高度增殖的永生化人牙髓细胞在与-磷酸三钙支架和BMP2结合时保持牙源性表型

摘要

人体牙髓细胞（HDPC）在牙本质形成和修复牙本发生中起着至关重要的作用，这表明它们在再生医学中的潜在应用。然而，只能从稀缺的人纸浆组织获得的HDPC也具有有限的寿命在体外而干细胞在经过大量传代后，通常会失去其原有的特性。为了克服这些挑战，我们使用piggyBac系统成功地使人类牙髓细胞不朽，该系统有效地过表达SV40 T-Ag，然后我们全面描述了细胞的生物学行为。永生化人牙髓细胞(iHDPCs)获得了长期增殖活性并表达了大多数HDPC标记物。iHDPCs维持多种分化潜能，可诱导分化为成软骨细胞、成骨细胞和成脂细胞在体外．我们还证明了iHDPCs获得了比原代细胞更强的迁移能力，而凋亡被抑制。此外，高度增殖的iHDPCs在皮下植入裸鼠时没有显示出致癌性。最后，当与-磷酸三钙支架和骨形态发生蛋白-2 (BMP2)结合时，iHDPCs表现出牙源性分化能力和分泌的牙本质涎磷蛋白(DSPP)。在活的有机体内总之，已建立的IHDPC对于牙髓细胞分化和牙髓损伤修复的机理研究以及在牙齿再生中的应用是一个有价值的资源。

1.介绍

牙齿的干细胞具有广泛应用的前景，可在再生医学中施用广泛应用。包含未分化的牙髓干细胞，成纤维细胞，树突细胞和血流细胞的细胞混合物的人牙髓细胞（HDPC）赋予了多种分化势。在多牙齿相关的干细胞中，HDPC对牙本质形成和再生具有很大的潜力[1.］.以往的研究使用多种支架进行牙齿和骨骼再生[1.–5.］.当HDPC与生物支架重新组合并植入根管中时，它们可以产生牙本质纸浆样组织在活的有机体内[1.,2.]事实上，在不添加生长因子的情况下，bECM水凝胶将诱导HDPC的成骨分化[4.］.同时，由于hdpc可以很容易地从废弃的牙齿中分离出来，因此它被认为是牙齿以外许多再生医学领域的理想细胞来源。然而，hdpc的寿命是有限的在体外干细胞通常在多次传代后失去其原始特征[1.］.因此，有必要寻求有效的方法从有限的髓组织中获取足够的HDPCs，并充分扩大细胞以提供足够数量的细胞在体外以满足这些迫切的需要。

由于技术的发展，已经采用了在不失其茎的情况下进行各种细胞而不失去茎的化细胞。虽然已经进行了一些尝试以获得人类牙髓细胞和培养物在体外， 很少在活的有机体内人类牙髓细胞不朽的应用已有报道，但对其生物学行为缺乏全面的描述[6.–8.］.通过癌基因过表达和肿瘤抑制基因抑制可以实现细胞的永生化[9］.SV40 T-Ag已被公认为永生使用最广泛的基因[10–12］.遗憾的是，由于转导长基因片段的逆转录病毒的低病毒滴度，当使用逆转录病毒载体过表达SV40 T-AG时，原代细胞具有低的永生化效率[11,13–17］.因此，细胞永生的主要挑战是寻找一种简单、有效、方便的方法将永生基因转移到细胞中[18］.

Piggybac（PB）系统由衍生自卷心菜蛹蛾的突变体杆状病毒菌株组成Trichoplusia Ni.[19］.PB转位被认为是最流行的非病毒基因传递工具，具有与宿主因子无关的特性[20.］.SV40 T-Ag基因位于两个flippase识别靶点(FRT)位点之间，由载体pMPH86传递，有助于各种人类和小鼠细胞的永生化[16］.

