SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/5891393 5891393 研究文章 检查参与组成分泌腺探索间充质干细胞对角膜内皮细胞增殖 https://orcid.org/0000 - 0001 - 6371 - 9619 Van den Bogerd 伯特 1 https://orcid.org/0000 - 0003 - 4862 - 5491 扎卡里亚 娜迪娅 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5112 - 8093 Matthyssen 斯蒂菲 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7728 - 7260 Koppen 船底座 1 2 倪Dhubhghaill Sorcha 1 2 3 Faroni 亚历山德罗 1 安特卫普眼科学研究小组(ARGOS) 转化神经科学 医学院 安特卫普大学 Wilrijk 比利时 uantwerpen.be 2 眼科学系 安特卫普大学医院 Edegem 比利时 uza.be 3 荷兰创新研究所眼部手术(NIIOS) 鹿特丹 荷兰 niios.com 2020年 5 2 2020年 2020年 04 07年 2019年 25 11 2019年 10 12 2019年 5 2 2020年 2020年 版权©2020 Bert Van den Bogerd et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

人类角膜内皮细胞体外生长(HCEnC)是一种新兴的治疗选择治疗视力受损的患者,旨在缓解当前全球供体短缺。扩大HCEnC仍然是具有挑战性的,和获得足够的细胞数量是一个限制因素。是已知条件培养基从骨髓间充质干细胞可以刺激内皮细胞的扩散。本研究的目的是将这项工作进一步识别一些潜在的因素。我们确认检查参与组成分泌腺的刺激效果间充质干细胞看到以前和分离的液可溶性蛋白质使用尺寸排阻色谱法。我们演示了液的存在和可溶性蛋白在早期和晚期分数,分别与透射电子显微镜和蛋白质化验。能复制扩散研究表明增长刺激与后来的富含蛋白质的分数而不是exosome-rich分数。抗体检测发现EGF分泌蛋白质的存在,IGFBP2, IGFBP6 protein-high分数,但增长增强均与纯化蛋白配方。总之,我们确认的刺激效应阻止cell-conditioned介质和已经确定,是由于蛋白质的影响而不是液。我们不能重现增长刺激,然而,与纯粹的重组蛋白候选人测试。 Specific identification of the underlying proteins using proteomics could render a bioactive protein that can be used for 体外的细胞或扩张 在活的有机体内药物治疗早期角膜内皮损伤。

 溺爱Wetenschappelijk Onderzoek 成本行动BIONECA CA16122 1。介绍

角膜内皮的内细胞层角膜,负责维持角膜的水化和透明度。细胞形成一个单层六角形态学特征和调节电解液和水流动的假定pump-and-leak机制( 1]。人们普遍认为这些细胞没有能力把体内,因此,人类角膜内皮细胞的绝对数量(HCEnCs)只有随着时间下降 2]。例如,手术创伤诱导在白内障手术或特定疾病(例如,福克斯的萎缩症)可以大大加快这个细胞损失。当内皮细胞密度下降到低于某一阈值(任意设定在500细胞/毫米2),剩余的细胞不能实现其功能,水被动地进入角膜导致角膜水肿。如果这不能逆转,病人会发展为大疱的角膜病,一个条件以减少视觉和痛苦。

目前,治疗这些病人的唯一途径是通过角膜内皮移植,一个完善的,非常成功的技术,占大约40%的角膜移植(执行 3]。不幸的是,访问这些移植目前受全球供体短缺,缺乏全球物流供应链,和角膜的银行。一个可能的策略来克服这些问题是组织工程师在实验室里一个内皮细胞层。本产品将由体外生长HCEnCs适合移植的细胞支架( 1, 4, 5]。虽然脚手架的方法是最常见的探索,细胞悬液治疗也试着在11个病人( 6, 7]。

无论交付方法,它仍然是非常困难的HCEnCs扩大到足够高的数据所需的再生医学的方法。这个困难了proliferation-inducing物质的追求一个非常活跃的研究领域,和一些成功的候选人在过去十年中被发现。岩石抑制剂y - 27632核连环蛋白p120,和p38增殖蛋白激酶抑制剂都显示承诺作为内皮生长促进剂虽然需要大量的细胞扩张之前,这些疗法可以使主流( 8- - - - - - 10]。

