肝纤维化是由慢性肝病引起的细胞外基质蛋白(如胶原蛋白)的过度积累。晚期肝纤维化会导致肝硬化和肝衰竭。Nilotinib是第二代酪氨酸激酶抑制剂,具有抗纤维化作用。干细胞治疗仍有一些局限性,如肿瘤发生、意外分化和伦理考虑。干细胞分泌细胞因子和生长因子,在体内和体外显示副分泌介导的抗纤维化和抗炎作用。因此,含有干细胞分泌蛋白的干细胞条件培养基(SC-CM)可能具有抗纤维化作用。本研究旨在研究Nilotinib和干细胞外泌体对CCl的抗纤维化作用
纤维化是大多数肝病的一个常见病理过程,导致肝硬化和/或肝细胞癌。它是几乎所有慢性肝病的结果,主要由病毒、酒精诱导、自身免疫和代谢病因引起[
酪氨酸激酶的激活参与了纤维的形成。酪氨酸激酶参与多种细胞活动,包括分化、凋亡、代谢和生长[
引进酪氨酸激酶抑制剂治疗,以伊马替尼的形式(1)
多项研究表明Nilotinib可以通过调节促炎细胞因子,主要是白细胞介素- (IL-) 1和IL-6的水平来控制肝纤维化[
干细胞在条件培养基中以旁分泌方式释放几种产物,如细胞外囊泡(EVs) [
多项研究发现间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)对肝纤维化有治疗作用[
本研究选用60只雄性Wistar大鼠,体重180-200克。大鼠取自埃及曼苏拉大学医学院医学实验研究中心(MERC)。它们在8-10周大时被安置在医学实验研究中心(MERC)的受控环境中
将实验动物用社会科学(SPSS)程序的Windows(标准版21)的统计软件包分配到组。将大鼠随机分成6组主要(10个)如下。Group I (healthy control): rats received 1 ml/kg corn oil twice a week for 9 weeks. Group II (CCl4组:灌胃1 ml/kg 50% ( 各组大鼠在硫贲妥全身麻醉下处死。进行了剖腹手术和肝切除术。心脏穿刺取血,2000 g离心10 min,制备血清。肝脏样本被切成两半。一半保存在甲醛中作组织病理学检查,另一半保存在液氮中作其他检查。
从Wistar大鼠肝脏中分离的肝间充质干细胞在PBS中广泛洗涤。将肝片切碎,在补充胶原酶(2 mg/ml)的alpha-MEM中37℃孵育60 min,胰酶(10 mg/ml)孵育45 min。消化完成后,将样品悬浮于10 ml alpha-MEM中,500 g离心10 min回收细胞。这个步骤重复了两次。将细胞颗粒悬浮在10 ml alpha-MEM中,再次离心以去除血液残留物。将细胞颗粒悬浮在10ml的DMEM+10%胎牛血清+1%抗生素-抗菌溶液(Thermo Scientific, USA)中,在95%空气、5% CO的培养皿中进行选择和扩增
后3次传代,将它们在10000个细胞/ cm接种
白蛋白水平和血清丙氨酸转氨酶(ALT)被估计使用商业试剂盒从生物医学诊断。
对各实验组动物进行组织病理学检查。为测定肝纤维化组织的数量,在CCl治疗9周后收集肝组织
将肝脏标本(50 mg)水解,上清加入氯胺T溶液中孵育,加入Ehrlich溶液。最后的混合物孵育后,估计光密度为560nm。4-羟脯氨酸的表达值为
1-甲基-2-苯基吲哚被添加到肝脏匀浆样品中。加入盐酸后,样品混匀良好。样品在45℃孵育。然后对样品进行冷却和离心,估算出586 nm处的光密度[
肝匀浆中加入氢氧化钠,和用于脱蛋白的溶液中加入硫酸锌。将该混合物离心分离,将得到的上清液加入到的VCl