本研究的目的是利用基于pb2的基因传递系统，高效、安全地使人牙髓细胞不朽。此外，本研究还对永生化人牙髓细胞(iHDPCs)的特性进行了实验研究，并探讨了其在牙齿再生中的应用可行性。在本研究中，我们阐明了iHDPCs的生物学行为变化，提示其在牙髓再生方面具有一些优越的特性。同时，细胞与-磷酸三钙(β-TCP)的皮下移植，以测试iHDPCs的牙源性可行性在活的有机体内．我们的结果表明，具有卓越的生物学性能的IHDPC可能是探索牙髓细胞分化和牙髓损伤修复机制的宝贵资源，以及在未来对纸浆再生的研究中的应用。

2.材料和方法

2.1。伦理声明

根据批准的指南，从华西口腔医院的患者身上采集人牙髓组织。该研究获得了四川大学华西口腔学院伦理委员会和口腔疾病国家重点实验室的批准。

2.2。建立可逆永久化的HDPC

采集18-22岁的供体牙髓，在添加10%胎牛血清和100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的Dulbecco 's modified Eagle 's medium (HyClone, Logan, UT, USA)中分离培养人原代牙髓细胞[21］.为了建立iHDPCs，我们用PB载体pMPH86和表达腺病毒载体AdpBase的PB转座酶转染人牙髓细胞(第3代)。然后，加入湿霉素B (4 mg/mL, Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 3 d，选择稳定不朽的HDPCs。为了建立去不朽的人牙髓细胞(deimtalized human dental pulp cells, dHDPCs)，用Ad-FLP感染iHDPCs, Ad-FLP能有效识别FLP位点并去除SV40 T-Ag。倒置显微镜下观察细胞形态和生长特征。提取总RNA，实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和琼脂糖凝胶电泳检测SV40 T-Ag基因表达水平。

2．3.表面抗原表达测定

IHDPCs在60mm培养皿中培养，直到融合70%。免疫荧光法检测细胞表面抗原。一抗CD90, CD105, CD34, CD45(均为1:100,Abcam, Cambridge, MA, USA)和CD73 (1:100, BioLegend, San Diego, CA, USA)，一种山羊抗小鼠lgG二抗荧光标记Alexa Fluor 555 (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，或使用Alexa Fluor 488 (1:10 00, Invitrogen)标记的山羊抗兔lgG二抗荧光。如前所述进行HDPCs和iHDPCs的流式细胞术[22］.

２.４.细胞计数试剂盒8 (CCK8)增殖试验

每孔3000个细胞被播种到96孔板上。细胞连续观察5天，测定细胞活力μ.L CCK8解决方案（Dojindo Laboratories，Kumamoto，日本）被加入培养基中，然后孵育1.5小时。用微孔板读卡器（Biotek，Winooski，VT，USA）测量450nm处的培养基的吸光度。

2．5．集落形成实验

HDPC，IHDPC，DHDPC和IHDPC被播种为每孔三百个细胞的密度为6孔板。在生长培养基中培养3周后，将细胞固定在4％多聚甲醛15分钟。然后，使用明亮场显微镜进行并记录晶体紫染色（Beyotime生物技术研究所，江苏，江苏，中国）。

2.6。结晶紫测定

将Ad-GFP感染的亚融合HDPCs、iHDPCs、dHDPCs和iHDPCs接种于6孔板中。在指定的时间点，所有细胞固定并进行结晶紫染色。染色细胞在10%醋酸中搅拌溶解20 min后，在570 nm处测定吸光度值，定量测定。