当寻找新的假定的生长素,间充质干细胞(msc)是一个有趣的治疗选择。它曾被发现,尽管MSC移植心肌细胞产生有益的影响,这是由于旁分泌作用而不是通过分化[积极参与组织再生 11]。观察引发的想法利用检查参与组成分泌腺””或蛋白质的分泌的细胞组织再生,而不是期待自己再生的细胞组织( 12]。这种策略已被用来刺激角膜内皮细胞增长通过干细胞的条件培养基,即。,从干细胞培养基生长在它定义一段 13]。在文化中,干细胞释放大量的可溶性蛋白质(生长因子和细胞因子),细胞外基质蛋白,和各种细胞外囊泡。后者在凋亡的身体可以进一步细分,微泡,液,取决于它们的大小和生源论( 12]。液,含有信号分子如蛋白质、m (i) RNA,脂质,在再生医学领域引起了极大的关注。事实上,他们是有效的介质的基本细胞过程和涉及,例如,抗原,细胞生存、增殖( 14, 15]。

检查参与组成分泌腺的具体表达谱强烈依赖的文化环境,即细胞基质,基础培养基和补充 16]。虽然这强化“条件”中已经被证明能够刺激角膜内皮细胞增殖,底层组件负责这种效应是不知道 13, 17- - - - - - 20.]。从药品监管和患者安全,重要的是要识别出具有生物活性的化合物,可以细化和量化 16]。这就是为什么我们的目标是找出确切的检查参与组成分泌腺的化合物骨骨髓来源间充质干细胞刺激角膜内皮细胞增殖。在鉴定的化合物(蛋白质或液),它可以很容易地实现当前培养基体外内皮细胞的扩张产生角膜内皮细胞表或甚至可以进一步发展为局部滴眼剂刺激内皮伤口愈合等岩石抑制剂( 21]。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养

骨骨髓来源干细胞(BM MSC)是一种礼物教授提供的斯特凡诺威尼托的法拉利眼库基金会和分离得到健康的捐赠者与知情同意的伦理委员会批准Azienda Ospedaliera大学联盟Integrata维罗纳。BM MSC骨髓中分离的吸入物附着在培养瓶通过他们的能力。详细描述的隔离和表征BM MSC执行根据Krampera和他的同事所描述的方法( 22]。大英博物馆MSC在DMEM培养补充10%胎牛血清和两性霉素B和庆大霉素(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA),介质是每隔一天刷新一次。所有实验运行条件培养基由两个不同的捐赠者,只有细胞通道6。

B4G12人类永生的角膜内皮细胞从德国购买Sammlung冯Mikroorganismen和Zellkulturen (DSMZ,布伦瑞克,德国)和培养与少量修改根据他们的指示。B4G12细胞被播种到塑料涂层FNC涂料混合(美国巴尔的摩雅典娜酶系统),和人类内皮细胞的生长介质由SFM补充10 ng / mL bFGF(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)没有任何抗生素。

培养基是刷新每隔一天,细胞亚文化Trypsin-EDTA 0.05%(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)和播种下游试验。

 2.2。调节和处理的介质

条件培养基是由日益增长的BM MSC confluency 80%标准上述生长介质。文化被洗两次磷酸缓冲盐(PBS) 1×和生长在DMEM exosome-depleted 10%胎牛血清(exoFBS)(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。介质条件24小时,离心机在3000×0.22 g 15分钟,过滤后使用 μ米2polyethersulfone过滤器(默克公司,达姆施塔特,德国)。获得的条件培养基是储存在-80°C,直到需要。

 2.3。Coculture扩散研究

角膜内皮细胞增殖与BM coculture MSC测量随着时间的推移使用PrestoBlue化验(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)在transwell系统中,在30000年降低车厢,B4G12井播种到FNC-coated表面24板和标准培养基培养。上室,5000年和10000年BM MSC被播种到0.4 μ米2孔细胞培养插入(他一一Bio-One, Vilvoorde,比利时)和正常生长在(我)DMEM 10%, (2) exosome-depleted的边后卫,(3)角膜内皮细胞培养基。实验进行得宝为每个捐赠者。

PrestoBlue扩散试验(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)是为每个捐赠者中执行得宝开始第二天下舱一段8天。试剂的稀释按照制造商的指示,与细胞孵化30分钟,并转移到96年黑色OptiPlates(美国珀金埃尔默,沃尔瑟姆,MA)。吸光度测量重复3次每条件使用Wallac 1420的胜利者3标仪(美国珀金埃尔默,沃尔瑟姆,MA)和归一化消极控制(PrestoBlue没有细胞)。内皮细胞生长在一个空的存在文化插入被用作一个消极的控制。