将肝匀浆与三盐酸混合,加入邻苯三酚。通过监测样品在420 nm处的光密度的上升,估算样品每分钟光密度的变化。在相同条件下,通过运行空白管计算样品的抑制率[
肝脏匀浆用过氧化氢和甲醇孵育。酶促反应是由加入含有过氧化氢酶的样品引起的。反应混合物连续振荡孵育20分钟。加入KOH溶液终止酶促反应。吸光度在550 nm处测量[
将肝脏匀浆加入含羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、NADPH l -精氨酸的反应混合物中孵育。一氧化氮合酶的活性由样品和空白读数的差值计算[
肝脏匀浆和GSSG加入到分光光度计中。加入NADPH,在340 nm处记录吸光度。样本净率是用空白率减去空白率估计的[
培养肝细胞悬浮液,收集上清,胰蛋白酶化贴壁细胞。收集的细胞用PBS洗涤,离心。小球在PBS中重悬。400年
制备肝细胞悬液,离心。丢弃离心后形成的上清液,将颗粒悬浮于PBS中。加入半胱天冬酶3标记物,孵育。用PBS/BSA洗涤细胞,离心,弃上清。最后将肝细胞悬浮并固定直到流式细胞术获得[
数据分析使用社会科学统计软件包(SPSS)程序的Windows(标准版本21)。首先用单样本Kolmogorov-Smirnov检验数据的正态性。连续变量表示为
CCl的管理
CCl的管理
Annexin V标记显示给予CCl
CCl的管理 实验组的组织病理学检查。
创新领导力
这项研究表明,Nilotinib和干细胞条件培养基的联合抗纤维化作用明显高于单独使用。与单独治疗组相比,联合治疗组羟脯氨酸含量、纤维化面积、凋亡标志物和氧化应激显著降低。据我们所知,这可能是关于该联合抗纤维化作用的第一篇报道。
Nilotinib和干细胞条件培养基的联合抗纤维化作用可能是由于两种治疗的协同作用(图) MSC-MC和Nilotinib联合抗纤维化的潜在协同效应。
关于干细胞cell-conditioned媒体,Khajehahmadi等人研究了骨骨髓来源干细胞的影响cell-conditioned介质(BMSCs-CM)在肝纤维化的硫代乙酰胺诱导雄性Wistar鼠和得出的媒体有一个积极的抗炎和治疗效果的重排肝纤维化(
此外,我们的结果与陈等人,谁研究的MSC-CM的效果共培养与大鼠d-半乳糖急性肝衰竭的肝细胞(ALF),然后协议,结果表明,间充质干细胞培养媒体,它集成了肝细胞的治疗潜力和干细胞,促进损伤的肝细胞的恢复和扭转d半乳糖胺诱导的ALF [具有优异的性能
关于尼罗替尼,我们的数据与瞿秋白等人一致。谁报告说,尼罗替尼有潜力相比其它酪氨酸激酶[用最少的有害影响治疗肝纤维化
在我们的研究中,我们通过对肝组织进行定量图像分析进一步证实了这种抗纤维化作用,这种方法比定性和半定量方法更有效[ 这项工作的优势在于使用了两种不同的治疗方式,它们被证明具有协同效应,并且安全,为其在临床试验中的潜在应用铺平了道路。此外,我们工作中对纤维化区域的定量图像分析为正确评价治疗药物的抗纤维化作用提供了更多的证据,使比较更加准确。
我们工作的局限在于,这是一个单中心的经验,需要在其他中心进行验证。此外,我们对MSC-CM的作用进行了整体研究,而它是不同外泌体的混合物,我们的研究没有显示出特异的外泌体或哪些外泌体具有这种抗纤维化作用,也没有显示出负责抗纤维化作用的特异活性成分。
尼洛替尼与干细胞条件下的培养基结合显示出协同效应,比单独使用更有效的抗纤维化作用。这两种联合疗法的安全性使其可以用于临床试验。
支持本研究结果的原始数据可从通讯作者处获得。
作者声明他们没有利益冲突。