2.7。流动细胞术分析

在分析细胞周期分布之前，细胞在70%的冰冷乙醇中固定2小时。PBS洗涤后，细胞用RNase (KeyGen Biotech Co.， Nanjing, China)在37°C孵育30分钟，然后用碘化丙啶(PI) (KeyGen Biotech)在4°C孵育30分钟。结果在Guava easyCyte HT流式细胞仪(Merck-Millipore, Darmstadt, Germany)上检测，并使用InCyte 2.7软件(Millipore)进行分析。为了分析细胞凋亡，根据制造商的说明，用Annexin V和7-AAD(均来自KeyGen Biotech)对细胞进行染色。使用FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)分析凋亡组分。在我们的研究中，我们认为早期凋亡的细胞(Q4: Annexin V+/7-AAD染色)和晚期凋亡的细胞(Q2: Annexin V+/7-AAD+染色)正在经历凋亡，并分析这些凋亡细胞占总细胞的比例。

2.8.划痕伤口愈合试验

细胞培养在60毫米的培养皿中，密度为 每孔细胞数，直至90%汇合。A 10 用mL塑料移液管在培养皿直径上造成伤口。用培养基清洗以去除碎屑后，在显微镜下观察细胞迁移情况 h间隔。

2.9。在体外Multidifferentiation iHDPCs的

以12个孔板以密度培养细胞 为了诱导脂肪细胞分化，用基底细胞代替培养基α-修改Eagle的培养基加100 nM地塞米松，50μ.g/mL 3-磷酸抗坏血酸μ.g/mL吲哚美辛(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2周。分化后的细胞用4%聚甲醛固定15分钟，然后用0.3% Oil Red O (Sigma-Aldrich)溶液染色以评估脂肪生成。为了诱导软骨分化，细胞在含有重组转化生长因子-3蛋白(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)的软骨分化培养基(Lonza, Basel, Switzerland)中孵育2周。诱导的细胞用4%聚甲醛固定15分钟，然后用1%阿利新蓝(sigma - Alcian blue)染色。为了诱导成骨分化，细胞在10 nM地塞米松、50 mg/mL抗坏血酸2-磷酸和10 mM的存在下孵育β- 甘油磷酸盐（来自Sigma-Aldrich）5天。然后，将分化的细胞用4％聚甲醛固定15分钟，然后碱性磷酸酶染色（Beyotime）根据制造商的说明评估矿物沉积。

2.10。定量实时聚合酶链反应（QRT-PCR）

为了检测HDPCs、iHDPCs和dHDPCs的多能分化，根据制造商的协议，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)从细胞中提取总RNA。采用PrimeScript RT Reagent Kit (Takara)对分离得到的RNA进行逆转录。SYBR Premix Ex Taq (Takara) PCR反应以互补DNA为模板。以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内对照。

2.11。裸鼠皮下肿瘤形成

七周龄裸鼠( )皮下接种0.20%的细胞 肩胛骨水平每只小鼠1毫升PBS。SCC-4是一种已建立的人类来源的头颈部鳞状细胞癌细胞系，用作阳性对照。在阳性对照组出现明显肿瘤形成时，观察裸鼠长达3周。成像后，收集注射部位附近的组织苏木精-伊红（H&E）（Solarbio，北京，中国）染色检查。

2.12。IHDPCs皮下移植

这个β-TCP块购自四川大学生物材料制造中心。细胞预先被Ad-BMP2感染。的复合材料βtcp块和单元按前面描述的方式准备[23]，植入6周龄BALB/c免疫缺陷裸鼠左右皮下背袋( )．植入1个月后，收集复合材料，用4%福尔马林固定，然后用10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙1周。

2.13。H&E染色和Masson三色染色

组织被石蜡包埋。按照制造商的协议，对嵌入标本的连续切片进行H&E和Masson三色染色(均来自Solarbio)。

图像是通过尼康Eclipse 300荧光显微镜（Compix Media Inc.，Irvine，Ca，USA）获得的图像。

2.14。免疫荧光染色

石蜡切片与一抗抗牙釉质唾液磷蛋白(DSPP) (1:20;圣克鲁斯，加州，美国)在4°C。然后在室温下用Alexa Fluor 555 (1:10 00, Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)进行二抗荧光标记60分钟。细胞核用二氨基苯基吲哚(DAPI;英杰公司)。使用尼康Eclipse 300荧光显微镜(Compix Media Inc.)获得图像。