 2.4。生物分析

刮伤进行了化验使用WoundMaker(埃森生物科学,赫特福德郡,英国)96好板制造商的指导方针。短暂,75000 B4G12细胞被播种在专用96 ImageLock板块(Essenbio,赫特福德郡,英国),让遵守过夜。接下来,WoundMaker工具被用于制造一个一致的划痕宽度为170 μm /好,洗两次去除脱落的细胞。相衬显微镜的图像拍摄每两小时自动监控伤口关闭IncuCyte随着时间的推移。内部训练算法的图像分析显示伤口相对密度随着时间的推移,一个度量测量细胞的密度相对于细胞密度在伤口以外的区域。实验进行了一式四份不同浓度的条件培养基。

与蛋白质扩散化验准备,B4G12细胞被播种在96板如前所述,让遵守。人类表皮生长因子、IGF-BP2 IGF-BP6买来Peprotech(英国伦敦)和PBS 1×重组。板是使用IncuCyte监控活细胞成像系统。扩散也表示,增加细胞融合的比例或人口翻倍(PDT)。获得PDT,扩散曲线是通过指数增长曲线 Y = Y 0 ∗ 经验值 k ∗ X (GraphPad棱镜)和PDT通过公式提取 ln 2 / K 与 K 速率常数。PDT比较使用非参数统计克鲁斯卡尔-沃利斯检验 p < 0.05 被认为是重要的。

 2.5。尺寸排阻色谱法(SEC)

条件培养基集中使用Centricon + - 70离心集中器与100 kDa截止再生纤维素膜(默克公司,达姆施塔特,德国)。65毫升的条件培养基作为初始体积和离心机为25分钟后1000×3000×g g两分钟恢复滞留物旋转。

尺寸排阻色谱法进行与qEVoriginal列(iZon科学,牛津大学,英国)分离从液可溶性蛋白质。列是平衡与PBS 1×在室温下使用,和获得的滞留物稀释获得最终成交量为500 μL标准化。孔隙体积,前五个分数被丢弃,紧随其后的是连续收集25分数500 μL在低蛋白结合集合管(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。扩散研究分数进一步集中使用Amicon超蛋白集中器100 kDa截止膜的再生纤维素(默克公司,达姆施塔特,德国)在3000×7分钟g。滞留物,即。,the fraction that is retained in the filter, were recovered by spinning the filters in an upside-down orientation for two minutes at 1,000 × g and were divided over two wells (approximately 40  μL)。条件进行重复,同样体积的PBS 1×添加到控制条件。

 2.6。蛋白定量

SEC的分数获得测试使用一个布拉德福德蛋白质化验(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)获得的蛋白质洗脱概要文件。每个样本稀释1:3 PBS 1×10分钟孵化与布拉德福德试剂在室温下(1:1)。用得宝96年配角孔板测量进行(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)和重复三次。OD值规范化使用消极的控制和转换成浓度( μ使用白蛋白标准曲线(g / mL) R 2 = 0.996 )(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。

 2.7。透射电子显微镜法

液的存在早期交会分数(6 - 10)两个捐助者被确认使用透射电子显微镜(TEM)执行根据先前公布的协议( 23, 24]。短暂,三滴/样本被放置在封口膜,覆盖网格和镍在室温下孵化一小时吸收的电动汽车。网格被冲洗三次PBS 1×和超纯水的5倍。接下来,样本和2%戊二醛固定的十分钟,洗五次超纯水。网格被覆盖着2%的醋酸双氧铀15分钟,其次是孵化0.13%甲基纤维素(K5-8)和0.4%醋酸双氧铀十分钟,并允许在室温下晾干。获得的样本成像与Tecnai G2精神BioTWIN(范,埃因霍温,荷兰)。

 2.8。抗体阵列

分析蛋白质的概要文件是通过一系列人类生长因子抗体(ab134002 Abcam,剑桥,英国)。挡住了膜之后,SEC滞留物(500 μL)被稀释1毫升,孵化一夜之间在4°C,并相应地洗。膜被进一步孵化biotin-conjugated anti-cytokines了五个小时在室温下而温柔颤抖和吸气。随后,HRP-conjugated链霉亲和素增加了一夜之间在4°C。根据指令,执行化学发光检测和图像捕获与G:盒子(Syngene,剑桥,英国)累积曝光时间5秒,30秒,1分钟,2分钟,5分钟。

 2.9。数据分析

使用Microsoft Excel进行数据处理和统计分析GraphPad Prism 6.0。数据表示为 的意思是 ± SD 。数据探索后,根据样本数据测试正常,Kolmogorov-Smirnov测试和直方图。在所有情况下,进行非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验检查显著差异,除了coculture研究弗里德曼测试使用。 p 值< 0.05被认为是意义的门槛。

