类器官作为呼吸系统疾病的强大模型

抽象

对肺泡的损害通常会导致低效的气体交换甚至呼吸衰竭，这很难在动物研究中建模。在过去的十年中，干细胞衍生的自组织三维类器官已经成为在培养皿中再现呼吸系统疾病的新途径。肺泡类器官提高了我们对组织稳态和肺泡病理改变机制的认识。从这个角度看,我们审查的最先进的技术建立肺泡瀑样从内生肺上皮干细胞/祖细胞或多能干细胞,以及使用研究肺泡瀑样呼吸道疾病,包括特发性肺纤维化、肺结核感染,呼吸道病毒感染。我们也讨论挑战，需要克服的未来应用肺泡器官类个体化医学。

1.简介

类器官是细胞外基质中的干细胞/祖细胞衍生的三维结构，它概括了包括乳腺、肝脏、胰腺、舌头、胃、前列腺和肺等多种器官的基本结构和功能。1]。在肺部，覆盖传导气道和肺泡的上皮细胞受损可能导致炎症风暴和进行性疾病，包括支气管哮喘、慢性阻塞性肺病和特发性肺纤维化(IPF)，以及呼吸道感染，如最近在中国出现的冠状病毒COVID-19 [2]。区域特异性干细胞/祖细胞已被鉴定用于维护肺上皮或修复损伤后的肺上皮[3.]。这些上皮干细胞/祖细胞可以产生肺类器官，为人类肺发育和呼吸系统疾病的研究提供了一个强大的平台，因此引起了研究者和医生的浓厚兴趣。有几篇关于有机体的综述[4–7]，但在这次审查中，我们侧重于肺泡腔，其中损害通常与气体交换，甚至是致命的结果困难相关类器官的研究。

2.产生肺泡上皮的干/祖细胞

2.1。内源性干细胞/祖细胞

人和小鼠的肺泡表面均由肺泡1型(AT1)上皮细胞和肺泡2型(AT2)细胞排列。AT1电池覆盖了绝大多数气体交换表面，非常薄，有利于气体扩散[8]。AT2细胞是分泌性上皮细胞，可降低表面张力，限制细菌在肺泡中的生长[9]。在小鼠肺发育过程中，AT1和AT2细胞直接由一个双效祖细胞产生[10,11]。它仍有待确定在人胎儿肺中是否存在类似的双潜能祖细胞群;然而，表达细胞两者AT2细胞标记物（表面活性剂蛋白C（SFTPC）），并且在从人胚胎干细胞衍生的长期培养的类器官中观察到的AT1细胞标记物（平足蛋白）[12]。在成人中，均表现AT2细胞产生AT1细胞;因此AT2细胞被认为是兼性祖细胞在人类和小鼠中的肺泡上皮13–15]。用动物模型揭示了成人肺泡上皮AT2细胞的再生功能。对于稳定状态和肺泡损伤后能够补充AT2细胞的干细胞特征的研究仍在进行中[15,16]。AT2细胞的罕见的子集，包括α6β4⁺AT2细胞和轴蛋白2⁺AT2的细胞，可在小鼠中产生的肺损伤后AT2细胞[17,18]。Zacharias等人也描述了健康人类肺部wnt反应性肺泡上皮祖细胞[19]。在支气管肺泡管交界处，细支气管肺泡干细胞（BASCs），其特征在于secretoglobin家族1A部件1（SCGB1A1，也称为CCSP，CCPBP，CC10，或CC16）和SFTPC的共表达，被证明能够修复肺泡上皮细胞和远端气道上皮细胞[20,21]。以前认为该部位不存在的基底细胞被认为在病毒感染小鼠后迁移到肺泡区并生成AT2细胞[22]。但在人类肺中，除了近端气道外，终末细支气管中也可见基底细胞的存在[23]。此外，先前被认为是终末分化的AT1细胞，在部分肺切除术的小鼠模型中显示出可塑性，可去分化为AT2细胞[24,25]。因此，具体的损伤修复机制可能存在的肺泡上皮细胞迅速恢复加速AT2细胞再生，以确保气体交换功能。

