SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/5373418 5373418 研究论文 炎症对龈间充质干细胞/祖细胞通过微穿孔膜增殖和迁移的影响:体外研究 https://orcid.org/0000-0002-8069-0069 铝Bahrawy M。 1 加法尔 K。 1 贾迈勒 一个。 1 埃尔 - 赛义德 K。 2 3 Iacono V。 4 Moshaverinia 阿里 1 口腔及牙科医学院 Ain Shams大学 开罗 埃及 asu.edu.eg 2 口腔及牙周病科 牙科学院 开罗大学 埃及 cu.edu.eg 3 保守牙科和牙周病临床 基尔大学的Christian Albrechts 德国 uni-kiel.de 4 牙科学院 石溪大学 纽约 美国 stonybrook.edu 2020 21 2 2020 2020 31 07 2019 18 10 2019 25 11 2019 21 2 2020 2020 版权所有©2020 M.铝Bahrawy等。 这是一篇在知识共享署名许可下发布的开放访问的文章，该许可允许在任何媒介上不受限制地使用、发布和复制，只要原稿被正确引用。

背景。在牙周引导组织再生领域中，微穿孔膜最近已被证明是非常有前途的牙周组织再生工程工具。再生牙周接近，采用牙龈间充质干细胞/祖细胞，结合这些新型膜，将主要发生在发炎的微环境条件口腔内。这反过来又需要在调查炎症如何影响扩散以及牙龈间充质干/祖细胞的迁移动态。 材料和方法。对取自牙龈炎症组织的人牙龈间充质干细胞/祖细胞克隆体的干细胞/祖细胞特性进行了表征，并与健康的人牙龈间充质干细胞克隆体进行了比较( ñ = 3 ），随后将被接种在穿孔胶原涂覆的聚四佛洛罗 - 乙烯（PTFE）膜具有孔径为0.4和3微米和8微米聚碳酸膜在Transwell小室系统孔径。人口倍增时间和两个群体的MTT试验确定。胎牛血清（FBS）用作在培养系统的化学引诱物，两组进行比较，以不含FBS其阴性对照。接下来的24小时温育期，迁移细胞在微穿孔膜和所述膜 - 接种的细胞的底面测定用扫描电子显微镜检查。 结果。GMSCs显示了所有预定义的干细胞/祖细胞特性。牙龈发炎组织的GMSCs数量翻倍时间明显缩短。炎症组织和健康组织的GMSCs对趋化剂的迁移能力没有显著差异，在没有胎牛血清的情况下没有观察到细胞迁移。来自健康牙龈组织的gmsc通过较大的微孔(8微米)迁移效果显著。扫描电镜图像证实了细胞通过膜孔的迁移活动。 结论。炎症似乎能增强GMSCs的增殖能力。在膜孔迁移方面，健康牙龈组织和发炎牙龈组织的GMSCs通过较小的孔迁移能力没有差异，而健康牙龈组织的GMSCs通过较大的微孔迁移能力明显更好。

 1.简介

牙周炎是与细菌生态失调相关的炎性退行性疾病，导致如果未处理到牙齿支持组织的进行性丧失[ 1， 2]。牙龈间充质干细胞/祖细胞（GMSCs）表现出多向分化能力[ 3和牙周再生的潜力[ 3- 五]。他们在调节在其周围的微环境中的炎症反应[进一步发挥了举足轻重的作用 6- 8]。

Melcher是第一个描述引导组织再生(GTR)的人，他承诺牙周设备可以完全再生[ 9]。贾迈勒和Iacono相比GTR用于穿孔的胶原膜传统闭合屏障膜（OM），得出的结论是后者具有优异的临床结果相关[ 10]。最近，从健康齿龈组织起源GMSCs的，以选择性地通过微穿孔膜具有合适的孔径大小在化学引诱物的存在下迁移的能力清楚地证实[ 1]。显影选择性引导组织再生膜，允许干/祖细胞通过它们迁移，前景而被闭塞不希望的细胞系，即，上皮细胞和纤维结缔组织的细胞，将代表组织的领域中的有前途的工具工程介导的牙周组织再生。

本研究的目的是确定和比较从健康和发炎牙龈组织中提取的GMSCs在体外通过新型微穿孔膜增殖和迁移的潜力，并探索经典胎牛血清化学引诱因子在这一过程中的作用。

 2.材料和方法 2.1。样本的选择

在纽约长岛石溪大学牙周护理诊所进行常规牙周治疗时，从废弃的牙龈标本中提取牙龈结缔组织样本。本研究共纳入四名受试者，两名为健康牙龈组织标本，两名为发炎牙龈组织标本。每组实验重复三次( ñ = 3 )。所有参与者均知情同意。这项研究得到了石溪大学人体研究委员会和安·沙姆斯大学科学伦理委员会(IRB编号575741)的批准。

