尼洛替尼联合干细胞条件培养基对CCl的抗纤维化作用₄全身的肝纤维化

摘要

肝纤维化是由慢性肝病引起的细胞外基质蛋白(如胶原蛋白)的过度积累。晚期肝纤维化会导致肝硬化和肝衰竭。Nilotinib是第二代酪氨酸激酶抑制剂，具有抗纤维化作用。干细胞治疗仍有一些局限性，如肿瘤发生、意外分化和伦理考虑。干细胞分泌细胞因子和生长因子，在体内和体外显示副分泌介导的抗纤维化和抗炎作用。因此，含有干细胞分泌蛋白的干细胞条件培养基(SC-CM)可能具有抗纤维化作用。本研究旨在研究Nilotinib和干细胞外泌体对CCl的抗纤维化作用₄-诱导大鼠肝纤维化雄性Wistar大鼠腹腔注射CCl₄每周2次，共9周，每日给予尼洛替尼(20 mg/kg)、干细胞外泌体(0.5 ml/大鼠)，CCl最后5周联合给予尼洛替尼和干细胞外泌体治疗₄中毒。通过肝功能检查、氧化应激参数、凋亡参数、组织病理学检查和羟脯氨酸含量来评估治疗的肝纤维化和抗纤维化效果。结果显示，尼洛替尼和干细胞条件培养基联合使用比单独使用更具有抗纤维化作用(值< 0.001)。

1.介绍

纤维化是大多数肝病的一个常见病理过程，导致肝硬化和/或肝细胞癌。它是几乎所有慢性肝病的结果，主要由病毒、酒精诱导、自身免疫和代谢病因引起[1]。纤维化源于不受控制的伤口愈合，其特征是功能性肝组织被高度交联的富含I/ iii胶原的细胞外基质进行性取代;它破坏了肝脏的正常结构和功能，特别是在肝硬化的末期。纤维化也被认为是一种癌前状态，它为原发性肿瘤的发生提供了微环境[2]。

酪氨酸激酶激活已参与纤维化。酪氨酸激酶有牵连的各种细胞活动，包括分化，凋亡，代谢和生长[3.]。磷酸化的酪氨酸残基是这些酶使用ATP的共同作用方式。有两类酪氨酸激酶:受体酪氨酸激酶，如PDGF受体，和非受体酪氨酸激酶，如Abelson激酶(c-Abl)。除了酪氨酸激酶的生理作用外，最近的研究显示它们在肿瘤发生、病理生理学、纤维形成、类风湿关节炎和血管重构中发挥激活作用。因此，阻断酪氨酸激酶活性的抑制剂可能有助于这些疾病的治疗[4]。

引进酪氨酸激酶抑制剂治疗，以伊马替尼的形式(1)^ST代TKIs)，已显著改善患者的结果与慢性髓细胞白血病(CML)。Nilotinib属于第二代TKIs。旨在克服伊马替尼在慢性粒细胞白血病(CML)中的耐药性[5]。

多项研究表明Nilotinib可以通过调节促炎细胞因子，主要是白细胞介素- (IL-) 1和IL-6的水平来控制肝纤维化[6- - - - - -9]。在早先的研究中，我们在他们的抗纤维化药物的效果相比，尼罗替尼，伊马替尼，和水飞蓟素[4]。我们发现，尼洛替尼比水飞蓟素比伊马替尼和更好毒性较低，而且，我们发现，通过组蛋白脱乙酰的抑制[激活的肝星状细胞的尼洛替尼诱导细胞凋亡和自噬性细胞死亡7]。我们还研究干细胞在肝纤维化的治疗效果，发现他们媲美尼罗替尼作为抗纤维化剂[8]。干细胞治疗的应用仍然存在许多障碍，如致癌性;除了伦理考虑之外，它可能会产生意想不到的分化[10]。

干细胞在条件培养基中以旁分泌方式释放几种产物，如细胞外囊泡(EVs) [10]。细胞分泌的胞外小泡通常定义为微泡、细胞来源小泡、微颗粒、脱落小泡和外泌体[10]。外来体是含有进化上保守的组蛋白，包括四次跨膜蛋白（CD81，CD63，和CD9），热休克蛋白（HSP60，HSP70和HSP90），和肿瘤易感基因101的，并已被报道具有多种功能，包括血管生成的脂质囊泡，细胞增殖，和减少胶原[11]。

