间充质干细胞分泌体促进角膜内皮细胞增殖的实验研究

摘要

体外培养的人角膜内皮细胞(HCEnC)是一种新的治疗方法，旨在缓解目前全球供体短缺的视力受损患者。扩大HCEnC仍然具有挑战性，获得足够数量的细胞是一个限制因素。我们已经知道骨髓间充质干细胞获得的条件培养基可以刺激内皮细胞的增殖。这项研究的目的是进一步确定一些潜在的影响因素。我们证实了之前看到的间充质干细胞分泌体的刺激作用，并使用大小排斥色谱法从可溶性蛋白中分离出外泌体。我们分别用透射电子显微镜和蛋白质分析证明了早期和晚期组分中存在外泌体和可溶性蛋白。增殖研究表明，生长刺激可以用后期富含蛋白质的部分复制，但不能用富含外泌体的部分。抗体检测显示在高蛋白组分中存在分泌蛋白EGF、IGFBP2和IGFBP6，但在纯化蛋白配方中未见生长增强。总之，我们证实了干细胞条件培养基的刺激作用，并确定了这种作用是由蛋白质而不是外泌体引起的。然而，我们无法复制生长刺激，用纯重组蛋白候选测试。 Specific identification of the underlying proteins using proteomics could render a bioactive protein that can be used for离体细胞的膨胀或作为在活的有机体内治疗早期角膜内皮损伤的药物。

1.介绍

角膜内皮是角膜的内层细胞，负责维持角膜的水合作用和透明度。细胞形成单一的单分子层，具有典型的六角形形态，并通过假定的泵-漏机制调节电解质和水流[1］.人们普遍认为，这些细胞在体内不具备分裂能力，因此，人类角膜内皮细胞(hencs)的绝对数量只会随着时间的推移而下降[2］.例如，白内障手术或特定疾病(如富氏营养不良症)引起的手术创伤可加速细胞丧失。当内皮细胞密度降至某一阈值(任意设置为500个细胞/mm)以下时²)，其余细胞无法完成其功能，水分被动地进入角膜，导致角膜水肿。如果不能逆转，患者将发展为大疱性角膜病变，其特征是视力下降和疼痛。

目前，治疗这些患者的唯一方法是角膜内皮移植，这是一项成熟、非常成功的技术，约占所有角膜移植的40%[3.］.不幸的是，目前由于全球供体短缺、缺乏全球物流供应链和角膜库，这些移植的获取受到了限制。克服这些问题的一个可能的策略是在实验室中对内皮层进行组织工程。该产品将由体外培养的hencs在适合移植的细胞支架上组成[1，4，5］.尽管支架方法是最常被探索的方法，细胞悬浮疗法也在11例患者中进行了试验[6，7］.

无论采用何种交付方法，将hccs扩展到再生医学方法所需的足够高的数量仍然非常困难。这一困难使得对诱导扩散物质的研究成为一个非常活跃的领域，在过去十年中已经发现了一些成功的候选物质。ROCK抑制剂Y-27632、核catenin p120和p38有丝裂原激活蛋白激酶抑制剂都显示出作为内皮生长促进剂的前景，尽管在这些疗法成为主流之前需要更大量的细胞扩张[8- - - - - -10］.

当寻找新的假定的生长刺激物时，间充质干细胞(MSCs)是一个有趣的治疗选择。此前已经发现，虽然MSC移植确实对心肌细胞产生了有益的影响，但这是由于旁分泌效应，而不是通过分化积极参与组织再生[11］.这一发现激发了利用“分泌组”或细胞的蛋白质分泌物进行组织再生的想法，而不是指望细胞本身再生组织[12].该策略已被用于通过条件培养基（即干细胞培养基）通过干细胞刺激角膜内皮细胞生长，该培养基已在干细胞中生长了一段时间[13］.在培养过程中，干细胞释放大量的可溶性蛋白(生长因子和细胞因子)、细胞外基质蛋白和各种细胞外囊泡。后者可以根据凋亡小体、微泡和外泌体的大小和生物发生进一步细分[12］.特别是含有蛋白质、m(i)RNA和脂质等信号分子的外泌体，在再生医学领域受到了极大的关注。事实上，它们是基本细胞过程的有效介质，并与抗原呈递、细胞存活和增殖等有关[14，15］.