 3所示。结果 3.1。的增殖效果BM MSC-Conditioned媒介

BM MSC直接刺激内皮细胞增殖B4G12 coculture设置,而有不同的生长培养基成分上室的干细胞:内皮细胞培养基(ENDO)与标准BM MSC介质与野生型的边后卫(WT的边后卫)与标准中与exosome-depleted的边后卫(Exofree)。细胞增殖显著增加在每个实验条件除非BM MSC在内皮细胞培养中(图 1)。没有响应的差异与不同数量的干细胞(5000或10000 BM msc)在上层舱增殖效果。

角膜内皮细胞增殖是间接刺激当cocultured BM MSC在标准培养时媒体。只显示与控制条件显著差异。Endo:角膜内皮的媒介;Exofree: BM MSC与外来体耗尽的边后卫介质;WT的边后卫:BM MSC与野生型的边后卫介质。

此外,BM MSC施加这种影响也间接通过添加不同浓度的条件培养基内皮细胞培养是100%,50%,和10%,伤口化验。伤口是> 90% 18小时后关闭每个实验条件,而只有60%关闭(数字显示的控制 2(一个)和 2 (b))。

(一)说明体外相差的图片关闭伤口。(b)图示法相对密度随着时间的推移。相对密度伤口纠正nonscratched地区扩散。

 3.2。探索的条件培养基

为了理解哪些组件引起的BM msc分泌这种效果,我们寻求独立的检查参与组成分泌腺内的不同的类,即。,细胞外囊泡和分泌蛋白通过尺寸排阻色谱法。这之后,布拉德福德试验揭示了蛋白质的分数显示分数最高的蛋白质浓度17和18(图 3(一)),这取决于捐赠者,最高达到10000 μ克/毫升。蛋白质浓度在标准条件培养液大约是40 μ克/毫升(数据没有显示)。

(a)蛋白的筛选了分数的两个BM MSC捐助者蛋白质概况周围发现分数最高的18岁。(b)在细节最早的分数时,我们发现海拔在蛋白质浓度指示液的存在。

也有少量蛋白质浓度增加早期分数(±20 μg / mL)洗脱后的空隙体积分数(1 - 5),指示液的存在间接地通过测量膜蛋白通过布拉德福德作为间接定量测定液(图 3(b))。分离分数进一步集中,用于个人扩散化验(图 4(一))。他们的研究结果表明,蛋白质含量高的分数显示出积极的影响细胞增殖(分数年龄在18岁至25岁之间)与控制(黑线)(图 4 (b))。另一方面,剩余分数,包括液(分数7 - 9)没有刺激内皮生长而负控制(图 4 (c))。

B4G12细胞增殖曲线补充与不同分数孤立交会控制条件中突出显示黑色。(一)增殖曲线随时间的分数(# 6-30)。(b)那些不或负面影响角膜内皮生长(# - # 26 - 30日)。(c)那些刺激细胞增殖。

 3.3。确定的内容分数

基于获得的蛋白质图谱,液料的早期筛选了SEC分数和蛋白质,具有延长保留时间由于其规模较小,在以后的分数(数字 3(一)和 3(b))。为了证实这一点,TEM和蛋白质化验进行早期和晚期的分数,分别。

TEM显示液的存在分数6到10的捐赠者,但程度相对较低。发现膜囊泡显示平均直径 61.91 ± 3.77 纳米 23 - 171 nm范围。液出现圆形的形状,显示一个小抑郁集中为液特性与TEM观察(图 5)。

三个说明性的液使用透射电子显微镜捕获的照片。预计尺寸范围内的囊泡是抑郁症和显示特征中央TEM样品制备的结果。

生长因子抗体阵列进行核扩散最刺激的样本,即识别分数18至23日分泌蛋白。整个面板的生长因子测试显示在补充表 1。观察到,有一个积极的信号复制为表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白2和6,IGF-BP2,分别和IGF-BP6(图 6)。没有观察到消极的控制,积极的信号被基底MSC增长中有10%的边后卫。

生长因子分析揭示了EGF的积极信号,IGFBP2, IGFBP6捐助者。消极的控制,这些生长因子没有信号。捐赠者# 2显示了文物旁边涂抹生长因子的抗体。

 3.4。生长因子滴定

额外的扩散研究被进行了净化配方降低识别蛋白质的浓度(范围:1000 - 10 ng / mL)。人口翻倍(PDT)统计指数增长曲线的计算和比较。当执行增殖化验的个人配方三个生长因子确定,没有刺激细胞生长(数字 7(一)- - - - - - 7 (c))。在下一步中,生长因子结合为了模拟条件培养基,一步一步。滴定生长因子2×2时,没有明显的减少PDT观察(图 7 (d)- - - - - - 7 (f))。结合这三个确定生长因子,既没有一个模拟的增长,甚至更多,PDT的增加,即。较慢的细胞生长,细胞补充10 ng / mL的组合EGF-IGFBP2-IGFBP6(图 7 (g))。

