iRoot SP通过激活NF-促进骨髓间充质干细胞成骨/成牙κB和MAPK信号通路

摘要

骨和牙组织的再生及相关的细胞治疗已引起广泛关注。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是这种再生的潜在候选细胞。iRoot SP是一种生物陶瓷预混根管封闭剂，广泛应用于临床。然而，iRoot SP对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响尚未阐明。在本研究中，我们发现0.2 mg/ml iRoot SP条件培养基可以促进骨/牙源性分化，增强骨髓间充质干细胞的矿化，而不影响其增殖能力。从力学上看,NF -κsp处理的骨髓间充质干细胞激活B和MAPK信号通路，特异性抑制剂培养时抑制分化。综上所述，这些发现表明，iRoot SP通过NF-促进BMSCs的骨/牙源性分化κ这可能为iRoot SP的临床应用提供新的理论基础，并为未来骨和牙组织再生提供新的治疗靶点。

1.介绍

牙齿的牙髓组织会受到外伤、蛀牙和解剖变异的影响，导致临床上出现牙髓炎和根尖周炎的病例[1].根管治疗（RCT）可有效去除感染的牙本质和牙髓，促进炎症恢复，防止牙根和牙冠再感染[2]．根管充填的目的是形成完整的三维充填。各种材料，包括氧化锌丁香酚、树脂、玻璃离聚物和氢氧化钙，已被用作根管封闭剂[3.]．近年来，生物陶瓷基密封剂引起了人们的关注[4.]．

iRoot SP (Innovative BioCeramix Inc, Vancouver, Canada)是一种即用的可注射生物陶瓷，是一种主要由硅酸钙组成的无铝材料。iRoot SP预混无机成分(硅酸钙、磷酸二氢钙、氢氧化钙和填料)、显影剂(氧化锆)和非水稠化剂[5.]．iRoot SP适用于配锥单锥封闭和侧压充填技术。此外，它已被证明具有优越的抗菌活性、生物相容性、细胞相容性、高抗脱位性，并促进根尖周组织愈合[6.]．最近的研究已经检测了iRoot SP对干细胞的影响，如人类牙齿生殖干细胞[7.和人牙周韧带细胞[8.]．

当使用像iRoot SP这样的密封剂时，它被放置在根管内并被限制在那里。然而，它可能通过根尖孔挤压，或释放化学物质进入根尖周组织[9.]．根尖手术通常用于顽固性慢性根尖牙周炎。在这个过程中，密封剂不可避免地会接触到周围的组织和细胞。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)由于具有良好的增殖和多向分化能力，在干细胞治疗中发挥着重要作用。由于它们的生物学特性、部分共享的基因表达和相似的因子调控[10]骨髓间充质干细胞可以作为牙干细胞的替代来源[11]．此外，据报道，骨髓间充质干细胞有迁移到根管的能力，并参与牙髓形成。因此，骨髓间充质干细胞可用于牙髓再生[12]．各种因素，包括脂联素[13、生物活性物质[14和microRNA [15]，已被证明影响BMSCs的成骨分化。然而，iRoot SP对BMSCs生物学活性的影响尚不清楚。

多种调节机制，包括NF-κB (16]和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应[17，参与骨髓间充质干细胞的多向分化。1986年，David Baltimore的研究小组发现了A B细胞特异性的诱导转录因子，并鉴定为核因子-κB (NF -κB) (18]．NF -κB家族对于协调多种细胞反应(包括细胞增殖)至关重要[19]，分化[20.和细胞凋亡[21]．MAPKs是一个丝氨酸-苏氨酸激酶家族，在许多生理过程中是必不可少的[22]．已经报道了这两种信号通路之间的许多相互作用。

在本研究中，我们检测了iRoot SP对骨髓间充质干细胞的影响以及任何已确定的影响的分子机制。结果表明，iRoot SP通过NF-促进骨髓间充质干细胞的成骨/成牙能力κB和MAPK信号级联。