分泌组的特异性表达谱强烈依赖于培养环境，即细胞底物、基础培养基和补充物[16］.虽然这种强化的“条件”培养基已经被证明能刺激角膜内皮细胞增殖，但导致这种效应的潜在成分尚不清楚[13，17- - - - - -20.].从药物监管和患者安全的角度来看，识别生物活性化合物以便对其进行精制和量化是很重要的[16］.这就是为什么我们的目标是找出骨髓源性间充质干细胞分泌组中刺激角膜内皮细胞增殖的确切化合物。在鉴定的化合物(蛋白质或液),它可以很容易地实现当前培养基体外内皮细胞的扩张产生角膜内皮细胞表或甚至可以进一步发展为局部滴眼剂刺激内皮伤口愈合等岩石抑制剂(21］.

2.材料和方法

2．1．细胞培养

骨髓源性干细胞(BM MSC)是由Veneto Eye Bank基金会Stefano Ferrari教授提供的友好礼物，并经Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata Verona伦理委员会知情同意从健康捐赠者中分离。骨髓间充质干细胞可以附着在培养瓶上，从骨髓标本中分离出来。根据Krampera和同事描述的方法，对BM MSC的分离和表征进行了详细的描述[22］.骨髓间充质干细胞在添加了10%胎牛血清、两性霉素B和庆大霉素的DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中培养，培养基每隔一天更新一次。所有的实验都是在由两个不同的供体产生的条件培养基中进行的，只使用第6代之前的细胞。

B4G12人永生化角膜内皮细胞购自德国Sammlung von mikro有机体und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)，并根据其说明书进行少量修饰培养。将B4G12细胞接种到涂有FNC涂层混合物的塑料上(Athena Enzyme Systems, Baltimore, USA)，生长培养基由人内皮细胞SFM添加10 ng/mL bFGF (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)组成，不含任何抗生素。

所有培养基每隔一天更新一次，使用Trypsin-EDTA 0.05% (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)进行细胞传代，并按照下游试验进行播种。

2．2.培养基的调理和处理

在上述标准生长培养基中，将骨髓间充质干细胞培养至80%的融合度，制成条件培养基。然后用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤培养物2次，并在含10%外泌体耗尽胎牛血清(exoFBS)的DMEM中培养(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)。培养24小时，3000 × g离心15分钟，0.22过滤μM²聚醚砜过滤器（德国达姆施塔特默克公司）。获得的条件培养基在-80°C下储存，直到需要。

2．3.Coculture扩散研究

在transwell系统中，使用PrestoBlue方法(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)测量与骨髓间充质干细胞共培养的角膜内皮增殖随时间变化的情况。在低隔间，将30,000个B4G12孔接种到24孔板的fnc涂层表面，并在标准培养基中培养。在上部隔间，5,000和10,000 MSC被播种到0.4μM²孔细胞培养插入物(Greiner Bio-One, Vilvoorde，比利时)，并在(i) 10%正常的DMEM中生长，(ii)外泌体耗尽的胎牛血清，(iii)角膜内皮培养基中生长。对每个供体进行了双引号实验。

从第二天开始，对每个供体在duplo进行PrestoBlue增殖试验(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)，为期8天。按照制造商的说明稀释试剂，与细胞孵育30分钟，然后转移到96孔黑色OptiPlates (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)。在每种条件下使用Wallac 1420 VICTOR重复三次吸光度测量^3.microplate reader (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)和标准化阴性对照(PrestoBlue无细胞)。内皮细胞在空培养液中生长作为阴性对照。

2.4.生物分析

使用wound maker (Essen Bioscience, Hertfordshire, United Kingdom)对96孔板进行划痕分析，遵循制造商的指南。简单地说，75000个B4G12细胞被播种在96孔专用ImageLock板(Essenbio，赫特福德郡，英国)中，并让其粘贴过夜。接下来，使用WoundMaker工具制作一个宽度为170的划痕μ每孔洗两次以清除脱落的细胞。每两小时自动拍摄一次相衬图像，以监测随时间推移在卵母细胞内的伤口闭合情况。这些图像通过内部训练的算法进行分析，以显示随时间变化的相对伤口密度，这是一种衡量伤口细胞密度相对于伤口区域外部细胞密度的指标。用不同浓度的条件培养基进行四次实验。