 2.2。牙龈组织细胞培养的建立

在4℃下过夜，将牙龈组织标本切片并在2 mg/ml碟酶II (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)中消化，然后在4℃下用2 mg/ml胶原酶IV (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)消化40分钟。合成的细胞悬浮液经a40过滤 μm细胞过滤器，1200 rpm离心10分钟。随后以60个细胞/cm的浓度镀单细胞悬浮液2在10 cm的组织培养皿中，在含10%胎牛血清(胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;Hyclone, Thermo Fisher Scientific)， 50 U/ml青霉素G与50 μ克/ ml链霉素，和2.5  μg/ml两性霉素B (fungizone, Thermo Fisher Scientific2)。细胞在P100培养皿中传代。使用P10平板进行菌落形成单元(CFU)试验。

 2.3。群体倍增时间测定

人口翻倍时间的确定如上文所述[ 11]。简单地说，GMSCs被播种在 五 × 10 3 细胞/厘米2在24孔板中，扩张至约90%融合，用0.05%胰蛋白酶/EDTA分离，计数。随后，GMSCs被重新播种于 五 × 10 3 细胞/厘米2放入另一个24孔板，培养到体外细胞衰老。每次传代细胞计数，按以下公式计算细胞倍增次数: （1） 日志 2 最后 细胞 数量 日志 2 播种 细胞 数量 。

最后，计算出GMSC人口群体倍增时间值。

 2.4。流式细胞术表达msc相关标记

第4、5代的GMSCs用PBS洗涤2次，0.05%胰蛋白酶/EDTA分离，1%牛血清白蛋白阻断缓冲液重悬半小时。约 1 × 10 五 2 . 4℃孵育半小时 μg / ml异硫氰酸荧光素(FITC)共轭鼠单克隆抗体特定人类CD73及其同形像控制(BD Pharmigen,圣何塞,加利福尼亚,美国),APC-conjugated CD90及其同形像控制鼠单克隆抗体(BD Pharmigen), Alexa 555痛风anti-mouse主要非结合的鼠单克隆抗体CD105 (Dako)及其控制Alexa 555痛风anti-mouse没有主要鼠抗体,和pe标记的小鼠CD146单克隆抗体及其同型对照(BD Pharmingen)。在造血标志物方面，使用了针对CD14、CD34、CD45的小鼠单克隆抗体及其同型对照。细胞洗涤、离心、重悬两次，流式细胞仪分析。

 2.5。体外分化能力 2.5.1。成骨分化

GMSCs被播种在 8 × 10 3 细胞每厘米2在成骨诱导培养基六孔板（GIBCO，茎Pro）的，并且介质每周更换两次，持续28天[ 12][ 13]。随后,井与PBS洗两次,60分钟的细胞被固定用4%多聚甲醛在室温下,用蒸馏水洗两次,茜素红染色2% 45分钟在黑暗中,最后用蒸馏水洗四次,两次在PBS。

 2.5.2。成脂诱导分化

GMSCs被播种在 8 × 10 3 每厘米26孔板脂肪诱导培养基(Gibco, Stem Pro)，培养基每周更换两次，共28天[ 13， 14]。PBS洗涤2次，室温下4%多聚甲醛固定60分钟，蒸馏水洗涤2次。用60%异丙醇洗涤5分钟后，在24孔板上用异丙醇油红O (100 ml异丙醇300 mg油红)染色5分钟，以3:2的比例稀释蒸馏水，检测含脂脂肪细胞的形成。最后用自来水冲洗，苏木精染色1分钟，再用自来水冲洗，在相衬倒置显微镜下观察。

 2.5.3。Chondrogenic分化

GMSCs被播种在 8 × 10 3 每厘米2在六孔板和软骨形成诱导培养基中培养（GIBCO，茎Pro）的，并且介质每周更换两次，持续28天。28天之后，将孔用PBS洗涤两次，并固定在4％多聚甲醛将细胞在室温下60分钟。The wells were washed twice with distilled water, and the cells were stained with Alican blue (10 mg in 60 ml ethanol with 40 ml acetic acid) overnight in the dark to stain any formed cartilage glycoproteins blue. The wells were finally destained (120 ml ethanol with 80 ml acetic acid) for 20 minutes and washed twice with PBS, and the cultures examined under the microscope.