2.材料和方法

２.１.骨髓间充质干细胞的纯化和生长

如前所述，从中国南京医科大学实验动物中心获得的两周龄雄性Sprague-Dawley大鼠中分离出骨髓基质细胞[23]。所有方案均按照南京医科大学动物实验委员会的指导方针进行。简单地说，无菌切除大鼠股骨和胫骨。使用alpha minimum基本培养基冲洗骨髓细胞悬液(α-MEM, Gibco, Life Technologies, Grand Island)，然后离心。细胞置于60mm培养皿中培养α- 用10％胎儿牛血清（FBS; Gibco，Grand Island），100u / ml青霉素和100mg / ml链霉素在37°C中的5％CO₂．培养基每两天更换一次。当细胞达到80-85%汇合时，按1:3的比例消化传代。在本研究中，2-4代的细胞被用于实验。

２.２.iRoot SP条件培养基的制备

iRoot SP (Innovative BioCeramix Inc.， Vancouver, Canada)在37°C、100%加湿、5% CO的环境下固化₂．生物材料干燥一天，磨成粉末，并通过45μm过滤器。接下来，他们被混合α-在20岁的时候 mg/ml浓度和剧烈涡流。将收集的溶液培养三天 在37°C条件下放置30天，以产生其生物活性成分。然后将上清液过滤并与水混合α-MEM形成SP条件培养基。

2．3.流式细胞术(FCM)

骨髓间充质干细胞在完全培养基和含2 收集细胞，用预先冷冻的酒精固定，并在4°C下储存24天 用PBS冲洗后，使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences，CA，USA）测定细胞周期分数（G0G1/S/G2M期）。这些程序一式三份。

２.４.细胞计数试剂盒8 (CCK8)检测

使用细胞计数套件-8（CCK-8，Dojindo，Tokyo，Japan）测定细胞增殖。在滴度的滴度下种植到96孔板（康宁，美国）中的BMSCs 每孔培养24 h。然后细胞在完全培养基或SP中生长。在第0、1、3、5、7和9天，用10代替培养基μL CCK-8试剂2 h。在450nm处测量光密度(OD)值。

2．5．碱性磷酸酶(ALP)酶活性及染色

碱性磷酸酶(ALP)酶活性的测定使用市售试剂盒(Beyotime，中国)，按照制造商的说明和标准化的总蛋白滴度。蛋白检测采用BCA试剂盒(Beyotime，中国上海)。细胞在4%多聚甲醛中固定20分钟，漂洗3次，并根据制造商的协议使用ALP染色试剂盒(Beyotime，中国)进行染色。

2.6.茜素红染色和定量

茜素红染色观察矿化情况。第14天，BMSCs固定30天 用75%乙醇和2%茜素红（Sigma-Aldrich）染色。然后用显微镜观察标本。用10%氯化十六烷基吡啶（CPC）定量钙化结节，并在560℃下测量其吸光度 将钙密度标准化为总蛋白质含量。

2.7。免疫印迹

为了研究骨/牙源性分化，在第0天、第3天和第7天，收集有或没有SP处理的BMSCs。然后在第0天、第30天、第60天和第90天，用SP处理细胞 最小值和0、15、30和60 测量NF参与度的最小值-κB级联，MAPK级联。NF -κ在相关时间用Keygen Kit (Keygen Bio-Tech, Nanjing, China)提取B通路、细胞质和核蛋白。以确定阻遏因子对NF-的影响κB和MAPK信号级联，我们用抑制剂(即靶向NF-的BMS345541)预处理细胞κB、靶向ERK的U0126、靶向JNK的SP600125、靶向P38的SB203580)孵育2 h后，用SP分别培养30 min和15 min。用1 mM苯甲基磺酰氟在冰上溶解于RIPA缓冲液(Beyotime，中国)中。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移到PVDF膜(Millipore)上。我们利用5%的牛血清白蛋白在室温下封闭细胞膜2小时，然后用一抗(DSPP (BS70836;Bioworld, OPN (ab8448, Abcam, UK)， RUNX2 (ab76956, Abcam, UK)， OSX (ab22552, Abcam, UK)， P65 (#8242, Cell Signaling Technology, USA)， p-P65 (#3033, Cell Signaling Technology, USA)， IκB.α(#4814, Cell Signaling Technology, USA)， p-IκB.α（＃2859，Cell Signaling Technology，USA），JNK（＃9252，Cell Signaling Technology，USA），P-JNK（＃9255，Cell Signaling Technology，USA），P38（＃8690，Cell Signaling Technology，USA），P-P38（＃4511，Cell Signaling Technology，USA），ERK（＃4695，Cell Signaling Technology，USA），P-ERK（＃4370，Cell Signaling Technology，USA），组蛋白H3（BioWorld）和GAPDH（＃2118，细胞信号技术，美国）））。用TBST洗涤后，将膜与二抗孵育1小时，再次用TBST冲洗30分钟。最后，使用Western Blot成像系统（GE Healthcare，北京，北京，中国）扫描膜，并使用imagej软件量化蛋白质表达。