用蛋白制剂进行增殖试验时，如前所述，将B4G12细胞接种在96孔板中并让其粘附。人EGF、IGF-BP2、IGF-BP6购自Peprotech (London, uk)， PBS 1×重组。使用IncuCyte活细胞成像系统监测平板。增殖表现为细胞融合百分比随时间的增加或群体倍增(PDT)。通过指数增长曲线拟合得到PDT (GraphPad Prism)， PDT通过公式提取 与是速率常数。PDT使用非参数Kruskal-Wallis检验进行统计比较 被认为是重要的。

2．5．尺寸排阻色谱

使用Centricon Plus-70离心浓缩器和100 kDa截止再生纤维素膜（德国达姆施塔特默克公司）。65 以mL条件培养基为起始体积，离心3000分钟 × 在1000分钟之后，持续25分钟 × g旋转两分钟以回收滞留物。

使用qEVoriginal色谱柱（英国牛津大学iZon science）进行尺寸排阻色谱，以从外显体中分离可溶性蛋白质。使用前，在室温下使用PBS 1×平衡色谱柱，并稀释获得的滞留物，以获得最终体积为500的滞留物 μL标准化。为空体积，先丢弃前5个馏分，然后连续收集25个馏分(500)μL在低蛋白结合收集管(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)。在增殖研究中，使用Amicon Ultra蛋白浓缩器在3000 × g的条件下进一步浓缩7分钟，该浓缩器带有100 kDa的再生纤维素截流膜(Merck, Darmstadt, Germany)。滞留物，即滞留在过滤器中的部分，在1000 × g的条件下倒置旋转过滤器2分钟后回收，然后分成2口井(约40口)μL)。条件重复，在对照条件下加入相同体积的PBS 1×。

2.6.蛋白质定量

使用Bradford蛋白分析(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)对SEC获得的组分进行检测，以获得蛋白洗脱图谱。PBS 1× 1:3稀释，Bradford试剂(1:1)室温孵育10分钟。测量在Costar 96孔板(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)中进行，重复三次。OD值用阴性对照标准化，并转换为浓度(μg/mL)，用白蛋白标准曲线( ）(美国加州卡尔斯巴德Life Technologies公司)。

2.7。透射电子显微镜法

根据先前发表的协议，使用透射电子显微镜(TEM)证实了两名供体早期SEC组分(6-10)中存在外泌体[23，24］.简单地说，每个样品滴三滴在parfilm上，用镍网格覆盖，在室温下孵育一小时以吸收电动汽车。用1× PBS漂洗3次，超纯水漂洗5次。然后用2%戊二醛固定10分钟，用超纯水清洗5次。然后用2%醋酸铀酰覆盖网格15分钟，然后在0.13%甲基纤维素(K5-8)和0.4%醋酸铀酰孵育10分钟，室温干燥。用Tecnai G2 Spirit BioTWIN (FEI, Eindhoven, The Netherlands)对获得的样品进行成像。

2.8。抗体阵列

蛋白质图谱的分析是通过人类生长因子抗体阵列(ab134002, Abcam, Cambridge, United Kingdom)实现的。在阻断膜后，SEC保留(500μL)稀释至1ml, 4℃孵育过夜，相应洗涤。膜与生物素结合的抗细胞因子在室温下进一步孵育5小时，同时轻轻摇晃和吸气。随后，在4°C下加入酶标链霉亲和素过夜。按照说明书进行化学发光检测，用G:BOX (Syngene, Cambridge, United Kingdom)进行图像采集，累计曝光时间分别为5秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟。

2.9。数据分析

采用Microsoft Excel进行数据处理，GraphPad Prism 6.0进行统计分析。数据表示为 ．数据挖掘后，根据样本量、Kolmogorov-Smirnov检验、直方图对数据进行正态性检验。除共培养研究外，所有病例均采用非参数Kruskal-Wallis检验是否存在显著差异，采用Friedman检验。值< 0.05为显著性阈值。