 2.6。MTT法

GMSCs接种于500的分光光度计管中 μl alpha MEM (Gibco)和10% FBS (Hyclone, Fisher Scientific)。使用细胞游离管作为对照。将试管置于加湿的空气中(37℃，5% CO)2)一天。100年 μl的MTT加入试管中孵育4小时。媒体受到追捧，1000人 μ每管中加入l的DMSO。分光光度计读出每个样品在595 nm波长处的吸光度。

 2.7。迁移分析 2.7.1。微观打孔膜

细胞迁移测定在Transwell趋化室进行，有两种膜(康宁生命科学)，即12毫米胶原涂层聚四氟乙烯(PTFE)膜插入0.4 μ米和3  μm pores and 6.5 mm polycarbonate membrane inserts with 8  μ米毛孔。GMSCs使用0.05％胰蛋白酶/ EDTA，再悬浮于无血清的αMEM收获。1 × 104GMSCs在上腔接种。实验组接收的αMEM，用10％胎牛血清（Hyclon，Fisher Scientific公司），而在对照组中，在下部隔室中使用的无血清的αMEM。将板在湿润的气氛中温育（37℃，5％CO2)。24小时后，抽吸培养基，PBS洗涤插入物两次。业务上表面的膜被用棉签,和细胞迁移到较低的一侧固定有4%多聚甲醛2分钟,洗两次在PBS, permealized 100%甲醇20分钟和沾结晶紫染色(1%,80%乙醇,Sigma-Aldrich)。PBS洗涤2次，在40倍放大的光镜下观察。

 2.7.2。扫描电子显微镜

在Transwell小膜切断刀片，PFA固定在4％，和放置干燥。将膜标本在10分钟进行各浓度的一系列的50％，70％，80％，90％和100％乙醇脱水。最后，将样品在封闭的盒子在-80℃下放置过夜，并在电子显微镜检查。

 2.7.3。统计评价

两组结果的差异是用Mann-Whitney进行的 ü 检验(SPSS v20程序，IBM)，假设方差相等，非参数分布，显著性设为 p < 0.05 。试验分三次进行。使用Microsoft Excel 2007绘制图表(图) 1)。

从健康和发炎的牙龈组织中分离的经过不同孔径的迁移GMSCs的平均计数。

 3.结果 3.1。克隆形成单位分析

经过14天的体外培养，牙龈细胞悬浮液(1000个/毫升)在P10培养皿中形成了具有典型成纤维细胞形态的独特菌落。每组实验共进行三次。健康组与牙龈发炎组的菌落数目并无显著差异( p > 0.05 ;Mann-Whitney ü 测试;数字 2)。

(a)流式细胞术分析健康牙龈组织表面标记物CD90、CD73和CD105的表达。(b)流式细胞术分析牙龈炎症组织中CD90、CD73和CD105的表面标记物表达。(c)成骨培养基中GMSCs钙沉积茜素红染色、成脂培养基中GMSCs油滴油红染色、成软骨培养基中GMSCs软骨糖蛋白Alican blue染色及对照。(d)用健康和发炎牙龈组织GMSCs的平均值和标准差进行群体倍增时间测定，炎症组的群体倍增时间明显缩短。(e)显示健康和发炎牙龈组织中gmsc的菌落形成单位测定方法和标准差的图表。

 3.2。人口翻倍试验

两组GMSC均表现出显著的增殖能力。然而，炎症组的人口翻倍时间明显少于健康组( p < 0.05 ;Mann-Whitney ü 测试;数字 2)。

 3.3。MSC标记的流式细胞仪表达

在第4代和第5代，培养的GMSCs表达了msc相关标志物CD105、CD73、CD90和CD146，而缺乏造血标志物CD14、CD34和CD45的表达(图) 2)。

 3.4。Multilineage分化能力

28天的成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞和电感媒体GMSCs的培养表现出非凡的多向分化的能力，这是通过使用茜素红，蓝爱丽丝和油红，分别证明。使用关于在10％血清的αMEM培养基中生长的对照组相同的污迹没有证明细胞分化的任何迹象（图 2)。

 3.5。MTT法

的可行性和GMSCs的代谢活性表现在分别健康和发炎组，实验组和对照组之间没有差异显著，使用MTT在通道5（ p > 0.05 ;Mann-Whitney ü 测试)。

 3.6。跨孔迁移实验 3.6.1。微观打孔膜

（1）0.4 μm and 3 μm Perforated Collagen-Coated PTFE Membranes。GMSCs显著迁移到3 μm和0.4  μ米孔的化学引诱物相比于对照组。迁移是一个比通过与8膜注意到下  μ米毛孔。无显著差异，在健康与发炎组织分离出的GMSCs的迁移模式发现。比较从健康细胞通过0.4迁移中位数以及发炎的克隆  μm和3 μ米孔隙表明12.6的健康和18.40为一平均等级发炎以及发炎，分别为14.30和健康16.70为一个平均等级没有显著差异（ p > 0.05 ,Mann-Whitney ü 测试;数字 3)。

3微米孔径下腔室迁移的GMSCs的典型图像，在胶原包覆的PTFE膜上有(a)炎症组织的GMSCs和(b)健康组织的GMSCs。(c) SEM图像显示迁移的GMSCs通过穿孔胶原涂层聚四氟乙烯膜的3微米孔。