2.2。多能干细胞

胚胎干细胞(ESCs)分化为功能肺泡细胞的逐步方法已经成功建立[26–29]。诱导多能干细胞(iPSCs)是成体细胞的产物，这些细胞被重新编程为胚胎样状态，它们的使用已经成为开发患者特异性肺上皮细胞的一种有效策略。Huang等报道了一种生成FOXA2的优化方法⁺NKX2.1⁺来自人类最终内胚层细胞的祖细胞效率为86% [三十]。FOXA2⁺NKX2.1⁺祖细胞可分为基底细胞、棒状细胞、杯状细胞、纤毛细胞、AT1细胞和AT2细胞在活的有机体内和在体外(三十]。Gotoh等诱导人iPSCs形成NKX2-1⁺将表达羧肽酶M (CPM)的前肠内胚层细胞“腹侧化”，与人胎肺成纤维细胞进行三维共培养[31]。由此产生的CPM⁺类器主要含有AT2细胞，也有AT1细胞、纤毛细胞和杯状细胞，但不含倶乐细胞[31]。这些源自iPSC的AT2细胞表现出相似的成熟的人AT2细胞，包括的表型性质层状体样结构和表面活性剂的蛋白表达[31]。通过预处理NKX2-1, AT2细胞的诱导效率得到了显著提高⁺“腹侧化”前肠内胚层细胞[32]。然而，由胎儿或新生儿肺成纤维细胞重编程的人类诱导多能干细胞产生了相对同质的AT2和AT1细胞群体[33]。人ipsc衍生的AT2细胞表现出自我更新能力和免疫应答能力[32,34]。这些研究清楚地表明，由ipsc衍生的类器官产生的细胞系受到与器官发育相关的信号通路的严格控制。研究表明，成纤维细胞生长因子(FGF)信号可以促进前肠内胚层诱导成既有间充质细胞又有肺上皮细胞的人肺组织，主要包括基底细胞、纤毛细胞以及低丰度的AT2和AT1细胞[35]。

3.肺泡类器官的发育

成立肺泡化培养之前，人们认识到，饲养细胞（通常是成纤维细胞）是关键在体外基本碳酸钙的增长[20]。在首次报道肠上皮干细胞来源的类器官一年后，McQualter等人成功建立了大容量肺上皮细胞(包括干细胞/祖细胞)的类器官培养方法，并将小鼠原代肺基质细胞在24孔板上的transwell中分离[36,37]。这些肺干/祖细胞在1个月内形成类器官。通过将原代小鼠肺基质细胞替换为永生化MLg小鼠肺成纤维细胞(也称CCL206)，优化了样器培养，克服了分离原代小鼠肺成纤维细胞的困难，将样器培养时间缩短至1周[38,39)(图1)。然而，并非所有的肺成纤维细胞系都支持肺远端干/祖细胞的类细胞器培养。例如，另一种小鼠肺成纤维细胞系CCL39不支持肺远端干/祖细胞的类器培养。当MLg细胞过度生长时，其支持远端肺干/祖细胞的能力降低。这些发现表明，支持性成纤维细胞的分泌特性对于成功培养内源性肺干/祖细胞是至关重要的。从成纤维细胞培养中获得的条件培养基不太支持肺远端干/祖细胞的类器培养，可能是因为关键生长因子的浓度不足。当基质细胞被高浓度的FGF10和肝细胞生长因子取代时，远端肺干祖细胞产生的类细胞器集落形成能力较低，提示肺泡类细胞器发育需要其他生长因子。相反，分离的人远端肺上皮细胞，通常包括基底细胞，在缺乏间充质支持的情况下产生类器官[40]。人sc来源的AT2细胞不需要饲养细胞就能形成三维肺泡[34]。这些数据表明，自分泌生长因子在这类细胞中起重要作用。