3.结果

3．1.骨髓间充质干细胞条件培养基的增殖作用

在共培养条件下，BM MSC可直接刺激B4G12内皮细胞增殖，而干细胞的上腔室有不同的生长介质组成:内皮细胞培养基(ENDO)、带有野生型胎牛血清的标准BM MSC培养基(WT FBS)、带有消耗外泌体胎牛血清的标准培养基(exfree)。除内皮细胞培养基培养外，其他各实验条件下细胞增殖均显著增加(图)1)．上隔室中不同数量的干细胞(5,000或10,000 BM间充质干细胞)对其增殖作用的反应没有差异。

此外，骨髓间充质干细胞也间接发挥了这种作用，在划痕实验中，将不同浓度的条件培养基添加到内皮细胞培养物中，分别为100%、50%和10%。在每个实验条件下，创面在18小时后>90%愈合，而对照组仅显示60%愈合(图)2(一个)和2 (b))．

3．2.条件媒介的探索

为了了解BM MSCs的哪种分泌成分引起了这种效应，我们试图通过大小排阻色谱法分离分泌组内的不同类别，即细胞外小泡和分泌蛋白质。随后，Bradford分析揭示了显示最高浓度的组分的蛋白质谱组分17和18中的蛋白质离子（图3.(a)，视捐赠者而定，最高可达10,000μ克/毫升。标准条件培养基中的蛋白质浓度约为40μg/mL(未显示数据)。

早期的蛋白质浓度也有轻微的增加(±20)μg/mL)，通过Bradford试验间接定量外泌体的膜蛋白，表明外泌体的存在(图1-5)3.（b） ）。分离的部分进一步浓缩并用于单独的增殖试验（图4(一))．他们的结果显示，与对照组(黑线)相比，蛋白浓度高的馏分(馏分18-25)对细胞增殖有积极的影响(图)4 (b))．另一方面，与阴性对照相比，包括外泌体(7-9)在内的其余组分不刺激内皮生长(图7-9)4 (c))．

3.3.精确定位馏分的含量

根据获得的蛋白谱，外泌体预计出现在早期洗脱的SEC组分中，而蛋白由于体积较小，保留时间更长，出现在后期的组分中(图)3.(一)和3.(b))。为了证实这一点，分别对早期和晚期馏分进行了TEM和蛋白分析。

透射电镜显示，在两名供体的6至10份中均存在外泌体，但存在程度相对较低。膜泡的平均直径为 范围为23 nm-171 nm。外泌体呈圆形，中央有一个小凹陷，这是TEM观察到的外泌体的特征(图)5)．

在最刺激增殖的样品上进行生长因子抗体阵列，即18 ~ 23馏分，以鉴定分泌蛋白。已测试的生长因子的完整面板显示在补充表中1．我们观察到表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白2和6、IGF-BP2和IGF-BP6分别在副本中存在阳性信号(图)6)．阴性对照(含10%胎牛血清的基础MSC生长培养基)未观察到阳性信号。

3．4．生长因子滴定

然后用纯化的已鉴定蛋白配方在降低浓度(范围:1000-10 ng/mL)下进行额外的增殖研究。根据指数增长曲线计算种群倍增次数(PDT)，并进行统计学比较。当用这三种生长因子的单独配方进行增殖试验时，没有刺激细胞生长(图)7（a）- - - - - -7 (c))．下一步，结合生长因子以模拟条件培养基，一步一步。当将生长因子2 × 2滴定时，PDT没有显著下降(图)7 (d)- - - - - -7 (f))．在结合上述三种已鉴定的生长因子时，既没有模拟生长，更有PDT的增加，即细胞生长缓慢，补充10 ng/mL的EGF-IGFBP2-IGFBP6组合的细胞(图)7 (g))．