多项研究发现间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)对肝纤维化有治疗作用[12,13]。此外，一些临床试验正在评估MSC-CM的治疗潜力，并确定最佳剂量、外泌体的适当给药时间，以及既能获得最大疗效又不引起不良反应的给药途径[14,15]。本工作的目的是研究尼洛替尼联合mc - cm对CCl的抗纤维化作用₄-诱导大鼠肝纤维化

2.材料和方法

2.1。实验动物

本研究选用60只雄性Wistar大鼠，体重180-200克。大鼠取自埃及曼苏拉大学医学院医学实验研究中心(MERC)。它们在8-10周大时被安置在医学实验研究中心(MERC)的受控环境中 , relative humidity, and a 12 h light/dark cycle. Rats were kept for one week prior to the experiment for adaptation to the new environment. Rats were kept in cages (5 rats per 1 cage) at constant environment and nutritional condition throughout the period of the experiment. All rats received humane care according to the National Institutes of Health criteria for care of laboratory animals. All the animal experiments were conducted at MERC by veterinary doctors in summer 2018.

2.2。研究设计

将实验动物用社会科学（SPSS）程序的Windows（标准版21）的统计软件包分配到组。将大鼠随机分成6组主要（10个）如下。Group I (healthy control): rats received 1 ml/kg corn oil twice a week for 9 weeks. Group II (CCl₄group): rats received 1 ml/kg of 50% ( )创新领导力₄溶液在橄榄油，每周两次持续9周[16]。Group III (free media group): rats received 1 ml/kg of 50% ( )创新领导力₄在CCl的最后5周，橄榄油溶液+游离外泌体培养基(胎牛血清)(注射在大鼠尾静脉，剂量为0.5 ml/大鼠/天)₄中毒。IV族（CCL₄+Nilotinib:大鼠接受1 ml/kg 50% ( )创新领导力₄橄榄油溶液+尼罗替尼(原AMN107;Tasigna®)，由诺华公司(瑞士巴塞尔)慷慨提供。尼洛替尼的剂量是20毫克/公斤/天，1% in saline, 1 ml/kg by gavage during the last 5 weeks of CCl₄中毒[4]。CCl组V (₄+干细胞外泌体:大鼠接受1 ml/kg 50% ( )创新领导力₄solution in olive oil+stem cell exosomes (injected in the rats’ tail vein at a dose of 0.5 ml/rat/day) during the last 5 weeks of CCl₄中毒[17]。CCl组六世(₄+干细胞液+ Nilotinib): rats received 1 ml/kg of 50% ( )创新领导力₄solution in olive oil+stem cell exosomes (injected in the rats’ tail vein at a dose of 0.5 ml/rat/day)+Nilotinib (20 mg/kg/day, 1% in saline, 1 ml/kg by gavage) during the last 5 weeks of CCl₄中毒。

各组大鼠在硫贲妥全身麻醉下处死。进行了剖腹手术和肝切除术。心脏穿刺取血，2000 g离心10 min，制备血清。肝脏样本被切成两半。一半保存在甲醛中作组织病理学检查，另一半保存在液氮中作其他检查。

2.3。干细胞培养介质的制备

从Wistar大鼠肝脏中分离的肝间充质干细胞在PBS中广泛洗涤。将肝片切碎，在补充胶原酶(2 mg/ml)的alpha-MEM中37℃孵育60 min，胰酶(10 mg/ml)孵育45 min。消化完成后，将样品悬浮于10 ml alpha-MEM中，500 g离心10 min回收细胞。这个步骤重复了两次。将细胞颗粒悬浮在10 ml alpha-MEM中，再次离心以去除血液残留物。将细胞颗粒悬浮在10ml的DMEM+10%胎牛血清+1%抗生素-抗菌溶液(Thermo Scientific, USA)中，在95%空气、5% CO的培养皿中进行选择和扩增₂37摄氏度的湿化空气。

