炎症对龈间充质干细胞/祖细胞通过微穿孔膜增殖和迁移的影响:体外研究

抽象

背景。在牙周引导组织再生领域，微穿孔膜是一种非常有前途的牙周再生组织工程工具。使用牙龈间充质干细胞/祖细胞结合这些新型膜的再生牙周方法，将主要发生在口腔内炎症的微环境条件下。这进而需要研究炎症如何影响牙龈间充质干细胞/祖细胞的增殖和迁移动力学。材料和方法。对取自牙龈炎症组织的人牙龈间充质干细胞/祖细胞克隆体的干细胞/祖细胞特性进行了表征，并与健康的人牙龈间充质干细胞克隆体进行了比较( ),随后将被接种在多孔的胶原包被的聚四佛洛罗 - 乙烯（PTFE）膜具有孔径为0.4和3微米和8微米聚碳酸膜在Transwell小室系统孔径。人口倍增时间和两个群体的MTT试验确定。胎牛血清（FBS）用作在培养系统的化学引诱物，两组进行比较，以不含FBS其阴性对照。接下来的24小时温育期，迁移细胞在微穿孔膜和所述膜 - 接种的细胞的底面测定用扫描电子显微镜检查。结果。GMSCs显示了所有预定义的干细胞/祖细胞特性。牙龈发炎组织的GMSCs数量翻倍时间明显缩短。炎症组织和健康组织的GMSCs对趋化剂的迁移能力没有显著差异，在没有胎牛血清的情况下没有观察到细胞迁移。来自健康牙龈组织的gmsc通过较大的微孔(8微米)迁移效果显著。扫描电镜图像证实了细胞通过膜孔的迁移活动。结论。出现炎症，以提高GMSCs的增殖能力。在移民方面，通过膜孔，健康以及发炎的牙龈组织GMSCs不会通过小孔径展示他们的迁移能力的差异，而从健康的牙龈组织GMSCs出现较大的通过微孔显著更好地迁移。

1.介绍

牙周炎是一种与细菌生长失调有关的炎症性退行性疾病，如果不治疗，会导致支持牙齿的组织渐进性流失[1,2]。牙龈间充质干细胞/祖细胞(GMSCs)表现出多能分化能力[3.和牙周再生的潜力[3.- - - - - -5]。它们还在调节周围微环境的炎症反应中发挥关键作用[6- - - - - -8]。

梅尔彻是第一个描述引导组织再生（GTR），并承诺为牙周装置的完全再生[9]。贾迈勒和Iacono相比GTR用于穿孔的胶原膜传统闭合屏障膜（OM），得出的结论是后者具有优异的临床结果相关[10]。最近，来自健康牙龈组织来源的GMSCs在化学引诱剂存在下通过适当孔径的微穿孔膜选择性迁移的能力得到了明确证明[1]。开发选择性引导组织再生膜的前景将是组织工程介导牙周再生领域的一种有前途的工具，这种膜允许干细胞/祖细胞通过膜迁移，同时阻断不需要的细胞系，即上皮细胞和纤维结缔组织细胞。

本研究的目的是确定和比较来自健康和提取GMSCs的电位发炎的牙龈组织增殖和迁移通过体外微穿孔新颖膜，另外探索在这个过程中经典FBS趋化因子的作用。

2.材料和方法

2.1。样本的选择

在纽约长岛石溪大学牙周护理诊所进行常规牙周治疗时，从废弃的牙龈标本中提取牙龈结缔组织样本。本研究共纳入四名受试者，两名为健康牙龈组织标本，两名为发炎牙龈组织标本。每组实验重复三次( )。从所有参与者获得知情同意书。该研究经研究涉及在石溪大学和艾因夏姆斯大学科学伦理委员会（IRB号575741）人体试验委员会。