4.讨论

在本研究中，我们证实了骨髓间充质干细胞条件培养基能够刺激永生化角膜内皮细胞的增殖。我们发现，刺激效应是由于分泌蛋白的影响，而不是外泌体部分。我们还检测了三种由骨髓间充质干细胞特异性分泌的高浓度生长因子，并用人类纯化蛋白测试了它们的刺激作用。不幸的是，这些试验不能再现在整个条件培养基中所看到的效果。因此，当它们在条件培养基中大量存在时，它们并不对自身的生长效应负责。这就提出了一个问题，即媒体的哪个部分是负责任的。可能是生长因子抗体阵列不包含最相关的因子，或者是检测到相关因子，但在低浓度下发挥作用。

有趣的是，表皮生长因子(EGF)是在刺激角膜内皮细胞生长的条件培养基中被鉴定出来的，但用纯化的配方对细胞生长没有效果。与这一发现相反，EGF此前已被证明作为初级角膜内皮培养基的补充物，用于人和牛角膜内皮细胞，浓度范围为5-10 ng/mL，可促进增殖，尽管对我们的培养没有影响[25，26］.一种可能的解释是，与原代细胞相比，永生角膜内皮细胞对EGF的补充不敏感。

胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）2和6也在引起内皮细胞增殖的富含蛋白质组分中被检测到。IGFBP是一个由六个成员组成的IGF结合蛋白家族，每个成员都表现出细微的结构差异，从而导致不同的结合能力和功能[27］.IGFBP可以通过调节血液和细胞外间隙中可溶性IGF亚型的可用性来抑制或增强IGF诱导通路的作用。

此外，通过蛋白分析和透射电镜，我们使用SEC色谱柱证实了早期洗脱馏分中存在外泌体。外泌体是最小的一类细胞外囊泡，直径仅30-150纳米，由人体每个细胞分泌。起初，人们认为它们没有必要的功能，但过去十年的研究表明，它们的前景是光明的[28］.然而，在我们的研究中，我们没有看到任何外泌体对细胞培养的影响。由于外泌体的分离是一项严格的任务，我们可能还没有能力分离足够浓度的外泌体。然而，我们想强调的是，外泌体的能力或分离的稳稳性可能被高估了，因为这是一个相对较新的领域，正在获得巨大的普及，导致高发表率和草率的结论[29］.例如，目前外泌体分离的金标准仍然是差异超离心法，它容易受到蛋白质和核酸污染。因此，当仍有可溶性蛋白存在时，有益的作用可能往往仅仅归因于外泌体。在这里，我们使用SEC分离和分离条件培养基中的外泌体和蛋白质，并证明了蛋白质而不是外泌体在刺激细胞生长中的作用。

在这项研究中，我们只纳入了来自一个组织来源的有限数量的供体;然而，已经证明从其他组织分离的MSCs可以呈现不同的分泌组[30］.因此，来自其他组织来源的msc条件培养基是否产生类似的有益效果或另一组生长因子是有趣的。此外，为了定位相关蛋白质，还可以采用更先进的蛋白质组分析技术，如液相色谱和质谱分析[31］.然而，这样的实验将导致数千种蛋白质的识别，使其不可能单独测试或组合测试。虽然我们观察到条件培养基对永生化细胞的影响，但纯化蛋白对它们没有影响，但在没有进一步研究的情况下，我们不能简单地将此推断到原代内皮细胞。

5.结论

干细胞条件培养基能刺激角膜内皮细胞培养基。详细地说，我们发现是蛋白质而不是外泌体引起了这种生长刺激。然而，我们不能用在条件培养基中检测到的纯重组蛋白复制这种效果。在未来，发现潜在的相关蛋白(组合)可以用于角膜内皮细胞治疗的生产或作为治疗轻度角膜内皮功能障碍的体内药物。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。

的利益冲突

Nadia Zakaria是诺华公司的员工。

致谢

作者要感谢Inge Mertens和Eline Oeyen对尺寸排阻色谱的帮助，以及Isabel Pintelon对TEM成像的帮助。成本行动公司BIONECA CA16122因向BVdB提供旅行补助金而获得认可。BVdB还获得了弗兰德斯科学研究基金(FWO)的个人授权。

补充材料

补充1．补充表1:所有生长因子的平板图，检查他们的存在在分数18-23。

补充2．补充视频1:在0%(对照)、10%、50%和100%条件培养基存在的情况下，时间推移显示中央伤口愈合。

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