1。介绍
牙齿的牙髓组织可以受到创伤,龋齿,和解剖变异,导致临床病例的牙髓炎和根尖周的牙周炎(
1]。根管治疗(RCT)是有效消除感染的牙本质和果肉,促进康复炎症和防止再感染牙齿的根和皇冠
2]。根管充填的目的是形成一个完整的3 d填充。各种材料,包括氧化锌丁香酚树脂、玻璃离子交联聚合物,和氢氧化钙,一直利用根管密封材料(
3]。近年来,bioceramic-based密封材料吸引了注意力(
4]。
iRoot SP(创新BioCeramix公司、加拿大温哥华),一个现成的注射bioceramic,是一种不含铝材料主要由硅酸钙组成。iRoot SP与无机成分预拌(硅酸钙,磷酸二氢钙、氢氧化钙和填料),开发人员(氧化锆)和非水溶剂增稠剂(
5]。iRoot SP适合matched-taper单锥闭塞和侧压充填技术。此外,它已被证明有优越的抗菌活性,生物相容性,cytocompatibility,高阻错位,促进根尖周的组织愈合(
6]。最近的研究调查了iRoot SP对干细胞的影响,如人类牙胚干细胞(
7和人类牙周韧带细胞
8]。
当封口机使用像iRoot SP,放置在运河和局限。然而,它可能是通过顶端孔挤压,或者它可能释放化学物质进入根尖周的组织(
9]。顶端手术通常表现为难治性慢性根尖牙周炎。在这个过程中,这是不可避免的,密封材料将接触到周围的组织和细胞。由于其优越的增殖和多向分化能力,骨髓间充质干细胞(bmsc)在干细胞治疗扮演重要的角色。由于其生物学特性,部分共享基因表达,和类似的因素调节(
10],bmsc可作为替代来源牙齿干细胞(
11]。此外,bmsc据说有能力迁移到根管和参与纸浆的形成。因此,bmsc可能申请纸浆再生(
12]。各种各样的因素,包括脂联素(
13)、生物活性材料(
14),和微
15),已经被证明是影响bmsc的成骨分化。然而,iRoot SP对bmsc的生物活动的影响尚不清楚。
多元监管机制,包括NF -
κB (
16)和增殖蛋白激酶(MAPK)级联
17),已知参与msc的多向分化。在1986年,一个B特异性诱导转录因子是由大卫的研究小组发现巴尔的摩和确认为核因子-
κB (NF -
κB) (
18]。NF -
κB家庭协调多个细胞反应是至关重要的,包括细胞增殖(
19],分化[
20.),和细胞凋亡
21]。MAPKs形成serine-threonine激酶家族,是不可或缺的众多生理过程(
22]。许多报告了两个信号通路之间的相互作用。
在目前的研究中,我们审查的影响iRoot SP bmsc和任何识别影响的分子机制。结果显示,iRoot SP促进骨的通过NF - bmsc /牙原性的能力
κB和MAPK信号级联。
2。材料和方法
2.1。净化和bmsc的增长
骨髓基质细胞分离从降生男性Sprague-Dawley老鼠从实验动物中心,南京医科大学,中国,如前所述
23]。所有协议都是按照指南进行动物实验委员会南京医科大学。简单地说,大鼠股骨和胫骨无菌切除。刷新了骨髓细胞悬液使用alpha最低基本培养基(
αmem、Gibco、生活技术,大岛屿)然后离心机。细胞种植在60毫米文化菜肴和孵化
α与10%胎牛血清(mem的边后卫;Gibco,大岛),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升37°C 5%股份有限公司2。媒介是每两天更换一次。细胞消化和通道比1:一旦他们达到了80 - 85%的融合。细胞在2 - 4通道用于本研究的分析。
2.2。iRoot SP条件培养基的制备
iRoot SP(创新BioCeramix Inc .,加拿大温哥华)固化在37°C 100%的调湿大气中5%的股份有限公司2。生物材料是干一天,磨成粉,透过一个45
μm过滤器。接下来,他们混合
αmem 20毫克/毫升浓度和大力漩涡。三天收集的解决方案是孵化的37°C生成其生物活性的内容。当时上层清液过滤和混合
αmem SP-conditioned介质。
2.3。流式细胞术(FCM)
bmsc生长在完全培养基和MEM包含2毫克/毫升SP三天。这些细胞被收获,固定使用prechilled酒精,并存储在4°C 24小时在黑暗的房间里。与PBS冲洗后,细胞周期分数(G0G1 / S / G2M期)测定使用FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学、钙、美国)。这些程序进行了一式三份。