2.8。实时RT-qPCR

采用TRIzol试剂(Invitrogen, NY, USA)纯化总RNA。随后，tRNA通过PrimeScript RT Master Mix试剂盒(TaKaRa Biotechnology, China)反转录转化为cDNA。接下来，在ABI 7300 real-time PCR系统上使用SYBR Green PCR master mix (Roche, Indianapolis, IN)进行RT-PCR。热循环器设置为95°C 30 s, 95°C 40个循环5 s, 60°C 31 s。我们利用GAPDH规范骨/牙源性基因的表达(即，Osx那高山那Runx2那Opn,Dspp)，用2^−ΔΔCT的方法。所使用引物的序列如表所示1．

2.9。免疫荧光染色

将骨髓间充质干细胞接种到10mm2无菌玻璃盖上，培养72 h。然后，用4% PFA固定30分钟，用Triton X-100溶液渗透12分钟。我们使用正常山羊血清(DCS/BioGenex, Hamburg, Germany)在37°C下阻断细胞30分钟，然后在4°C下用抗ALP、RUNX2、P65、p-JNK、p-p38和p-ERK的一抗过夜。孵育后，细胞在黑暗中偶联二抗1小时。我们用DAPI (Beyotime，中国)对细胞核进行反染色，然后在倒置荧光显微镜下观察。

2.10。统计分析

每项测试都有三个重复。数据报告为 ．结果采用单因素方差分析或学生方差分析进行检验 -检验。统计显著性水平设置为 ．采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。

3.结果

３．１．iRoot SP的最佳浓度

原代骨髓间充质干细胞培养3天如图1（a）．细胞呈梭形(图)1（b））.与其他各组相比，0.2 mg/ml spp处理的BMSCs ALP酶活性上调最高( ;数字1 (c)）.ALP基因表达结果显示，0.2 mg/ml SP组骨髓间充质干细胞表达最高( ;数字1 (d)）.结果表明，0.2 mg/ml为最佳浓度。

３.２．SP对骨髓间充质干细胞增殖的影响

流式细胞术显示增殖指数的差异可以忽略不计( ）SP组和对照组之间（图1 (e)和1 (f))CCK-8分析表明，与SP培养不会影响BMSCs的增殖（图1（g））.

３．３．iRoot SP增强骨髓间充质干细胞的骨/牙源性分化

Western blot检测SP对BMSCs骨/牙源性分化的影响。SP处理下牙釉质唾液磷蛋白(DSPP)、骨sterix (OSX)、骨桥蛋白(OPN)和runt相关转录因子2 (RUNX2)的相对含量上调(图)2(一个); ）.的基因表达水平Dspp那Opn那Runx2那高山,Osx也增强了(图2 (b); ）.ALP染色和定量显示，无论是否使用成骨分化培养基，SP均能提高BMSCs的表达水平（图1）2 (c); ）.显着地，在用SP孵育14天后观察到更多的矿化结节（图2（d）; ）.荧光成像显示ALP和RUNX2表达有相似的趋势(图2（e）; ）.综上所述，SP可促进骨髓间充质干细胞的骨/牙源性分化。

