SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/4534128 4534128 研究文章 高度增殖的永生化人牙髓细胞保留牙原性的表现型当磷酸结合Beta-Tricalcium脚手架和BMP2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 6752 - 4878 李 襄汾县归 1 2 王 刘 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 3956 - 0748 苏 秦 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 8417 - 7676 叶 凌 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 9319 - 7302 周 Xuedong 1 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 5241 - 2013 首歌 Dongzhe 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 0779 - 5729 黄 Dingming 1 2 Aloise 安东尼奥·卡洛斯 1 口腔疾病国家重点实验室、国家临床研究中心的口腔疾病 华西口腔医院 四川大学 成都610041 中国 scu.edu.cn 2 牙髓学部门 华西口腔医院 四川大学 成都610041 中国 scu.edu.cn 2020年 15 2 2020年 2020年 06 12 2019年 14 01 2020年 22 01 2020年 15 2 2020年 2020年 版权©2020襄汾县李et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

人牙髓细胞(HDPCs)牙本质形成和修复牙质生成中发挥至关重要的作用,这表明他们的潜能在再生医学中的应用。但是,HDPCs只能获得稀缺的人类髓组织,也有一个有限的寿命 在体外,干细胞通常失去原始特征在大量的通道。为了克服这些挑战,我们使用piggyBac成功永生化人牙髓细胞系统,来有效地过度表现SV40 t ag,然后我们全面描述了细胞生物学行为。永生的人牙髓细胞(iHDPCs)获得长期增殖活性和表达了大多数HDPC标记。iHDPCs保持多分化潜能,可以被诱导分化成chondrogenic,成骨、脂肪形成的细胞 在体外。我们也证明了iHDPCs获得较强的迁移能力比主细胞,而细胞凋亡抑制。此外,高度时显示没有致肿瘤性增殖iHDPCs皮下植入无胸腺的裸体小鼠。最后,iHDPCs展出牙原性的分化能力和分泌牙质sialophosphoprotein (DSPP)当磷酸结合beta-tricalcium脚手架和骨形态形成protein-2 (BMP2) 在活的有机体内。最后,建立iHDPCs是机械的宝贵的资源研究牙髓细胞分化和牙髓损伤修复,以及应用于牙齿再生。

 四川大学 2018年scu12023 中国博士后科学基金会 2019年m653441 中国国家自然科学基金 81771063 1。介绍

干细胞在再生医学在牙齿上有广阔的应用前景。人牙髓细胞(HDPCs),由未分化的细胞混合牙髓干细胞,成纤维细胞,树突状细胞,和macrophagocytes具有多种分化潜能。在众多tooth-related干细胞,HDPCs潜力巨大牙质的形成和再生( 1]。先前的研究已经使用多个支架牙齿和骨骼再生( 1- - - - - - 5]。当HDPCs重组生物支架植入根管治疗,他们可以生成牙质pulp-like组织 在活的有机体内( 1, 2]。事实上,HDPCs将诱导的成骨分化bECM水凝胶没有添加生长因子( 4]。同时,HDPCs被视为理想的细胞来源再生医学的许多领域以外的牙齿因为他们可以很容易地孤立从废弃的牙齿。然而,HDPCs使用寿命有限 在体外和干细胞通常许多段落(后失去原有的特点 1]。因此,有必要寻求有效的方法来收获足够HDPCs供应有限的果肉组织和扩大细胞充分提供足够数量的细胞 在体外为了迎合这些迫切的需求。

不灭的各种细胞不具备干细胞失去已经采用在解决这些问题由于技术方面的进展。虽然有些已经试图获得人类牙髓细胞和文化 在体外,很少有 在活的有机体内永生的人牙髓细胞的应用已报告,还缺乏全面的描述他们的生物学行为( 6- - - - - - 8]。不灭的细胞可以通过抑制致癌基因超表达和肿瘤抑制基因( 9]。SV40 t ag已经被认为是使用最广泛的基因不减( 10- - - - - - 12]。不幸的是,由于逆转录病毒的病毒滴度较低时很长一段基因片段并主细胞永生化细胞较低效率使用逆转录病毒载体时过度表现SV40 t ag ( 11, 13- - - - - - 17]。因此,不朽的细胞的主要挑战是寻找一个简单,高效和方便的方法将使基因进入细胞( 18]。

piggyBac (PB)系统是由突变体杆状病毒株来源于卷心菜尺蠖蛾 Trichoplusia倪( 19]。PB换位,赋予主人factor-independent特征,被认为是最流行的病毒基因传递工具( 20.]。SV40 t ag基因位于两个flippase识别目标(FRT)网站和交付的向量pMPH86导致各种人类和小鼠细胞的不灭 16]。