后3次传代，将它们在10000个细胞/ cm接种²在完全培养基中培养一天。肝间充质干细胞用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤3次，在无血清基础培养基(Lonza)中孵育48 h。收集上清离心，过滤，浓缩at 10分钟[18]。

2.4。肝功能价值评估

白蛋白水平和血清丙氨酸转氨酶(ALT)被估计使用商业试剂盒从生物医学诊断。

2.5。肝组织病理学评估

组织病理学检查，从各实验组动物进行。为了确定肝纤维化组织的量，肝组织9周四氯化碳的后收集₄感应。收集肝组织固定，包埋，切成10 μm厚切片，标准苏木精和伊红染色。然后用三色马尾松染色作为常规结缔组织染色。从每个切片中随机获取图像，使用ImageJ软件(1.6.0_20版，National Institutes of Health, Bethesda, MD)对纤维化区域进行定量分析[19]。

2.6。肝4-羟脯氨酸含量的测定

将肝脏标本(50 mg)水解，上清加入氯胺T溶液中孵育，加入Ehrlich溶液。最后的混合物孵育后，估计光密度为560nm。4-羟脯氨酸的表达值为μ克/克湿纸巾[20]。

2.7。肝脏氧化应激参数

2.7.1。肝丙二醛的测定

1-甲基-2-苯基吲哚被添加到肝脏匀浆样品中。加入盐酸后，样品混匀良好。样品在45℃孵育。然后对样品进行冷却和离心，估算出586 nm处的光密度[21]。

2.7.2。肝一氧化氮含量的测定

肝匀浆加入氢氧化钠，硫酸锌脱蛋白。将混合液离心，所得上清液加入VCl中_3.在HCl和Griess试剂中。孵育后，在540 nm处读取样品。一氧化氮的浓度由纳米测量_3.标准曲线(22]。

2.7.3。测量肝脏超氧化物歧化酶的活性

将肝匀浆与三盐酸混合，加入邻苯三酚。通过监测样品在420 nm处的光密度的上升，估算样品每分钟光密度的变化。在相同条件下，通过运行空白管计算样品的抑制率[23]。

2.7.4。肝过氧化氢酶活测定

肝脏匀浆用过氧化氢和甲醇孵育。酶促反应是由加入含有过氧化氢酶的样品引起的。反应混合物连续振荡孵育20分钟。加入KOH溶液终止酶促反应。吸光度在550 nm处测量[24]。

2.7.5。肝一氧化氮合酶活性的测定

将肝匀浆加入到含有羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），NADPH L-精氨酸的反应混合物中，然后孵育。一氧化氮合成酶的活性从样品和空白读数[之间的差计算25]。

2.7.6。测定肝谷胱甘肽还原酶的活性

肝脏匀浆和GSSG加入到分光光度计中。加入NADPH，在340 nm处记录吸光度。样本净率是用空白率减去空白率估计的[26]。

2.8。肝细胞凋亡标记

2.8.1。膜联蛋白V染色试验

肝细胞的悬浮液一起温育，并收集上清液并用胰蛋白酶处理贴壁细胞。用PBS洗涤并离心收集的细胞。将沉淀重新悬浮于PBS中。400 μ用膜联蛋白中加入细胞+孵育缓冲液升。将细胞用流式细胞仪进行分析而无需洗涤细胞[27]。

2.8.2。胱天蛋白酶3测定百分

制备肝细胞悬液，离心。丢弃离心后形成的上清液，将颗粒悬浮于PBS中。加入半胱天冬酶3标记物，孵育。用PBS/BSA洗涤细胞，离心，弃上清。最后将肝细胞悬浮并固定直到流式细胞术获得[28]。

2.9。统计分析

数据分析使用社会科学统计软件包(SPSS)程序的Windows(标准版本21)。首先用单样本Kolmogorov-Smirnov检验数据的正态性。连续变量表示为 (标准差)为参数数据。以上两组均数比较采用方差分析检验，并进行配对 -测试是用来比较成对数据。Pearson相关被用于关联的连续数据。对于所有上述的统计检验，显着性的阈值被固定在5％的水平（值）。结果被认为显著时错误的概率小于5％（ )。