2.2。牙龈组织细胞培养的建立

在4℃下过夜，将牙龈组织标本切片并在2 mg/ml碟酶II (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)中消化，然后在4℃下用2 mg/ml胶原酶IV (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)消化40分钟。合成的细胞悬浮液经a40过滤μm cell strainer and centrifuged for 10 minutes at 1200 rpm. Single-cell suspensions were subsequently plated at a concentration of 60 cells/cm²在10 cm的组织培养皿中，在含10%胎牛血清(胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;Hyclone, Thermo Fisher Scientific)， 50 U/ml青霉素G与50μg/ml链霉素，2.5μg/ml两性霉素B (fungizone, Thermo Fisher Scientific₂)。细胞在P100培养皿中传代。使用P10平板进行菌落形成单元(CFU)试验。

2.3。群体倍增时间测定

如先前所述测定群体倍增时间[11]。简单地说，GMSCs被播种在 细胞/厘米²在24孔板中，扩张至约90%融合，用0.05%胰蛋白酶/EDTA分离，计数。随后，GMSCs被重新播种于 细胞/厘米²放入另一个24孔板，培养到体外细胞衰老。每次传代细胞计数，按以下公式计算细胞倍增次数:

最后，计算了GMSC种群翻倍时间值。

2.4。流式细胞术表达msc相关标记

从第四和第五通道GMSCs用PBS洗涤两次，用分离的0.05％胰蛋白酶/ EDTA，并再悬浮于封闭缓冲液中的1％牛血清白蛋白为半小时。约 2 . 4℃孵育半小时μg / ml异硫氰酸荧光素(FITC)共轭鼠单克隆抗体特定人类CD73及其同形像控制(BD Pharmigen,圣何塞,加利福尼亚,美国),APC-conjugated CD90及其同形像控制鼠单克隆抗体(BD Pharmigen), Alexa 555痛风anti-mouse主要非结合的鼠单克隆抗体CD105 (Dako)及其控制Alexa 555痛风anti-mouse没有主要鼠抗体,和pe标记的小鼠CD146单克隆抗体及其同型对照(BD Pharmingen)。在造血标志物方面，使用了针对CD14、CD34、CD45的小鼠单克隆抗体及其同型对照。细胞洗涤、离心、重悬两次，流式细胞仪分析。

2.5。体外分化能力

2.5.1。成骨分化

GMSCs分别在接种 每平方厘米的细胞²在成骨诱导培养基六孔板（GIBCO，茎Pro）的，并且介质每周更换两次，持续28天[12] [13]。随后,井与PBS洗两次,60分钟的细胞被固定用4%多聚甲醛在室温下,用蒸馏水洗两次,茜素红染色2% 45分钟在黑暗中,最后用蒸馏水洗四次,两次在PBS。

2.5.2。脂肪形成的分化

GMSCs分别在接种 每厘米²6孔板脂肪诱导培养基(Gibco, Stem Pro)，培养基每周更换两次，共28天[13,14]。随后，将孔用PBS洗涤两次，并固定在4％多聚甲醛将细胞在室温下60分钟，在蒸馏水中洗涤两次。After washing with 60% isopropanol for 5 minutes, the formation of lipid-laden fat cells was detected in 24-well plates by staining for 5 minutes with Oil Red O in isopropanol (300 mg oil red in 100 ml isopropanol) diluted in distilled water in a ratio of 3 : 2. Finally, the cultures were washed with tap water and stained with hematoxylin for 1 minute and then washed again with tap water and viewed under the phase-contrast inverted microscope.

2.5.3。软骨分化

GMSCs分别在接种 每厘米²6孔板培养成软骨诱导培养基(Gibco, Stem Pro)，培养基每周更换两次，共28天。28天后PBS洗涤2次，室温下4%多聚甲醛固定60分钟。用蒸馏水冲洗两次，细胞用Alican blue (10mg在60ml乙醇和40ml醋酸)在黑暗中染色过夜，使形成的任何软骨糖蛋白染色为蓝色。最后去孔(120 ml乙醇和80 ml醋酸)20分钟，PBS洗2次，显微镜下观察培养物。

2.6。MTT试验

GMSCs接种于500的分光光度计管中μl alpha MEM (Gibco)和10% FBS (Hyclone, Fisher Scientific)。使用细胞游离管作为对照。将试管置于加湿的空气中(37℃，5% CO)₂)一天。100年μl的MTT加入试管中孵育4小时。媒体受到追捧，1000人μ每管中加入l的DMSO。分光光度计读出每个样品在595 nm波长处的吸光度。