本研究的目的是为了使人类牙髓细胞高效、安全地使用PB-based基因传递系统。此外,实验进行了测试不灭的人牙髓细胞的特点(iHDPCs)和探索应用这些iHDPCs牙再生的可行性。在这项研究中,我们阐明的生物学行为变化iHDPCs暗示一些优越的牙髓再生的特征。与此同时,细胞结合beta-tricalcium磷酸盐( βtcp)皮下注射移植测试iHDPCs的牙原性的可行性 在活的有机体内。我们的研究结果表明,iHDPCs,优越的生物性能,可能是一种宝贵的资源,探索牙髓细胞分化的机制和牙髓损伤修复,以及应用程序的未来研究纸浆再生。

 2。材料和方法 2.1。道德声明

人类髓组织收集病人在华西口腔医院批准的指导方针。这项研究是中国西部的伦理委员会批准,口腔医学院四川大学,口腔疾病国家重点实验室。

 2.2。建立可逆HDPCs名垂千古

牙髓收集来自捐赠者(年龄在18到22岁的y)和人类分离、培养初级牙髓细胞在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(美国UT HyClone, Logan)补充10%胎牛血清和100 U /毫升青霉素和链霉素100 U /毫升( 21]。建立iHDPCs,早期人类牙髓细胞的通道(3)通过转染PB向量pMPH86和PB转座酶表达AdpBase adenoviral向量。然后,潮霉素B(4毫克/毫升,Gibco /生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)添加了3天选择稳定HDPCs名垂千古。建立deimmortalized人牙髓细胞(dHDPCs) iHDPCs感染了Ad-FLP FLP有效地认识到网站和删除SV40 t ag。细胞形态和生长特性一个倒置显微镜下观察。总RNA提取和实时逆转录聚合酶链反应(存在)和琼脂糖凝胶电泳进行检测SV40 t ag基因表达水平。

 2.3。表面抗原表达分析

IHDPCs融合培养60毫米菜到70%。细胞表面抗原被免疫荧光检测。主要抗体CD90、CD105、CD34、CD45 (Abcam在1:100年,剑桥,妈,美国),和CD73 (BioLegend 1: 100年,圣地亚哥,美国),一只山羊anti-mouse lgG二级抗体荧光标记Alexa萤石555(1:1000年,表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国),或是山羊anti-rabbit lgG二级抗体荧光标记Alexa萤石488(1:1000年,英杰公司)使用。流式细胞术HDPCs和执行iHDPCs如前所述 22]。

 2.4。细胞计数Kit-8 (CCK8)扩散试验

每口井的三千个细胞被播种到96孔板。细胞不断观察5天来决定细胞生存能力,和10 μL CCK8解决方案(Dojindo实验室、熊本、日本)添加到培养基中每日1.5 h孵化紧随其后。媒介在450 nm的吸光度测量的标(美国BioTek Winooski, VT)。

 2.5。集落形成实验

HDPCs、iHDPCs dHDPCs, iHDPCs感染Ad-GFP被播种到6-well板块三百细胞的密度。细胞在4%多聚甲醛固定后15分钟文化生长介质为3周。然后,结晶紫染色(Beyotime生物技术研究所、江苏、中国)使用亮场显微镜进行并记录。

 2.6。结晶紫测定

Subconfluent HDPCs、iHDPCs dHDPCs, iHDPCs感染Ad-GFP被播种到6-well盘子。在指定的时间点,所有的细胞都是固定的,结晶紫染色。染色细胞被定量测定评估在10%醋酸溶解污渍后20分钟搅拌,然后测量吸光度值在570海里。

 2.7。流仪结果

之前的分析细胞周期分布,细胞被固定在冰冷的70%乙醇为2小时。与PBS洗涤后,细胞被孵化与核糖核酸酶(南京凯基生物生物技术有限公司,中国)为30分钟37°C其次是孵化propidium碘(PI)(凯基生物生物技术)30分钟在4°C。结果检查在番石榴easyCyte HT流式细胞分析仪(Merck-Millipore,达姆施塔特,德国)和分析InCyte 2.7软件(微孔)。分析细胞凋亡,细胞染色膜联蛋白V和7-AAD凯基生物生物技术()根据制造商的指示。凋亡分析了分数使用FACScan血细胞计数器(becton dickinson,富兰克林湖,新泽西,美国)。在我们的研究中,早期凋亡细胞(第四季度:膜联蛋白V + / 7-AAD-staining)和晚期凋亡细胞(Q2:膜联蛋白V + / 7-AAD +染色)被认为是发生细胞凋亡,而这些凋亡细胞的数量占总细胞的比例进行了分析。