3.结果

3.1。尼洛替尼和干细胞外泌体治疗对肝功能检测的影响

覆铜板管理₄持续9周，导致肝脏严重受损，其特征是血清ALT活性显著升高，血清白蛋白浓度显著降低。与CCl相比，尼洛替尼和干细胞外泌体治疗组的血清ALT活性显著降低，血清ALB升高₄组。尼洛替尼的联合治疗和干细胞的外来体中表现出血清ALT和仰角的血清ALB比其他治疗组的活性的更显著减少。有没有在四氯化碳之间的血清ALT活性和ALB浓度无显着性₄组和免费媒体组(表1和2)。

3.2。尼洛替尼和干细胞外泌体对肝脏氧化应激参数的影响

覆铜板管理₄与对照组相比，引起肝脏MDA、NO、NOS明显升高。与CCl相比，Nilotinib和干细胞外泌体治疗可显著降低肝NO和NOS₄组。与CCl相比，干细胞外泌体处理略微降低了升高的肝MDA水平(不显著)₄组，但尼洛替尼治疗引起与四氯化碳相比对肝MDA一个显著减少₄组。尼罗替尼和干细胞的外来体之间的组合治疗显示出肝MDA，NO更显著减少，和NOS比其他处理组。有在MDA的四氯化碳之间没有任何意义，NO，NOS和₄组和自由媒体组(表3.)。覆铜板管理₄与对照组相比，引起肝脏过氧化氢酶、SOD和GSH含量显著降低。尼洛替尼和干细胞外泌体处理明显增加了肝SOD和GSH₄组。与CCl相比，干细胞外泌体治疗稍微提高了肝脏过氧化氢酶水平(不显著)₄组，但尼罗治疗造成了过氧化氢酶增加显著用四氯化碳相比₄组。尼洛替尼与干细胞外泌体联合处理时，肝脏过氧化氢酶、SOD和GSH水平明显高于其他处理组。过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽在CCl中无显著性差异₄组和自由媒体组(表3.)。

3.3。尼罗替尼的影响和干细胞的外来体治疗肝细胞凋亡标记

膜联蛋白V标记表明，四氯化碳的管理₄引起的凋亡细胞和坏死细胞的百分比与对照组比较，活细胞的增加显著明显降低，与对照组相比，显著。尼洛替尼和干细胞的外来体的治疗显著降低凋亡和坏死细胞和升高与四氯化碳相比的活细胞的百分比₄组。尼罗替尼和干细胞的外来体之间的组合治疗显示出凋亡和坏死细胞比其它治疗组的百分比的更显著减少。有CCl的差异无显着性₄各组和游离培养基组的活细胞、坏死细胞和凋亡细胞百分比(图)1)。CCl的₄与对照组相比，给药后半胱天冬酶3的含量显著增加。与CCl相比，Nilotinib和干细胞外泌体治疗显著降低了caspase 3的百分比₄组。尼洛替尼和干细胞外泌体联合治疗组caspase 3的百分比下降比其他治疗组更显著。有CCl的差异无显着性₄各组和自由培养基组中caspase 3的百分比(图)2)。

3.4。尼洛替尼和干细胞条件培养基对肝脏组织病理学和4-羟脯氨酸含量的影响

覆铜板管理₄持续9周引起明显的炎症、坏死和明显的大泡/微泡脂肪变性。根据Masson的三色染色切片，用CCl治疗的大鼠的纤维化评分显著升高₄与对照组比较。在尼洛替尼和干细胞外泌体治疗的大鼠中，这一增加显著降低。Nilotinib和干细胞外泌体的联合治疗显示纤维化评分比其他治疗组有更显著的降低。CCl之间无显著性差异₄组，并在纤维化评分可用媒体组（图3.和4)。

创新领导力₄与对照组相比，给药后肝羟脯氨酸明显增加。尼洛替尼组与CCl组比较，羟脯氨酸含量明显降低₄与CCl相比，干细胞外泌体处理组羟脯氨酸含量略有下降(不显著)₄组。和尼洛替尼之间的组合治疗干细胞的外来体显示出比其他治疗组的羟脯氨酸含量的更显著减少。有CCl的差异无显着性₄组和游离培养基组的羟脯氨酸水平(图)3.)。