2.7。迁移分析

2.7.1。微观多孔膜

细胞迁移测定在Transwell趋化室进行，有两种膜(康宁生命科学)，即12毫米胶原涂层聚四氟乙烯(PTFE)膜插入0.4μ米和3 μm孔和6.5毫米聚碳酸酯膜插入8μm毛孔。使用0.05%胰蛋白酶/EDTA收获GMSCs，并在无血清的alpha MEM中重悬。1×10⁴GMSCs被播种在上层隔间。实验组给予含10%胎牛血清的- MEM (Hyclon, Fisher Scientific)，对照组则在下室使用不含血清的- MEM。在37℃，5% CO的加湿环境中孵育₂)。24小时后，抽吸培养基，PBS洗涤插入物两次。业务上表面的膜被用棉签,和细胞迁移到较低的一侧固定有4%多聚甲醛2分钟,洗两次在PBS, permealized 100%甲醇20分钟和沾结晶紫染色(1%,80%乙醇,Sigma-Aldrich)。PBS洗涤2次，在40倍放大的光镜下观察。

2.7.2。扫描电子显微镜

Transwell膜被切断插入物，固定在4%的PFA中，然后等待干燥。将膜标本在50%、70%、80%、90%和100%的乙醇中分别脱水10分钟。最后，标本在-80℃的封闭箱内过夜，并在电子显微镜下观察。

2.7.3。统计评估

两组结果的差异是用Mann-Whitney进行的测试（SPSS V20程序，IBM）假设等方差和非参数分布，在显着性组值 。实验重复三次进行。图表是使用Microsoft Excel 2007（图绘制1)。

3.结果

3.1。克隆形成单位分析

经过14天的体外培养，牙龈细胞悬浮液(1000个/毫升)在P10培养皿中形成了具有典型成纤维细胞形态的独特菌落。每组实验共进行三次。健康组与牙龈发炎组的菌落数目并无显著差异( ;曼 - 惠特尼测试;数字2)。

3.2。人口翻倍试验

两组GMSC均表现出显著的增殖能力。然而，炎症组的人口翻倍时间明显少于健康组( ;曼 - 惠特尼测试;数字2)。

3.3。MSC标记的流式细胞仪表达

在第4代和第5代，培养的GMSCs表达了msc相关标志物CD105、CD73、CD90和CD146，而缺乏造血标志物CD14、CD34和CD45的表达(图)2)。

3.4。多向分化能力

在成骨诱导培养基、成软骨诱导培养基和成脂诱导培养基中培养GMSCs 28天，分化能力显著，分别用茜素红、美国蓝和油红证实了这一点。对照组使用相同的染色剂，在10%血清- MEM培养基中生长，未显示任何细胞分化的迹象(图)2)。

3.5。MTT试验

的可行性和GMSCs的代谢活性表现在分别健康和发炎组，实验组和对照组之间没有差异显著，使用MTT在通道5（ ;曼 - 惠特尼测试）。

3.6。Transwell迁移分析

3.6.1。微观多孔膜

(1) 0.4 μm and 3 μm Perforated Collagen-Coated PTFE Membranes。GMSCs显著迁移到3μm和0.4 μ米孔的化学引诱物相比于对照组。迁移是一个比通过与8膜注意到下 μm毛孔。无显著差异，在健康与发炎组织分离出的GMSCs的迁移模式发现。比较从健康细胞通过0.4迁移中位数以及发炎的克隆 μm和3μm气孔无显著差异，健康组的平均排名为12.6，发炎组的平均排名为18.40，健康组的平均排名为14.30，发炎组的平均排名为16.70 ( ,曼 - 惠特尼测试;数字3.)。

(2) 8米多孔聚碳酸酯膜。放大40倍和流动媒体的仪检测在下部隔室不能检测到任何浮动血清和无血清组中的细胞。显著相比，具有19.53的健康为红肿，分别平均秩和11.47从发炎者GMSCs（更高的迁移是有利于健康的牙龈组织GMSCs的显着 ;曼 - 惠特尼 ;数字4)。