的确,在体外样器培养为揭示肺内干细胞/祖细胞和生态位细胞之间的相互作用提供了一个有用的平台。Lee等人报道肺内皮细胞也支持BASC类细胞器培养[41]。小鼠AT2细胞在CD45存在下可形成类器官⁺F4/80⁺小鼠巨噬细胞[42]。样器官培养试验使我们能够容易地解决肺泡干/祖细胞和其他结构细胞和免疫细胞之间的相互作用。

除此之外在体外实验中，可进行肺远端上皮干祖细胞的类器培养离体。当远端肺祖细胞和基质凝胶的混合物皮下注射到小鼠背部时，形成上皮球体结构。当移植到肾包膜下，成人α6β4⁺AT2亚群细胞在1周内分化并再生上皮结构[17]。肾包膜下长时间的人psc源性肺上皮祖细胞的瀑样培养甚至可以产生分支结构[43]。一个明显的好处离体类细胞器培养是在球状结构上形成的毛细血管网，这在显微镜中看不到在体外试验。

人类远EpCAM⁺上皮细胞，包括AT2细胞，可以从外周肺组织标本通过磁珠分选（MACS）分离44]。这些EpCAM的共同培养⁺基质中含有MRC5人肺成纤维细胞的细胞可形成允许气道分化但不允许肺泡分化的类器官[44]。抑制TGF-可促进肺泡分化β在类器官受体信号从人类气道远端衍生ΔNp63⁺TTF-1⁺干细胞 [40]。人的ΔNp63⁺TTF-1⁺在FGF10和a存在的情况下，干细胞也能分化为气道纤毛细胞和俱乐部细胞γγ-分泌酶抑制剂[40]。人类AT2细胞通常从解离人体肺部通过其特异于人AT2细胞[荧光激活细胞分选（FACS）或MACS与使用的单克隆抗体，HTII-280，分离出的4,45]。在人类AT2细胞群中表达跨膜-4 l - 6家族成员-1 (TM4SF1)的wnt反应肺泡上皮祖细胞，通过流式细胞仪(FACS)从肺远端分离(hti -280)⁺/ TM4SF1⁺/ EpCAM⁺），在MRC5的存在下生成的3D肺泡类器官成纤维细胞同时包含AT2和AT1细胞[细胞19]。

除了手术切除的人肺组织，出于某些目的，从支气管肺泡灌洗液(BALF)中收集的人肺上皮细胞培养或直肠活检可产生类器官[46]。分离的人肺干/祖细胞可低温保存并解冻后进行类器官培养[47]。人ESC/iPSC系可从患者样本中产生，例如真皮成纤维细胞，用于在适当条件下肺泡类器官的发育[34]。

4.肺泡样器官分析

有机体的功能分析通常包括几个方面。首先，评估远端肺干/祖细胞的集落形成能力在体外细胞器检测基于菌落数量与被镀干细胞/祖细胞数量的百分比。小鼠AT2细胞的集落形成效率(CFE)在0.5 ~ 2%之间[48,49由于培养条件的差异，而远端气道干/祖细胞的CFE在0.5 ~ 4%之间[39,41]。人类AT2细胞的CFE范围为2 - 8% [19,47]。为了研究干细胞的自我更新能力，菌落被分解成单个细胞，随后在基底膜重复接种的组织体文化。后的器官样培养物的2-3代，干/祖细胞的自我更新能力可以通过通道之间比较CFE进行评估。第二，集落，通过直径或单个菌落的表面区域中测得的平均尺寸，反映了晶种干/祖细胞的增殖潜力或细胞表面允许所述膜渗透性的评价上肿胀诱导水通道和在类器官的细胞的分泌潜在[46,48]。可以用BrdU补充培养基，以便在器官样端培养中进行BrdU掺入分析[48]。或者，为了进一步评价干细胞/祖细胞的增殖，类器官培养物可以是固定的，嵌入式和切片用于免疫染色的Ki67 [48]。最后，通过AT2 (pro-SPC)和AT1 (T1)免疫染色切片来评估干细胞/祖细胞分化潜能的差异α如水通道蛋白细胞。通过定量聚合酶链反应，也可以收获类细胞器培养物，在转录水平上分析这些标记物。对肺泡样器官也可以进行大容量或单细胞水平的转录组分析。此外，类器官培养物还可以进行电子显微镜分析，以使所建立的单个类器官的一般结构形象化在体外或离体试验。