2.4。细胞计数设备8 (CCK8)评估
细胞增殖测定使用细胞计数Kit-8 (CCK-8、Dojindo、东京、日本)。bmsc被种植到96孔板(美国康宁公司)的效价
3
×
10
3
细胞每口井和孵化24 h。然后细胞生长在完全培养基或SP。在天0,1,3,5,7,9,媒介是10所取代
μL CCK-8试剂2 h。光密度值(OD)测定在450海里。
2.5。碱性磷酸酶(ALP)酶活性和染色
碱性磷酸酶(ALP)酶活性测定使用商用设备(Beyotime,中国)符合制造商的指令和标准化的总蛋白浓度测定。蛋白质检测用BCA试剂盒(Beyotime、上海、中国)。细胞被固定在4%多聚甲醛20分钟,冲洗三次,并使用高山彩色染色工具包(Beyotime,中国)根据制造商的协议。
2.6。茜素红染色和量化
茜素红染色法被用来研究矿化。14天,bmsc固定30分钟使用75%乙醇和2%茜素红染色(Sigma-Aldrich)。使用显微镜标本被可视化。钙化结节量化10%氯化十六烷吡啶(CPC)和它的吸光度测量在560海里。钙密度是规范化的总蛋白质含量。
2.7。免疫印迹
探讨骨的/牙原性的分化,bmsc收获有或没有SP-treatment 0,在天3和7。细胞被对待SP(0, 30、60和90分钟,0,15日,30和60分钟来衡量NF -的参与
κB和MAPK级联,分别。NF -
κB通路,细胞质和核蛋白质提取使用注册机装备(南京凯基生物生物技术,中国)相关的时间。确定在NF -阻遏蛋白的影响
κB和MAPK信号级联,我们进行预处理细胞抑制剂(即BMS345541针对NF -
κB, U0126瞄准ERK SP600125目标物,和针对P38 SB203580) 2 h,然后培养细胞SP 30分钟或15分钟,分别。bmsc细胞溶解在缓冲区里帕(Beyotime,中国)与1毫米phenylmethylsulfonyl氟在冰上。蛋白质分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和传输嵌入到PVDF膜(微孔)。我们利用5% BSA屏蔽膜在室温下2 h,紧随其后的是隔夜孵化与初级抗体(DSPP (BS70836;美国Bioworld), OPN (ab8448, Abcam,英国),RUNX2 (ab76956, Abcam,英国),OSX (ab22552, Abcam,英国),P65(# 8242,细胞信号技术,美国),p-P65(# 3033,细胞信号技术,美国),我
κB
α美国细胞信号技术(# 4814),导出
κB
α美国细胞信号技术(# 2859)、物(# 9252,细胞信号技术,美国),p-JNK(# 9255,细胞信号技术,美国),p38(# 8690,细胞信号技术,美国),p-p38(# 4511,细胞信号技术,美国),ERK(# 4695,细胞信号技术,美国),p-ERK(# 4370,细胞信号技术,美国),组蛋白H3 (Bioworld)和GAPDH(# 2118,细胞信号技术,美国))。与TBST洗后,膜与二次抗体1 h和孵化与TBST再次冲洗30分钟。最后,用免疫印迹膜进行扫描成像系统(通用电气医疗集团,北京),和蛋白质表达量化使用ImageJ软件。
2.8。实时RT-qPCR
试剂盒试剂(美国纽约英杰公司)被用来净化总RNA (tRNA)。随后,tRNA被采用转换为互补脱氧核糖核酸通过逆转录PrimeScript RT大师混合工具(豆类生物技术,中国)。接下来,rt - PCR进行使用SYBR绿色PCR反应混合液(罗氏,印第安纳波利斯)ABI 7300实时PCR系统。热循环仪被设定为95°C 30年代,40周期为5 s在95°C, 31年代和60°C。我们利用GAPDH规范化骨的/牙原性的基因的表达(即
Osx,
高山,
Runx2,
Opn,
Dspp使用2)量化−
ΔΔCT的方法。利用引物的序列提供了表
1。
感觉和实时逆转录聚合酶反义引物。
| 基因 |
引物 |
序列(5
′
3
′
) |
|
RUNX2 |
向前 |
TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT |
| 反向 |
TGCTTTGGTCTTGAAATCACA |
|
|
OSX |
向前 |
CCTCCTCAGCTCACCTTCTC |
| 反向 |