3.7。扫描电子显微镜检查

炎症组织和健康组织的GMSCs没有差异。通过聚碳酸酯膜迁移的GMSCs看起来更扁平，并分布在膜上，与通过胶原膜迁移的细胞相比，胶原膜看起来更像球根状，并被限制在胶原蛋白的链上(图)4 (d)和3 (c))。

4.讨论

牙周炎是一种与细菌生长失调有关的牙齿支撑结构的炎症性疾病[15]。在炎症牙周病以及在任何牙周愈合的初期阶段的过程中，GMSCs与他们的炎症微相互作用，影响它们的细胞的属性[6]。本实验研究从健康分离GMSCs的增殖和迁移电位，并通过与不同孔径的膜发炎在存在和不存在FBS的趋化如牙龈组织（0.4 μ米,3μ8 m,μm)体外。假设炎症会影响GMSCs的增殖和迁移。

所研究的GMSCs具有所有预定义的msc标记，即CD105、CD90和CD73，以及CD146、CFUs，并具有显著的向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化的多谱系潜能[8,14,16,17]。有趣的是，与来自健康牙龈组织的GMSCs相比，来自发炎牙龈组织的GMSCs与早期研究相似[18- - - - - -21)，其增殖速度明显加快，种群翻倍时间明显缩短。

在本研究中，FBS被用作化学引诱物，以评估GMSCs的迁移活性通过超微细孔被检查的膜。10000个GMSCs在上部隔室中的播种被认为适合于容易地识别迁移的细胞在所述膜的下部分。在24小时的间隔中的迁移率取决于孔径变化。甲显著差异，在血清驱动的迁移组表现出与对照组相比，在那里GMSCs积极迁移通过膜朝向在下隔室的血清毛孔孔径，重力影响，或流体扩散无关。

从健康GMSCs以及通过0.4迁移炎症组织的起源 μ米和3 μ米毛孔没有显著差异。然而，有在细胞显著差异的较大的情况下，8移民工作 μ米的孔，其中，从健康组织的细胞迁移始发更积极。这种奇特的发现表明，8 μm孔虽然直径更大，但可能根据炎症状态对GMSCs有选择性迁移作用。此外，观察到的差异可能归因于胶原膜的结构特征，与聚碳酸酯相比，健康的组织来源细胞更容易附着在胶原上，促进其通过聚碳酸酯膜迁移。

SEM分析无法确定从健康和发炎组织来源的GMSCs之间的任何形态差异。GMSCs展示了SEM下成纤维细胞样形态。然而，附着在聚碳酸酯膜GMSCs看起来平坦，并显示更伪足，而在胶原涂覆的PTFE膜的粘附GMSCs有一个粗糙的表面，符合胶原股线的形状。所附GMSCs的所观察到的形态差异可以在很大程度上归因于膜粗糙度的变化[22- - - - - -24]，并且与在衬底上的对附着细胞的形态[效果以前的调查一致25,26]。这些发现与以前的调查[进一步一致27，在聚碳酸酯膜和胶原膜上显示出不同的GMSC形态。

五，结论

牙龈组织的炎症并不影响其中多能间充质干细胞/祖细胞的存在。虽然炎症似乎明显提高扩散是通过人口倍增时间短,关于迁移动力学,数量没有显著差异迁移业务通过不同的膜微孔尺寸在健康和组织发炎,除了有大量微孔大小、业务从健康组织表现出更高的迁徙活动。没有化学引诱剂，就不会发生迁移。目前的研究结果揭示了炎症和GTR膜孔径大小对GMSC不同属性的影响，这对牙周修复/再生至关重要，并为膜驱动牙周组织再生的新概念的形成迈出了第一步。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是在研究成果可用，更多的细节或照片都请直接从相应的作者。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Al Bahrawy M和El-Sayed K对该手稿的编辑贡献相同。

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M. Al Bahrawy等人版权所有这是一篇开放获取下发布的文章知识共享署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。