2.15。统计分析

实验数据如下 ．通过单因素方差检验确定显著性。每种检测条件在所有定量检测中重复三次。的值 被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.PiggyBac转座子系统可以有效地使HDPCs永生

HDPCs被piggyBac载体pMPH86转导(图)1（a））和Adpbase并在补充有正常血清的DMEM中孵育3天;然后，在接下来的3天内加入潮霉素B.在第8天，将阳性细胞转移至DMEM以进行进一步膨胀并在此培养基中维持。方案的示意图如图所示1（b）．在潮霉素选择后，生存的永生化人牙髓细胞保持高增殖率，并且在210天内连续传代70多代，远远超出Hayflick限制，而不发生其成纤维细胞样形态（图1（c）).感染pMPH86的细胞表现出SV40 T-Ag的更高整合率（图1（d）和1 (e))．

3．2.IHDPCs的扩容容量大于HDPCs

CCK8细胞增殖实验显示iHDPCs比HDPCs具有更强的增殖能力，特别是在前4天内(图)2（a））也由菌落形成测定表示（图2 (b))和结晶紫染色法(图2 (c))定量评估支持染色结果，证实IHDPC在第2天的细胞增殖活性明显高于HDPC（图2 (d))．

3．3.IHDPCs的生物学行为变化

通过流式细胞术收集来自通道10到通道70的IHDPC，用于细胞周期分析。我们在IHDPC中观察到更高的G2-M相级分，IHDPC的细胞周期分布不受传递影响（图3(一个)和3 (b))．同时，iHDPCs中凋亡细胞的比例明显低于HDPCs，且不受传代的影响(图)3 (c)和3 (d))此外，与HDPC相比，IHDPC具有更高的迁移能力，这通过伤口愈合试验进行了量化（图3（e）和3（f）)．使用裸鼠瘤状测定法试验IHDPCs的致癌性，服用人头和颈部鳞状细胞癌细胞系SCC-4作为阳性对照。与SCC-4组相比，IHDPC组中没有异常的动力学或肿瘤细胞形成（图3（g）)．因此，我们得出结论，iHDPCs不具有致瘤特性。我们的数据表明，iHDPCs的生物学行为变化可能有助于其在牙髓组织工程中的应用。

3.4。IHDPCS表达了大多数骨髓基质细胞标志物

据报道，一致的人类牙髓干细胞标记物包括CD37、CD90和CD105。阴性细胞表面标记物包括CD34和CD45。免疫荧光染色结果显示，iHDPCs表达CD37、CD90、CD105抗原，但不表达CD34、CD45抗原，表明它们与人牙髓原代细胞相同(图)4(一)–4（c）)．

3.5。IHDPC能够区分脂肪发生，软骨，骨质原和骨膜谱系

IHDPCs油红O染色、阿利新蓝染色、碱性磷酸酶(ALP)染色阳性(图)4（d）)．IHDPCs表现出高氧酶体增殖物激活的受体γ的表达更高表达（PPARγ.)、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPα)和脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)(参与成脂分化的基因)(图4（e））与对照组比对照组相比，表现出更高的胶原2A1，胶原蛋白10A1和患有软弱化分化的基因的蛋白（涉及的基因）（图4（e）)．在成骨/牙核培养基中培养5天后，与HDPC相比，IHDPC表现出较弱的成骨分化（图4（d）)．IHDPCs在成骨/牙源性培养基中培养5天或14天后，表现出ALP、runt相关转录因子2 (RUNX2)、胶原-1 (COL1)、DSPP和牙本质基质蛋白-1 (DMP1)的表达(图)4（e）)．