GTTGGGAGCCCAAATAGAAA |
|
|
高山 |
向前 |
ACCTGAGTGCCAGAGTGA |
| 反向 |
CTTCCTCCTTGTTGGGTT |
|
|
GAPDH |
向前 |
GAAGGTGAAGGTCGGAGTC |
| 反向 |
GAGATGGTGATGGGATTTC |
2.9。免疫荧光染色
伴着被播种到10毫米2无菌玻璃盖玻片和增长了72 h。接下来,他们固定使用4% PFA 30分钟和permeabilized使用Triton x - 100解决方案12分钟。我们采用正常山羊血清(DCS / BioGenex,汉堡,德国)阻止细胞为30分钟37°C,紧随其后的是隔夜孵化在4°C的主要抗体高山,RUNX2, P65, p-JNK p-p38, p-ERK。孵化后,细胞与二次共轭抗体在黑暗中1 h。我们复染色细胞核与DAPI (Beyotime,中国),然后检查在倒置荧光显微镜下观察。
2.10。统计分析
每个测试进行了一式三份。数据报告
的意思是
±
SD
。结果被单向方差分析或检查学生的
t
以及。统计学意义是设置为水平
p
≤
0。
。使用SPSS 20.0软件进行统计分析。
3所示。结果
3.1。最佳iRoot SP浓度
主要综合培养三天图所示
1(一)。细胞纺锤状形态(图
1 (b))。综合处理0.2毫克/毫升SPshowed最高的高山upregulation酶活性与其他组相比(
p
<
措施
;图
1 (c))。高山基因表达显示bmsc与0.2毫克/毫升SP集团培养表达式(最高
p
<
措施
;图
1 (d))。因此,0.2毫克/毫升被选为最佳浓度。
最佳剂量和iRoot SP对BMSC扩散的影响。(一)主要与纤维母细胞bmsc——或spindle-like形态。(b)细胞通道3。
规模
酒吧
=
One hundred.
μ
毫克ydF4y2Ba
。(c)高山bmsc的活动培养与不同浓度的SP在第五天。
∗
∗
∗
p
<
措施
。(d) iRoot SP在0.2毫克/毫升大大促进了高山mRNA表达5天后bmsc与对照组相比。
∗
∗
∗
p
<
措施
。(e, f)流式细胞仪(FCM)分析控制和SP-treated bmsc。(g) 9天后,CCK-8试验显示之间没有显著的差异在细胞增殖0.2毫克/毫升SP-treated bmsc和未经处理的综合。
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3.2。SP对BMSC扩散的影响
流式细胞仪显示增殖指数(微不足道的差异
π
=
G
2
米
+
年代
SP组和对照组之间)(数据
1 (e)和
1 (f))。bmsc的CCK-8试验表明,扩散不受培养与SP(图
1 (g))。
3.3。iRoot SP增强骨的bmsc /牙原性的分化
免疫印迹是用来评估SP的影响骨的bmsc /牙原性的分化。相关内容的牙质sialophosphoprotein (DSPP) osterix (OSX),骨桥蛋白(OPN)和runt-related转录因子2 (RUNX2)调节下SP治疗(图
2(一个);
p
<
. 01
)。的基因表达水平
Dspp,
Opn,
Runx2,
高山,
Osx也增强(图
2 (b);
p
<
. 01
)。高山染色和定量显示SP表达水平升高bmsc有或没有成骨分化培养基(图
2 (c);
p
<
措施
)。值得注意的是,更多的矿化结节观察孵化后SP(图14天
2 (d);
p
<
措施
)。荧光成像技术发现了类似的趋势的高山和RUNX2表达式(图
2 (e);
p
<
措施
)。在一起,这些发现表明,SP促进了骨的bmsc /牙原性的分化。
SP影响骨的bmsc /牙原性的分化。(一)免疫印迹被用来调查DSPP, OPN, RUNX2, OSX蛋白表达在天0,3和7。ImageJ灰度检测蛋白质的乐队。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(b) rt - pcr证实相对基因表达在对照组,以及SP集团,在天0 3和7。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(c)高山染色和高山活动为对照组,SP, MM组和
毫米
+
0.2
毫克
/
毫升
SP小组第七天。
规模
酒吧
=
One hundred.