5.特发性肺纤维化的器官样建模

IPF以肺泡周围的肺组织渐进性纤维化瘢痕为特征，最终导致呼吸困难。TGF -β被上调并且在IPF和成纤维细胞在肺中的表型和功能调制激活。虽然博莱霉素诱导的小鼠模型和其他人有一些相似之处总额为人类IPF，他们未能如实地再现疾病的病理生理学[50]。许多在临床前动物研究中确定的候选药物在人类临床试验中失败，只剩下两种fda批准的用于治疗IPF的药物:吡非尼酮和nintedanib。Wilkinson等人通过TGF-处理诱导的人psc来源间充质细胞类器官，生成了类似于人IPF的进展性瘢痕模型β(51]。人类的PSC已显示功能生成肺泡上皮细胞[34]。通过使用CRISPR/Cas9引入Hermansky-Pudlak综合征(HPS)基因的移码突变，人类esc来源的肺器官样体出现纤维化改变，从而为鉴定可能与临床相关的IPF致病机制提供了平台在体外(52]。Surolia等人使用IPF患者的三维肺组织，发现抑制vimentin中间丝的组装在大多数受试者中降低了肺成纤维细胞的侵袭性[53]。此外，类器检测提供了评估IPF间充质龛功能改变的机会，这与远端肺祖细胞的增殖潜力有关[54]。3D类器官模型的开发创造了能够模拟人类远端肺结构、功能以及细胞和基质相互作用的系统，使临床前抗纤维化药物测试成为可能[55]。

破坏远端气道和肺泡上皮细胞的患者的痛苦，通常观察到从IPF [3.]。内源性肺上皮干细胞/祖细胞来源的类器官测定为了解成人远端肺疾病的机制提供了一个独特的平台。在IPF小鼠疾病模型中，气管内灌注博莱霉素导致AT2祖细胞丢失[56]。存活的AT2细胞增殖分化，补充肺泡上皮。肺泡纤维化闭塞的发展被认为是受损肺泡上皮修复不完全所致，这与存活的干细胞/祖细胞(包括AT2细胞)的修复能力密切相关[57,58]。另外，作为肺泡的表面活性剂产生细胞，AT2细胞分泌的表面活性剂，以保持表面张力和肺泡开放。在这些表面活性剂的突变与发病机制IPF的一些家族性和散发的形式在人类和IPF动物模型[关联59–62]。因此，利用IPF患者AT2细胞和/或其他肺泡干祖细胞的样器培养，可以检测这些干祖细胞的修复和/或分泌功能。通过筛选促进肺泡干祖细胞再生能力的细胞，使表面活性物质分泌恢复到正常水平，优化药物治疗。

肺结核6.类器官建模

自从1832年发现的由罗伯特·科赫，结核分枝杆菌(结核)仍然是全球人口的一大健康威胁，特别是在东南亚和一些非洲国家[63]。根据世卫组织的一份结核病报告，在过去5年中，每年确认有近1000万新结核感染病例。耐药菌株和艾滋病毒的同时感染正在挑战世界卫生组织提出的到2035年消灭结核病的战略[64]。用于研究结核病病理和药物筛选的动物模型有几个明显的缺陷。首先，饲养感染结核分枝杆菌的动物的设施通常很昂贵，这阻碍了它在结核病研究中的广泛使用。此外，动物并非MTB的自然宿主，仅部分模拟TB的临床体征、特征性病理病变(肉芽肿形成、肺空化)和免疫指标[65,66]。因此，有机体是一种很有前途的技术来研究宿主- mtb的相互作用在一个盘子。利用不同的技术已经成功地建立了人的肺类器官[46,67,68]。人肺类器官的明显优势在于其空间组织和细胞成分的异质性。肺泡类器官的MTB感染不仅可以包含动物模型难以遵循的非常早期的MTB，而且还可以克服物种差异[68]。在这种情况下，可以通过将MTB注射到已发育的类器官中来研究肺泡类器官与肺上皮之间的直接相互作用，这些类器官通常可以长到500μ米直径。或者，免疫细胞，包括巨噬细胞，可以引入到类器官结构来模拟在活的有机体内免疫反应的复杂性。