 2.8。抓伤口愈合试验

细胞培养在60毫米菜肴的密度 1 × 10 6 细胞每口井,直到90%的融合。10毫升塑料吸管被用来创建一个伤口在板的直径。与中移除碎片,洗后在显微镜下观察细胞迁移后24小时间隔。

 2.9。体外<斜体> < /斜体> Multidifferentiation iHDPCs

细胞培养在twelve-well板的密度 1 × 10 5 细胞每口井。诱导脂肪形成的分化,中基所取代 α鹰的修改中+ 100海里地塞米松,50 μ50 g / mL -磷酸抗坏血酸, μg / mL消炎痛(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)2周。分化的细胞被固定为4%聚甲醛与0.3%油红O染色前15分钟(Sigma-Aldrich)解决方案评估脂肪形成。诱导chondrogenic分化,细胞被孵化的chondrogenic分化培养基(Lonza、巴塞尔、瑞士)重组转化生长因子β3蛋白(研发系统,明尼阿波利斯,美国)2周。诱导细胞被固定为4%聚甲醛为15分钟,随后阿尔新蓝染色与1% (Sigma-Aldrich)。诱导成骨分化,细胞被孵化的10 nM地塞米松,50毫克/毫升抗坏血酸2-phosphate, 10毫米 β从Sigma-Aldrich甘油磷酸酯(所有)5天。然后,细胞分化与4%的聚甲醛固定15分钟,其次是碱性磷酸酶染色(Beyotime)来评估根据制造商的指示矿物沉积。

 2.10。定量实时聚合酶链反应(存在)

检测multipotential分化HDPCs、iHDPCs dHDPCs,总RNA提取细胞使用RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的协议。孤立的RNA是使用PrimeScript RT反转录试剂盒(豆类)。互补DNA样本被用作模板SYBR预混料Taq交货(豆类)PCR反应。3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内部控制。

 2.11。在裸小鼠皮下肿瘤形成

已裸小鼠( n = 5 )与细胞接种皮下注射0.20毫升的PBS /鼠标的肩胛骨。SCC-4,起源于人类建立头颈部鳞状细胞癌肿瘤细胞系,是作为阳性对照。裸体小鼠观察3周,当有明显的阳性对照组的肿瘤形成。成像后,注射部位附近的组织收集和检查通过苏木精和伊红())(Solarbio,北京)染色。

 2.12。皮下移植IHDPCs

的 βtcp块从生物材料制造购买的核心,四川大学。细胞被感染Ad-BMP2提前。的复合材料 βtcp块和细胞准备如前所述 23)和植入六周左右皮下背口袋的老BALB / c裸小鼠移植瘤模型免疫缺陷( n = 5 )。植入一个月后,复合材料是收获和4%福尔马林固定,紧随其后的是脱钙作用为10%乙二胺四乙酸(EDTA)一个星期。

 2.13。他走时染色,马森的三色的染色

组织是嵌入在石蜡。嵌入式的串行部分标本染色)和马森的三色的污渍(来自Solarbio)根据制造商的协议。

300年获得的图像是一个尼康的Eclipse荧光显微镜(Compix媒体Inc .)、欧文、钙、美国)。

 2.14。免疫荧光染色

一夜之间,石蜡部分被孵化与主抗体anti-dentin sialophosphoprotein (DSPP) (1: 20;美国圣克鲁斯,CA)在4°C。这一过程伴随着二次抗体荧光标记Alexa萤石555(1:1000年,表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)在室温下为60分钟。细胞核也贴上diamidino-phenylindole (DAPI;英杰公司)。获得的图像使用尼康Eclipse 300荧光显微镜(Compix媒体Inc .)。

 2.15。统计分析

给出了实验数据 意味着 ± SD 。意义是由单向方差分析测试。每个重复试验条件对所有定量化验一式三份。的值 P < 0.05 被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。HDPCs PiggyBac转座子系统可以有效地无限增殖