3．4．iRoot SP激活NF-κB在BMSC的途径

为了鉴定SP处理的BMSCs的分子变化，将细胞用SP培养0、30、60和90 min，然后提取细胞质和核蛋白。分析显示，IκB.α和P65在30 min达到峰值，而胞质IκB.α核P65水平在暴露30分钟后下降，但随后上升(图)3（a）; ）.免疫染色显示，核p65旋转30分钟（图3（b））.综上所述，SP激活了NF-κB通路在BMSCs中的作用。

3．5．抑制NF-κB通路下调sp治疗的BMSCs的骨/牙源性分化

说明NF-的功能κB级联分化sp处理的骨髓间充质干细胞，利用阻滞剂(BMS345541)。结果表明，IκB.αP65被抑制，而P65的核移位被促进-κB通路被阻断(图3（c）; ）.的基因表达Dspp那Opn那Runx2,Osx与SP组相比，SP+抑制剂组的抑制作用明显减弱(图)3 (d)和3 (e)那 ）.此外，在BMS345541处理下，ALP的表达较低(图345541)3 (f); ）.对于SP +抑制剂臂中的茜素红S染色也观察到统计学显着的降低（图3 (g); ）.综上所述，这些发现表明NF-κB级联反应在sp处理的骨髓间充质干细胞中被激活。

3.6。iRoot SP激活BMSCs中的MAPK级联

为了检测MAPK信号级联在SP处理的BMSCs骨/牙源性分化中的作用，我们用Western blot方法验证了0、15、30和60 min SP存在时的蛋白。结果显示，SP在15分钟后增加了p-JNK、p-p38和p-ERK的表达，但随后表达量呈时间依赖性下降(图)4（a）那p< . 01)。

3.7.抑制MAPK级联抑制SP处理的BMSC的骨/牙源性分化

Western blot和免疫荧光分析表明，抑制剂(SP600125、SB203580或U0126)处理后，p-JNK、p-p38和p-ERK表达均受到抑制。这些结果证实了MAPK通路被阻断(图)4 (b)和4 (c); ）.SP+抑制剂组的相对骨/牙源性标记物被调查，发现相对于SP组明显减少(图)4 (d)和4 (e); ）.如图所示4 (f)和4 (g)用SP培养后，ALP水平和钙结节的表达值较低。

4.讨论

骨髓间充质干细胞是组织工程再生方法(包括再生治疗(RET))中有前景的骨髓间充质干细胞来源[24]．由于骨髓间充质干细胞有分化成牙本质细胞的潜力，它们可以再生类似牙本质的组织[25]．即使没有纸浆和恐慌组织的未成熟牙齿体外，RET后管腔可见类骨细胞，提示细胞可能来源于骨髓[26]．以前的研究表明了多向分化，组织分化潜力[27那28，以及成骨[29bmsc的]。

iRoot SP已知具有良好的细胞相容性，可改善MG63细胞的矿化[30.]，增强hTGSCs的牙源性分化[7.]，促进hPDLCs的成骨分化[8.]，对成纤维细胞系无或低细胞毒性[31]．用能量色散x射线光谱(EDX)分析了iRoot SP的组成，发现了氧(O)、钙(Ca)、锆(Zr)、碳(C)和硅(Si)。溶解性测试后，EDX显示Ca、O、Si下降，Zr值上调[32]．钙在调节细胞生物学行为中起着至关重要的作用。一些研究已经证实，钙的释放可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导成骨分化[33]．此外，钙可能激活成骨细胞中的ERK和p38 MAPK通路，并通过招募Src激酶和Sh酪氨酸磷酸化来启动Ras-MAPK信号通路[34]．钙可以触发多种信号通路，如NF-κB途径，通过钙敏感受体（CaSR）[35]．硅的运动可以促进生物矿化[36]及增加成骨活动[37]．一般来说，硅酸钙基材料释放的钙和硅离子影响细胞的生物学行为[38]．这些洗脱液模拟了细胞和物质通过血块间接接触的临床条件[39，便于观察和分析[40]．在目前的研究中，洗脱物材料是按照ISO 10993-538 [41]如前所述[42]．