μ
毫克ydF4y2Ba
。
∗
∗
∗
p
<
措施
。(d)茜素红染色和共产党的试验数据在不同的组。
规模
酒吧
=
One hundred.
μ
毫克ydF4y2Ba
。
∗
∗
∗
p
<
措施
。(e)免疫荧光染色的高山和RUNX2 SP-treated bmsc。
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3.4。iRoot SP激活NF -κ<斜体> < /斜体> B bmsc的途径
识别分子变化SP-treated bmsc,细胞培养与SP 0, 30岁,60岁,90分钟,细胞质和核蛋白质被提取。分析显示,我的磷酸化水平
κB
α和P65增强,30分钟达到最高水平,而胞质
κB
α和核P65水平下降后30分钟的接触然后增加(图
3(一个);
p
<
0。
)。疣状显示,核P65进行30分钟(图
3 (b))。综上所述,这些研究结果表明NF - SP激活
κ在bmsc B通路。
影响iRoot SP的NF -
κbmsc的B级联。(一)蛋白表达的我
κB
α导出,
κB
α、P65 p-P65的细胞质和核P65 SP-treated bmsc在不同的时间点。GAPDH是用作内部控制。灰度评价ImageJ的蛋白质。
∗
p
<
0。
,
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。核P65 (b)免疫荧光分析在不同的时间点。
规模
酒吧
=
50
μ
毫克ydF4y2Ba
。(c)细胞质P65蛋白浓度,p-P65,我
κB
α导出,
κB
α,以及核P65 NC组SP组和SP + BMS345541组30分钟。GAPDH和组蛋白3被用作内部控制。灰度评价蛋白质由ImageJ乐队。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(d)基因表达的Dspp Opn, Runx2, Osx NC组中,SP组和SP + BMS345541组30分钟。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(e)的蛋白表达DSPP OPN, RUNX2, OSX不同群体在第七天。
∗
p
<
0。
,
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(f)高山BMS345541 + SP染色和高山酶活动组和SP组后5天。
规模
酒吧
=
One hundred.
μ
毫克ydF4y2Ba
。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(g)数据bmsc的茜素红S染色不同的基团。吸光度测量评价矿化的程度。
规模
酒吧
=
One hundred.
