解K63-linked泛素化和Akt激活。这些发现暗示RSP5可能是一个有前途的目标来提高治疗效率利用msc对骨再生和修复。

msc是多功能间叶细胞祖细胞可以作为长期前体分化的各种细胞,包括成骨细胞内层,脂肪细胞( 19]。特别是,成骨分化的msc被广泛研究,因为它至关重要的作用在多种生理和病理过程 20., 21]。例如,唐Y等人证明了msc与系统性红斑狼疮(SLE)患者显示出降低成骨的能力和发挥了重要作用在这些患者的骨质疏松症 20.]。刘X等人证明了msc的后纵韧带骨化患者(OPLL)有很高的倾向对骨的成骨分化,抑制msc是有效治疗骨赘形成在这种情况下( 21]。此外,msc被认为是最有前途的细胞用于组织工程骨再生和修复技术 22]。因此,研究msc的成骨分化的调控机制有助于寻找新的目标,并在临床应用的价值。

RSP5,也叫做NEDD4L,属于HECT domain-containing E3连接酶家族( 9]。多项研究已经证实,RSP5的表达起着重要的作用在多种组织和器官的发展以及生理过程( 10, 23, 24]。例如,Manunta P等人证明RSP5与alpha-adducin控制血压( 23],Kaminska J等人表明RSP5影响肌动蛋白细胞骨架形态的体内和体外 24]。最近,成员HECT domain-containing E3连接酶家族,包括NEDD4 Smurf1,和Smurf2证明调节msc的成骨的过程。NEDD4负调控msc的成骨分化,这个函数是一个名叫SNHG1长非编码RNA的控制下( 25]。此外,抑制smurf1加速成骨分化的表达式msc和促进骨再生 26]。此外,smurf2参与msc的成骨分化的NF - κB信号通路( 27]。然而,RSP5是否发挥作用在骨从未被探索。在这项研究中,我们表明,RSP5的表达升高的成骨诱导msc,操纵TRAF4的表达显著改变了msc的成骨能力。这些结果表明,RSP5,类似于其他成员的家庭,可能是一个潜在的目标调节骨骼msc的发展通过调节成骨的过程。

进一步探索RSP5机制在调节msc的成骨的过程,我们首先评估几个典型信号通路的激活后敲门或overexpressing RSP5。我们表明,操纵RSP5的表达后,Smad1/5/9和连环蛋白信号通路的激活水平保持相对稳定。然而,击出RSP5显著减少一种蛋白激酶的磷酸化和激活信号通路,而overexpressing RSP5显然增加了一种蛋白激酶的磷酸化和激活信号通路。此外,proosteogenic效应overexpressing RSP5可以被抑制一种蛋白激酶信号通路的激活。综上所述,这些结果表明,RSP5促进骨生成的msc通过激活一种蛋白激酶信号通路。近几十年来,许多研究证实了一种蛋白激酶信号通路促进骨生成( 7, 13]。一种蛋白激酶磷酸化的两个关键的残留物,T308激活域,或T-loop催化蛋白激酶的核心和S473 c端疏水的主题,需要极大的激活激酶( 11]。此外,Akt ubiquitylated在多个不同的赖氨酸残基( 11]。独特的泛素连接酶,夫妇K63-linked泛素Akt服务规范Akt激活。例如,各种生长因子引起的激活TRAF6和Skp2 E3连接目标Akt pH域中的赖氨酸残基,和这些修改提高膜定位,从而激活( 28, 29日]。然而,大多数研究只关注一种蛋白激酶的磷酸化在骨,而很少有研究探讨了K63-linked泛素化Akt在成骨分化的msc。如前所述,RSP5充当E3连接酶功能在大多数生理和病理条件下( 9, 30., 31日]。例如,Belgareh N证明RSP5 ubiquitinated erm组件来控制mitophagy [ 10]。在我们的研究中,我们表明,RSP5和Akt互相RSP5显著诱导K63-linked Akt激活泛素化的一种蛋白激酶信号通路。据我们所知,这可能是第一个研究探讨K63-linked泛素化Akt在成骨分化的msc。因此,我们的研究可能有助于进一步扩大网络的一种蛋白激酶信号通路。

总之,我们的研究不仅扩展了知识RSP5骨骼发育,但也提供了一个潜在的目标骨再生和修复。然而,仍有一些本研究的局限性。首先,骨重建过程是由成骨细胞和破骨细胞( 32, 33]。虽然我们证明RSP5积极调节的成骨分化过程msc、RSP5的函数osteoclastogenesis从未被探索。第二,尽管我们表明RSP5积极调节msc在体外成骨分化,体内RSP5骨骼发展的具体作用仍需进一步探索。克服上述局限,我们需要使用转基因小鼠与特定击倒或击倒RSP5成骨细胞谱系和破骨细胞谱系。因此,构建这些转基因小鼠是我们未来的目标。

 数据可用性

所有的数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

Changxiang梁、国研梁和小青郑进行了实验。Changxiang梁,Shuaihao黄,黄Yongxiong写了初稿的手稿。梁董阴和Changxiang导致概念的想法,该研究的实验设计和编辑的手稿。

 补充材料

补充图1 (A)减少和过度ofRSP5在msc影响这些细胞的生长曲线成骨的媒介。(B) AZD5363减少msc在成骨诱导条件下的生长曲线。 ∗ 表明 P < 0.05 。 n = 3 用3种不同的MSC行独立实验。

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