(2) 8米多孔聚碳酸酯膜。放大40倍和流动媒体的仪检测在下部隔室不能检测到任何浮动血清和无血清组中的细胞。显著相比，具有19.53的健康为红肿，分别平均秩和11.47从发炎者GMSCs（更高的迁移是有利于健康的牙龈组织GMSCs的显着 p = 0.011 ;Mann-Whitney ü ;数字 4)。

(a)代表图像8 μ当使用牛血清作为化学引诱剂时，m穿孔的聚碳酸酯膜下隔室有迁移的细胞(细胞被结晶紫染色;10000个细胞被植入上隔室)。(b)无血清对照组细胞膜下方，未见细胞迁移。(c)下室5个随机视野计数，40倍放大(血清组)。(d) GMSCs在穿孔的聚碳酸酯膜上聚集超过8微米孔的SEM图像，细胞过程仍在其中一个膜孔内。

 3.7。扫描电镜检查

炎症组织和健康组织的GMSCs没有差异。通过聚碳酸酯膜迁移的GMSCs看起来更扁平，并分布在膜上，与通过胶原膜迁移的细胞相比，胶原膜看起来更像球根状，并被限制在胶原蛋白的链上(图) 4 (d)和 3 (c))。

 4。讨论

牙周炎是一种与细菌生长失调有关的牙齿支撑结构的炎症性疾病[ 15]。在炎症牙周病以及在任何牙周愈合的初期阶段的过程中，GMSCs与他们的炎症微相互作用，影响它们的细胞的属性[ 6]。本实验研究从健康分离GMSCs的增殖和迁移电位，并通过与不同孔径的膜发炎在存在和不存在FBS的趋化如牙龈组织（0.4  μ米,3 μ米，并且8  μm)体外。假设炎症会影响GMSCs的增殖和迁移。

所研究的GMSCs具有所有预定义的msc标记，即CD105、CD90和CD73，以及CD146、CFUs，并具有显著的向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化的多谱系潜能[ 8， 14， 16， 17]。有趣的是，与来自健康牙龈组织的GMSCs相比，来自发炎牙龈组织的GMSCs与早期研究相似[ 18- 21]，证实显著快增殖，具有显着更短的群体倍增时间。

在本研究中，FBS被用作化学引诱物，以评估GMSCs的迁移活性通过超微细孔被检查的膜。10000个GMSCs在上部隔室中的播种被认为适合于容易地识别迁移的细胞在所述膜的下部分。在24小时的间隔中的迁移率取决于孔径变化。甲显著差异，在血清驱动的迁移组表现出与对照组相比，在那里GMSCs积极迁移通过膜朝向在下隔室的血清毛孔孔径，重力影响，或流体扩散无关。

从健康GMSCs以及通过0.4迁移炎症组织的起源  μ米和3  μm气孔无显著性差异。然而，在较大8的情况下，细胞迁移有显著差异 μm毛孔，来自健康组织的细胞迁移更为活跃。这一奇特的发现表明， μm孔虽然直径更大，但可能根据炎症状态对GMSCs有选择性迁移作用。此外，观察到的差异可能归因于胶原膜的结构特征，与聚碳酸酯相比，健康的组织来源细胞更容易附着在胶原上，促进其通过聚碳酸酯膜迁移。

扫描电镜分析不能确定从健康组织和炎症组织中获得的GMSCs之间的任何形态差异。GMSCs在扫描电镜下呈成纤维细胞样形态。附着在聚碳酸酯膜上的GMSCs外观较为平坦，伪足较多，附着在胶原包覆PTFE膜上的GMSCs表面较为粗糙，呈胶原链状。所观察到的附着GMSCs的形态差异很大程度上归因于膜粗糙度的变化[ 22- 24]，并且与在衬底上的对附着细胞的形态[效果以前的调查一致 25， 26]。这些调查结果与以往的调查结果进一步一致[ 27，在聚碳酸酯膜和胶原膜上显示出不同的GMSC形态。

 5.结论

牙龈组织的炎症并不影响其中多能间充质干细胞/祖细胞的存在。虽然炎症似乎明显提高扩散是通过人口倍增时间短,关于迁移动力学,数量没有显著差异迁移业务通过不同的膜微孔尺寸在健康和组织发炎,除了有大量微孔大小、业务从健康组织表现出更高的迁徙活动。没有化学引诱剂，就不会发生迁移。目前的研究结果揭示了炎症和GTR膜孔径大小对GMSC不同属性的影响，这对牙周修复/再生至关重要，并为膜驱动牙周组织再生的新概念的形成迈出了第一步。

 数据可用性

支持本研究结果的数据可以在研究结果中找到，如果需要可以从通讯作者处获得更多的细节或照片。

 利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

 作者的贡献

Al Bahrawy M和El-Sayed K对该手稿的编辑贡献相同。

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