μ
毫克ydF4y2Ba
。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。
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3.5。抑制NF -κ<斜体> < /斜体> B通路下调骨的/牙原性的分化SP-Treated bmsc
阐明NF -的功能
κB级联的分化SP-treated bmsc,抑制因子(BMS345541)是利用。结果显示,我的磷酸化
κB
α和P65被抑制,而核易位P65被提拔。这些结果表明NF -
κ(图B通路阻塞
3 (c);
p
<
. 01
)。的基因表达
Dspp,
Opn,
Runx2,
OsxSP +抑制剂的手臂被大大抑制相对于SP手臂(数字
3 (d)和
3 (e),
p
<
. 01
)。此外,高山的表达很低在治疗BMS345541(图
3 (f);
p
<
措施
)。统计上显著的减少也对茜素红S染色观察SP +抑制剂手臂(图
3 (g);
p
<
措施
)。总的来说,这些发现表明NF -
κB级联激活在SP-treated bmsc。
3.6。在bmsc iRoot SP激活MAPK级联
检查MAPK信号级联的贡献在骨的/牙原性的分化SP-treated bmsc,蛋白质的存在SP(0) 15、30、60分钟被免疫印迹证实。结果表明,SP p-JNK表达的增加,p-p38, p-ERK后15分钟,但随后表达减少时间的方式(图
4(一),
p< . 01)。
iRoot SP激活bmsc的MAPK级联。(一)蛋白质浓度的物、phospho-JNK P38, p-p38, ERK和p-ERK SP-treated bmsc和定量分析的比率在不同的时间点。
∗
p
<
0。
,
∗
∗
p
<
. 01
。(b)的表达MAPK-related蛋白级联处理阻遏蛋白(SP: SP600125,某人:SB203580, U: U0126)研究通过免疫印迹。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。P-JNK (c)免疫荧光染色,p-p38, P-ERK后抑制MAPK级联。
规模
酒吧
=
50
μ
毫克ydF4y2Ba
。(d)免疫印迹的评估骨的/牙原性的蛋白质在不同群体在第七天。使用ImageJ定量分析蛋白质的乐队了。
∗
p
<
0。
,
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(e)的MRNA表达骨的/牙原性的differentiation-associated基因被rt - pcr量化。
∗
p
<
0。
,
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(f)高山染色和量化的高山酶活性的bmsc与完全培养基培养,SP, SP + SB203580, SP + SP600125, SP + U0126 5天。
规模
酒吧
=
One hundred.
μ
毫克ydF4y2Ba
。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。(g)钙结节茜素红染色和量化分析在不同的群体在不同的时间点。
规模
酒吧
=
One hundred.
μ
毫克ydF4y2Ba
。
∗
∗
p
<
. 01
,
∗
∗
∗
p
<
措施
。
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3.7。抑制MAPK级联压抑SP-Treated BMSC的骨的/牙原性的分化
免疫印迹和免疫荧光分析表明,治疗后与抑制剂(SP600125 SB203580,或U0126),表达p-JNK, p-p38, p-ERK表达被抑制。这些结果证实,MAPK通路受阻(数字
4 (b)和
4 (c);
p
<
. 01
)。相对骨的/牙原性的标记进行了SP +抑制剂组和发现明显降低相对于SP集团(数字
4 (d)和
4 (e);
p
<
. 01
)。如数据所示
4 (f)和
4 (g),高山水平和钙结节与SP种植后表现出较低的表达值。
4所示。讨论
伴着的是一个有前途的msc来源组织工程再生方法,包括再生疗法(RET) [
24]。伴着有可能分化成成,他们可以再生dentin-like组织(
25]。即使不成熟的牙齿没有纸浆和根尖周的组织
在体外受潮湿腐烂后,骨突在运河里空间,这表明可能源自骨髓的细胞(
26]。先前的研究已经证明了多向分化、组织分化潜能(
27,
28),和骨生成
29日bmsc的]。