比较人口翻倍(PDT)在降低浓度的单一蛋白质配方(a - c),双(d-f)生长因子组合,组合(g)的三倍。

 4所示。讨论

在这项研究中,我们证实了BM MSC-conditioned媒介能够刺激不灭的角膜内皮细胞扩散。我们发现,刺激的效果是由于分泌蛋白的影响,而不是外来体分数。我们也发现三个专门分泌生长因子浓度更高的BM MSC和测试与人类纯化蛋白的刺激效应。不幸的是,这些化验没有繁殖效果与整个条件培养基。因此,尽管他们的条件培养基中大量存在,他们不是自己负责增长效应。这就提出了一个问题什么片段中是负责任的。这可能是因为生长因子抗体阵列不包括最相关的因素或检测到负责的因素,但对其在低浓度效应。

有趣的是,表皮生长因子(EGF)在角膜内皮细胞条件培养液,刺激增长的,但它不是有效的刺激细胞生长,净化配方。这一发现相比,EGF使用时曾被证明能够促进增殖的补充主要由几组角膜内皮细胞培养基的浓度范围5 - 10 ng / mL人类和牛角膜内皮细胞,尽管没有影响我们的文化 25, 26]。一个可能的解释可能是永生的角膜内皮细胞EGF的补充而不是敏感的主要细胞。

胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP) 2和6的富含蛋白质的分数也发现内皮细胞增殖引起的。胰岛素样生长因子结合蛋白研究IGFBP是家庭组成的六个成员,每个显示微妙的结构差异导致微分绑定能力和功能( 27]。IGFBP可以抑制或加强影响IGF-induced通路通过调节血液中可溶性IGF亚型的可用性和细胞外空间。

此外,我们确认的存在液早期筛选了分数使用SEC列通过蛋白质分析和透射电镜。液的最小类细胞外囊泡的直径只有30 - 150 nm人体每个细胞分泌的。最初,他们认为没有必要的功能,但在过去的十年中显示一个有前途的未来( 28]。然而,在我们的研究中,我们没有能看到任何exosome-related对细胞培养的影响。由于隔离液是一个严格的任务,很可能我们还没有能力充分隔离液的浓度。然而,我们想强调的能力可能液或隔离的鲁棒性是高估了因为这是一个相对新的领域,获得了巨大的人气,导致出版率高和草率的结论 29日]。例如,当前的外来体隔离仍然是黄金标准微分超速离心法是倾向于蛋白质和核酸污染。因此,有利影响可能常常仅仅归因于液时仍有可溶性蛋白质。这里,我们孤立和分离液和蛋白质内的条件培养基使用交会,并演示了蛋白质的作用而不是液在刺激细胞生长。

在这项研究中,我们包含了数量有限的捐赠者从只有一个组织来源;然而,事实证明,msc与其他组织检查参与组成分泌腺可以呈现出不同的( 30.]。因此,有趣的是MSC-conditioned介质是否从其他组织来源产生类似的有益效应或生长因子的另一组。此外,为了在相关的蛋白质,更先进的蛋白质组学分析技术还可以实现如液相色谱和质谱( 31日]。然而,这样的实验会导致数以千计的蛋白质的识别,从而无法测试单独和组合。虽然我们观察条件培养液对永生化细胞的影响,纯化的蛋白质没有影响他们,但我们不能简单地推断这主要内皮细胞没有进一步的研究。

 5。结论

茎cell-conditioned介质可以刺激角膜内皮细胞培养基。在细节中,我们发现它比液,而蛋白质,占这种增长刺激。然而,我们不能复制这种效应与纯粹的重组蛋白检测的条件培养基。在未来,寻找潜在的负责任的蛋白质(组合)可用于生产的角膜内皮细胞疗法或应用作为温和的体内药物角膜内皮功能障碍。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

娜扎卡里亚是诺华公司的一名员工。

 确认

作者要感谢英奇莫顿和Eline Oeyen援助与尺寸排阻色谱法和伊莎贝尔Pintelon与TEM影像协助。成本行动BIONECA CA16122 BVdB格兰特承认提供旅行。BVdB也授予个人授权科研基金的弗兰德斯(FWO)。

 补充材料

补充表1:一盘地图的生长因子分数18 - 23中检查了他们的存在。

补充视频1:时间流逝显示关闭中央伤口(控制)的0%,10%,50%,和100%的条件培养基。

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