作为骨科/牙种遗传学分化的早期生物炎，与矿化关系密切相关[43]．根据ALP的峰值活性和mRNA水平，0.2 mg/ml iRoot SP浓度为最佳。然而，0.2 mg/ml iRoot SP并没有影响BMSCs的增殖能力。我们发现，在SP处理下，骨/牙源性生物特征(OPN, RUNX2, OSX和DSPP)的表达显著增加，矿化显著上调。早期牙源性分化的转录因子Runx2和Osterix负责骨发育[44那45]．OPN在成骨分化的中期起着关键作用[46]，而DSPP充当Odontoblasts的末端分化标志物[47]．我们寻找用于牙核发生和成骨的上调母稳压剂，表明IROOT SP对BMSC的相对分化的显着作用。但是，体外研究无法再现动态环境[48];iRoot SP在体内的作用有待进一步研究。根据与骨或血液接触的植入装置的标准，进一步研究iRoot SP在遗传毒性、致敏和组织植入试验方面的研究，将为更准确地了解该材料提供依据[49]．正如Clovis Mariano Faggion Jr.报道的，我们认为这些发现的随机临床试验应该进一步研究[48]．

已知MAPK家族中的激酶通过向细胞传递细胞外信号来引起细胞反应[50]．MAPK家族包括细胞外调节激酶(ERK)、c-Jun n端激酶(JNK)和p38。一些刺激，如MagT1 [51[基于基于硅酸钠微粒 - （C2S-）的生物材料，可以通过MAPK途径促进MSC分化[52]．我们的结果表明，在iRoot SP存在的情况下，它们的磷酸化水平被上调，并被特异性抑制剂SB203580、SP600125和U0126抑制。这些结果表明，iRoot SP通过MAPK途径促进骨/牙源性分化。

NF -κB家族由p65、RelB、c-Rel、p50、p52 5个成员组成，在细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用[53]．在大多数细胞中，NF-κB蛋白定位于细胞质中，与I的抑制剂家族蛋白有关κB. I的启动κB激酶(IKK)复合物磷酸化IκB蛋白，导致Iκ随后,》κB蛋白质降解26s蛋白酶体，导致NF-的核易位κB (54]．我们的结果表明，通过IκB磷酸化和P65转位入核后，iRoot SP激活NF-κ骨髓间充质干细胞B途径。

值得注意的是，NF-之间存在各种相互作用和连接κB途径和MAPK途径。据报道，P38、JNK和ERK可使各种底物磷酸化，并导致NF-等转录因子的激活κB;也就是NF-κB是MAPK的下游信号[55]．有人提出，刺激有丝分裂原活化蛋白激酶(MAP3K)家族会刺激IKK活性，这是NF-的关键步骤κB级联。例如，IκB.αSer-32和Ser-36是由丝裂原活化蛋白激酶/ERK激酶激酶1 (MEKK1)诱导的在活的有机体内但是我κB激酶复杂体外[56]．Liu等报道SB203580抑制IκB.α，证实了p38参与了NF-κB激活(57]．ERK还能降低NF-κ通过Nrf2/HO-1途径激活B [58].NF-κB诱导可触发JNK途径抑制剂的合成，说明NF-之间存在相当大的抵消关系κB及JNK [59]．然而，这种关系并非完全拮抗，因为它们协同调节抗凋亡蛋白cIAP1的表达[60]．

5.结论

本研究发现0.2 mg/ml iRoot sp条件培养基通过MAPK和NF-显著提高BMSCs的骨/牙源性分化κB级联。这些发现为iRoot SP的临床应用提供了理论依据。

数据可用性

在本研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者在合理要求。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

小吴和严明应被视为联合第一作者。WX和YM构思和设计了研究，收集和收集数据，并撰写了手稿。LJM和GXY回顾了数据。LYZ、BMX和FL进行数据分析和解释。YJH对研究进行构思和设计，提供资金支持和研究材料，对数据进行分析和解释，最终审定稿件。小吴和明艳是同样的贡献者。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81873707, no . 81900962);江苏省医学人才工程项目(no . ZDRCA2016086);江苏省高校学术发展重点项目(no . PAPD, no . ppd)江苏省科技发展项目(批准号:BE2017731)。

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