综上所述，iHDPCs与HDPC一样具有多潜能。然而，结果表明，iHDPCs与HDPC相比不易分化。我们怀疑这可能是由于iHDPCs的高增殖能力所致。

3.6。去除由FLP重组酶介导的SV40 T抗原有助于IHDPC的恢复效果

IHDPC有效地感染了Ad-GFP或Ad-FLP（图5（a）)．与AD-GFP组相比，从AD-FLP感染的IHDPC中有效地除去SV40 T抗原（图5（b）和5（c）).通过集落形成试验、CCK8细胞增殖试验和结晶紫染色评估，DHDPC的增殖活性降低（图5 (d)–5 (g))．流式细胞分析显示，dHDPCs的细胞周期分布与HDPCs相似，而iHDPCs不同(图)5 (h)和5(我))．同时，流式细胞术细胞凋亡分析显示，dHDPCs保持较低的凋亡率(图)5 (j)和5 (k))．与iHDPCs一样，裸鼠肿瘤移植实验显示，与SSC4细胞相比，dHDPCs具有令人满意的特性，没有发生肿瘤(图)5（l）)总之，这些结果表明，通过逆转IHDPC的永生化，可以成功建立保留优良特性的DHDPC。

3.7.当与β-磷酸三钙支架和生长因子BMP2结合时，IHDPC可分化为成牙本质细胞

如前所述，iHDPCs的ALP活性比HDPC的活性降低在体外（图4（d）)为了获得更好的成骨或牙源性分化，将生长因子BMP2添加到IHDPC或DHDPC中。在牙源性培养基中培养5天后，通过ALP染色检测细胞的牙源性分化（图6(一))．最后，BMP2有效地挽救了永生受损的iHDPCs和dHDPCs的分化和矿化在体外（图6(一))．评价iHDPCs和dHDPCs应用于牙髓再生的可行性在活的有机体内这个β-TCP /细胞复合材料被皮下移植到BALB / C裸鼠中（图6 (b))．4周后，我们发现细胞能够在支架中生长良好(图)6 (c)（与GFP组相比，在BMP2组中观察到更成熟的矿化结节（深蓝色）（图6 (d))．此外，ad - bmp2感染组牙本质细胞特异性标记物DSPP表达增加(图)6 (e))．这些结果一致表明，ihdpc可以分化成成牙本质细胞，特别是在与BMP2联合使用时。

4。讨论

龋齿和牙外伤是导致硬组织损伤和牙髓炎症的高发疾病。许多成体干细胞来源已被应用于口腔颌面部组织再生，如HDPCs、根尖乳头干细胞(SCAP)、脱落乳牙干细胞(SHED)、冷冻牙周韧带干细胞(PDLSCs)、牙髓干细胞(SCAP)、牙髓干细胞(SCAP)等。人根尖周囊肿间充质干细胞(hPCy-MSCs)和口腔黏膜祖细胞[22,24]，其中hdpc是最常见和最容易从人类拔牙中获得的。HDPCs成功再生牙本质髓样结构在活的有机体内当植入羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)粉时[25］.基于上述特性，HDPCs不仅具有向成牙本质细胞分化并形成修复性牙本质的能力，是牙齿再生的希望细胞，而且由于其修复牙齿外众多组织的能力而受到关注[1.,26,27］.然而，尽管它们在再生中的潜在应用，但是从人体中分离来自人体的成虫细胞将导致道德讨论。同时，难以将足够的细胞与有限的人纸浆组织分离。已经提出了不朽的人类牙髓细胞的建立以克服这个问题。通过原发性细胞的自发随机诱变，癌基因的过表达和肿瘤抑制基因抑制来实现细胞永生化。18］.根据文献，不朽的人类牙髓细胞是在参与永生系统的逆转录病毒载体的帮助下建立的[6.–8.］.在我们的研究中，我们使用了piggyBac转座子介导的系统(图1（a）)稳定表达SV40 T-Ag，该系统已被证明比基于逆转录病毒载体的可逆永生化系统更有效，可有效永生化各种细胞，包括小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠肝细胞、小鼠心肌细胞和小鼠黑色素细胞[11,14,15,17,28,29］.Piggybac转座子介导的系统有许多引人注目的特征[30.］.简而言之，它可以将DNA的外来片段插入人和小鼠细胞的基因组中的DNA的外来片段[28,31[在多个位置有效地整合DNA元素[32］.此外，由于其在活性基因或癌症相关基因附近的常规积分，几乎没有与Piggybac转座子系统相关的突变证据。33]此外，在FLP重组酶的帮助下，通过去除永生化基因SV40 T-Ag，piggyBac转座酶可以可逆地使细胞永生化[18]因此，与其他转座子相比，piggyBac转座子系统在传递基因方面是一种优越的DNA转座子[33］.