7.呼吸道病毒感染的类器官模型

肺远端病毒感染与肺炎进展为急性呼吸窘迫综合征有关。呼吸道病毒，包括COVID-19，以肺上皮细胞为靶，包括AT2细胞[2]。流感病毒在小鼠气管内感染后靶向AT2和AT1细胞[69]。人类呼吸道感染的研究由于缺乏可模仿的功能模型而受到限制在活的有机体内生理学及病理生理学[70]。的建立在体外类器官培养为研究疾病发病机制和宿主-病毒相互作用提供了卓越的模型系统。Porotto等人观察到人副流感病毒3 (HPIV3)在hPSCs衍生的三维肺器官中传播，并在器官中感染了AT2细胞[71]。与HPIV3感染的临床观察结果一致，在这些类器官中未观察到组织完整性的改变和感染细胞进入管腔的脱落[71]。呼吸道合胞病毒(RSV)感染的人肺器官来源于hPSCs的形态学分析显示，大量的上皮改变再现在活的有机体内病理，包括感染细胞的根尖挤压、细胞骨架重排和合胞体形成[43]。RSV很容易在人气道类器官中复制，而palivizumab抗体可以阻止RSV进入气道类器官[72]。Palivizumab和其他抗病毒药物也可在肺泡类器官中评估其抗病毒能力。已建立类似的有机体，以迅速评估新出现的流感病毒对人类的传染性[73,74]。因此，这种有机技术可以应用于研究宿主-病原体的相互作用在一系列肺部病原体。

8.结论和观点

肺泡上皮的破坏与各种难治性呼吸道疾病有关。类器官技术为研究细胞-细胞串扰和宿主-病原体相互作用提供了一种新的病理模型，为人类肺部疾病建模、药物筛选和毒性分析提供了一个强有力的平台。这个工具可以代替一些动物实验，从而减少动物在呼吸研究中的使用(图)2)。人肺组织体的银行可以为细胞或基因疗法来确定。生成个性化的组织体也将开放新途径研究，以治疗个体反应，从而也为个性化医疗的实施。然而，仍然有使用类器官技术，远端肺疾病模型的限制。从其他器官不同，肺部气体交换过程中充气和放气，产生的力，目前很难在组织体模型。最重要的是，还缺乏建立在体外肺泡类器官具有发达的血管系统，尽管血管生长在植入的类器官之上离体。毫无疑问，未来优化的有机体技术将继续显著推进基础，治疗和临床研究的呼吸系统疾病在未来几十年。

缩写

at₂:	肺泡2型细胞
过时:	Bronchioalveolar干细胞
IPF:	特发性肺纤维化
RSV:	呼吸道合胞体病毒
支气管肺泡灌洗液：	支气管肺泡灌洗液
CFE:	克隆形成
百慕大:	结核分枝杆菌
ESCs:	胚胎干细胞
iPS细胞：	诱导多能干细胞。

泄露

资助者与手稿的撰写没有任何关系。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

y.l.进行了文献检索并准备了手稿。h.c.准备了数据，编辑了评论，并监督了手稿的准备工作。Q. W.、X. S.和J. S.编辑了这篇评论。所有作者都认可了最终版本的手稿。

致谢

对于因篇幅限制而未能在此引用相关作品的作者，我们深表歉意。本研究由国家自然科学基金(31471121、81773394、81970001)和天津市自然科学基金(17JCYBJC24700、18ZXDBSY00150、19JCZDJC33600、16ZXHLSY00130)资助。

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