4。讨论

这项研究表明，Nilotinib和干细胞条件培养基的联合抗纤维化作用明显高于单独使用。与单独治疗组相比，联合治疗组羟脯氨酸含量、纤维化面积、凋亡标志物和氧化应激显著降低。据我们所知，这可能是关于该联合抗纤维化作用的第一篇报道。

尼洛替尼的组合的抗纤维化效果和干细胞条件培养基可能是由于两种类型的治疗的协同效应（图5)。间充质干细胞介导的介质具有抗炎作用，可减少对肝细胞的损伤，使肝星状细胞停止活化，导致肝星状细胞凋亡和纤溶活化[11]。另一方面，间充质干细胞可使巨噬细胞极性向抗炎表型转变，增加基质金属蛋白酶的产生以减少ECM，并增强吞噬肝细胞碎片的能力(在此过程中，巨噬细胞增加了再生因子的水平)[29]。另一方面，Nilotinib通过三个主要途径参与纤维形成:抑制PDGFRS和诱导TGF-的c-Abl酪氨酸激酶活性β引起纤维形成，抑制胶原受体，下调盘蛋白结构域受体[4]，所以MSC-CM导致增加纤维蛋白溶解和尼罗替尼能降低fibrinogenesis。

关于干细胞cell-conditioned媒体,Khajehahmadi等人研究了骨骨髓来源干细胞的影响cell-conditioned介质(BMSCs-CM)在肝纤维化的硫代乙酰胺诱导雄性Wistar鼠和得出的媒体有一个积极的抗炎和治疗效果的重排肝纤维化(三十]。此外，他们报道，条件培养基给药可以克服干细胞移植的免疫反应性、基因组不稳定性、意想不到的分化和致癌性[三十]。

此外,我们的结果是同意Chen等人研究的影响MSC-CM cocultured与肝细胞D-galactosamine所致急性肝功能衰竭(ALF)的老鼠,然后,结果表明,间充质干细胞cell-conditioned媒体,集肝细胞和干细胞的治疗潜力,在促进受损肝细胞的恢复性能优越和扭转D-galactosamine-induced阿尔夫(31]。

关于Nilotinib，我们的数据与Qu等人的报告一致，他们认为Nilotinib在治疗肝纤维化方面具有潜力，与其他酪氨酸激酶相比，其危害性最小[32，这些结果与我们之前的数据相匹配，这些数据证明尼洛替尼作为抗纤维化药物比伊马替尼更安全，这在降低肝脏羟脯氨酸含量、氧化应激和组织病理学上都很明显[4]。

在我们的研究中，我们通过对肝组织进行定量图像分析进一步证实了这种抗纤维化作用，这种方法比定性和半定量方法更有效[19]。无论尼罗替尼和干细胞培养的媒体表现出抗纤维化作用，但是尼罗替尼和对四氯化碳干细胞培养介质处理之间没有显著差异₄-诱导大鼠肝纤维化然而，有联合治疗和单独每一个之间的高显著差异（值< 0.001)。

这项工作的优势在于使用了两种不同的治疗方式，它们被证明具有协同效应，并且安全，为其在临床试验中的潜在应用铺平了道路。此外，我们工作中对纤维化区域的定量图像分析为正确评价治疗药物的抗纤维化作用提供了更多的证据，使比较更加准确。

我们工作的局限性在于它是一个单中心的经验，这需要在其他中心的验证。此外，我们研究了MSC-CM的效果作为一个整体，而这是不同的外来体的混合物，和我们的工作并没有显示具体的外来体或有这种抗纤维化效果并没有表现出特定的活性成分，其负责抗纤维化作用。

五，结论

尼洛替尼与干细胞条件下的培养基结合显示出协同效应，比单独使用更有效的抗纤维化作用。这两种联合疗法的安全性使其可以用于临床试验。

数据可用性

支持本研究结果的原始数据可从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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