参与组织工程的种子细胞应具有增殖和分化的潜力在活的有机体内．在我们的研究中，与之前建立的永生化HDPCs相比，我们对涉及牙齿再生的细胞特征进行了更详细的测试和描述。结果显示，iHDPCs具有优越的增殖、迁移和凋亡能力，且不发生肿瘤(图)2.和3.)并且已被证明表达与原代HDPC相同的干细胞表面标记模式（图4(一)和4（b）)表明它们含有相同数量的干细胞。同时，我们可以通过去除永生基因SV40 T-Ag使细胞可逆永生。这些去死细胞仍然具有高增殖率、低凋亡率和牙源性分化能力等优良特性(图)5.)．这些结果表明，在牙髓和牙本质再生领域，iHDPCs可能是一种替代原始牙髓细胞的方法。

然而，其成骨和牙源性分化能力并不令人满意(图)4（d）)．文献中有大量证据表明细胞增殖与分化呈负相关。细胞在细胞周期中保持较高的增殖率，细胞周期出口与细胞分化密切协调[34,35］.因此，我们估计的牙肠病分化能力可能归因于高细胞增殖能力（图2.)和较大的G2/ m相分数(图3(一个)和3 (b))．BMP2是最常用的bmp之一，可以通过增强转录因子的活性，诱导成牙本质的分化和牙本质的形成，以及DSPP和DMP1的表达[36,37］.因此，我们选择BMP2作为我们研究的生长因子。正如预期的那样，BMP2有效地促进了iHDPCs和dHDPCs的分化和矿化，取得了理想的效果在体外和在活的有机体内．

尽管结果支持iHDPCs在牙髓和牙本质工程中的潜在应用，但如果没有生长因子，它们的成骨和牙源性分化能力并不令人满意。因此，需要进一步的实验来提高细胞性能，以满足更好的组织再生。此外，由于影响组织稳态和再生的因素很多，如炎症条件和生长因子类型等，需要更多的实验来检测组织再生过程中的炎症条件，确定iHDPCs治疗应用的最佳条件[38,39］.

结论

我们证明，已建立的永生化人牙髓细胞是稳定的，可逆的，高增殖的和非茂剂细胞，这对于研究牙髓炎，牙齿的机制以及细胞异常分化，这应该是有价值的。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者声称没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

李晓光在构思、设计、数据采集、分析和解释方面做出了贡献，并起草和严格修改了手稿。王磊对数据采集、分析和解释做出了贡献，并对手稿进行了严格的修订。苏青、叶莉、周晓明参与构思和设计，并对手稿进行了批判性的修改。D. Song和D. Huang在构思、设计、数据分析和解释方面做出了贡献，并起草和严格修订了手稿。所有作者给出了最后的批准，并同意对工作的所有方面负责。

致谢

中国自然科学基金（81771063），中国博士后科学基金会（2019M653441）和四川大学的邮局资助（2018年CUU12023）。PB载体PMPH86和表达腺病毒载体ADPBase，AD-FLP，AD-GFP和AD-BMP2的PB转座酶是芝加哥大学医疗中心的通川博士的礼品。

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