iRoot SP是已知好cytocompatibilities提高成矿MG63细胞(
30.),增强牙原性的分化hTGSCs [
7),促进成骨细胞的分化hPDLCs [
8),和现在没有或低纤维母细胞细胞株的细胞毒性
31日]。能量色散x射线能谱(EDX)已经被用于分析iRoot SP的组成,发现氧(O),钙(Ca),锆(Zr),碳(C),硅(Si)。溶解性测试后,EDX显示下降的Ca O, Si和调节Zr值(
32]。钙起着至关重要的作用在调节细胞的生物学行为。几项研究已经证实,提高钙的释放bmsc的增殖和诱导成骨分化
33]。此外,钙可能激活成骨细胞ERK和p38 MAPK通路和启动Ras-MAPK信号通路通过招募Src激酶和Sh酪氨酸磷酸化
34]。钙可以引发各种信号通路,比如NF -
κB通路,通过calcium-sensing受体(CaSR) [
35]。的运动能促进生物矿化硅(
36)和增加成骨的活动(
37]。一般来说,钙和硅离子释放的钙silicate-based材料影响细胞的生物学行为(
38]。这些洗出液模拟临床条件细胞和材料使间接接触通过血凝块
39和可以轻松方便地观察和分析
40]。在当前的研究中,制备了材料洗出液后ISO 10993 - 538
41如前所述(
42]。
高山,为骨的早期生命指标/牙原性的分化,与成矿有密切的关系(
43]。浓度为0.2毫克/毫升iRoot SP被发现是最优的,基于峰值活动和高山的mRNA水平。然而,bmsc的增殖能力不会受到0.2 mg / ml iRoot SP。我们发现的表达骨的/牙原性的生物特征(OPN、RUNX2 OSX, DSPP)显著增加,矿化明显调节下周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗。的转录因子早期牙原性的分化,即Runx2 Osterix,负责骨骼发育(
44,
45]。OPN扮演一个关键的角色在成骨分化的中间阶段(
46),而DSPP充当终端分化成的标志(
47]。我们发现牙发生的调节主调节器和骨生成显示的显著影响iRoot SP bmsc的相对差异。然而,体外研究不能复制动态的环境
48];iRoot SP体内的影响应进一步研究。根据植入设备的标准化与骨或血液接触,进一步研究iRoot SP基因毒性、致敏、和组织植入测试将提供一个更准确的理解材料(
49]。我们相信这些发现的随机临床试验应该进一步调查克洛维Mariano Faggion jr .)报告(
48]。
在MAPK激酶家族已知引起细胞反应的细胞(细胞外信号传输
50]。MAPK家族包括细胞外调节激酶(ERK) c-Jun n端激酶(物),和p38。一些刺激,如MagT1 [
51)和硅酸二钙微粒(in)为基础的生物材料,可以通过MAPK通路促进MSC分化
52]。我们的研究结果表明,它们的磷酸化水平调节的iRoot SP和抑制特定抑制剂SB203580 SP600125, U0126。这些发现表明骨的/牙原性的分化是增强通过MAPK通路iRoot SP。
NF -
κ家庭由五名成员,即p65 RelB,:, p50, p52,扮演了一个重要的角色在细胞增殖、分化和细胞凋亡
53]。在大多数细胞,NF -
κB细胞质中的蛋白质是本地化和与我的抑制剂家族蛋白
κb我的开始
κ我复杂磷酸化激酶(IKK)
κB蛋白,导致我的polyubiquitination
κ随后,》
κB蛋白由26 s蛋白酶体降解,导致的核易位NF -
κB (
54]。我们的研究结果表明,通过提升我
κB磷酸化和易位P65进入细胞核,iRoot SP激活NF -
κB bmsc的途径。
值得注意的是,各种相互作用和NF -之间的关系存在
κB通路和MAPK通路。P38、物和ERK据报道使磷酸化各种基质和导致激活的转录因子NF -
κB;换句话说,NF -
κB是MAPK的下游信号(
55]。有人提议刺激增殖作用的蛋白激酶(MAP3K)家庭激发IKK活动,NF -一个关键步骤
κB级联。例如,不同的磷酸化
κB
α在Ser-32 Ser-36增殖诱导的蛋白激酶/ ERK激酶激酶1 (MEKK1)
在活的有机体内但是,我
κB激酶复杂
在体外(
56]。刘等人报道,SB203580抑制我的退化
κB
α,确认在NF - p38的参与
κB激活(
57]。此外,ERK可以减少NF -
κB通过Nrf2激活/ HO-1通路(
58]。NF -
κB感应可能触发物的合成通路抑制剂,这意味着相当大的抵消NF -之间的关系
κB和物(
59]。然而,这种关系并不是完全对立的,他们coregulate cIAP1抗凋亡蛋白的表达
60]。