HDPCs转导piggyBac向量pMPH86(图 1(一))和AdpBase和孵化与正常血清DMEM补充3天;然后,潮霉素B添加在接下来的3天。8天,阳性细胞转移到DMEM进一步扩张和维护这一媒介。协议的示意图如图 1 (b)。潮霉素筛选后,幸存的永生化人牙髓细胞保持高增殖率,并通过连续超过70代210天,远远超出了海弗利克极限呈形态(图没有任何变化 1 (c))。细胞感染pMPH86表现出更高的集成速度SV40 t ag(数字 1 (d)和 1 (e))。

不灭的人牙髓细胞使用piggyBac转座子系统。(一)pMPH86示意图。SV40 t ag基因位于两个flippase识别目标(FRT)网站。(b)实验方法的示意图。(c) IHDPC设施。AdpBase运载体和pMPH86转染主要人牙髓细胞,细胞在媒介选择和潮霉素为3天。存活细胞被观察到第三天,第七天,天13 postselection。的iHDPCs通道连续25通道(p25) (d和e)。不灭后SV40T-Ag mRNA表达的调节。

 3.2。比HDPCs IHDPCs更有扩张能力

CCK8细胞增殖试验建议iHDPCs比HDPCs增殖能力更强,特别是在前4天(图 2(一个))也是集落形成试验(图所示 2 (b))和结晶紫染色法测定(图 2 (c))。定量评估支持染色结果,确认iHDPCs细胞增殖活性明显高于有一天比HDPCs(图2 2 (d))。

IHDPCs获得强大的自我更新和增殖能力。(一)观察细胞增殖的CCK8试验( ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。(b)集落形成试验用结晶紫染色。(c)由结晶紫染色法测定细胞增殖评估。(d)污渍从细胞中提取的定量测定溶解A570 nm ( ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 )。

 3.3。IHDPCs的生物学行为变化

IHDPCs从10通道70收集通过流式细胞仪进行细胞周期分析。我们观察到更高G2-M iHDPCs阶段分数,iHDPCs的细胞周期分布并没有受到使(数字 3(一个)和 3 (b))。iHDPCs之间的同时,凋亡细胞的比例显著低于HDPCs和也不受使(数字 3 (c)和 3 (d))。此外,与HDPCs相比,iHDPCs有优越的迁移能力量化的伤口愈合试验(数字 3 (e)和 3 (f))。的裸鼠致瘤性试验是用来测试iHDPCs致肿瘤性,把人体头颈部鳞状细胞癌细胞系SCC-4积极控制。没有异常的有丝分裂或肿瘤细胞形成iHDPC组相比SCC-4组(图 3 (g))。因此,我们得出结论,iHDPCs没有致瘤的属性。我们的数据表明,iHDPCs的生物学行为变化可能影响他们的应用程序在果肉组织工程。

iHDPCs的生物学行为变化。(一)流仪分析显示的细胞周期分布HDPCs iHDPCs。流式细胞术(b)细胞周期分析显示在iHDPCs G2-M阶段分数增加,细胞周期分布iHDPCs没有受到使( ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。(c)流动仪结果显示细胞凋亡在HDPCs和iHDPCs的水平。(d) iHDPCs中凋亡细胞的比例明显低于HDPCs和不受使( ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。(e和f)的迁移率HDPCs和iHDPCs量化使用伤口愈合试验( ∗ P < 0.05 )。(g)裸鼠致瘤性试验是用来测试iHDPCs致肿瘤性,SCC-4作为阳性对照。

 3.4。IHDPCs表达多数骨髓基质细胞标记

据报道,共识人类牙髓干细胞标记包括CD37, CD90、CD105。消极的细胞表面标记包括CD34、CD45。免疫荧光染色结果表明,iHDPCs表示抗原CD37 CD90、和CD105但没有表达抗原CD34、CD45表明他们相同的基本人类牙髓细胞(数字 4(一)- - - - - - 4 (c))。

Multilineage分化HDPCs iHDPCs。(一)流仪分析抗原表达的HDPCs iHDPCs。(b)阳性细胞百分比。(c)细胞染色的平均荧光强度不同的抗原。(d)去HDPCs和iHDPCs由油红O染色在脂肪形成的媒介文化后14天。Chondrogenic HDPCs分化和iHDPCs由阿尔新蓝染色在Chondrogenic媒介文化后14天。HDPCs成骨/牙原性的分化和iHDPCs由高山染色在成骨的媒介文化后5天。(e)中存在PPAR的分析 γ,C / EBP αEABP4,胶原蛋白2 a1, aggrecan,胶原蛋白10 a1,高山,RUNX2 COL1, DMP1, DSPP表达式( ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。

 3.5。IHDPCs能够分化成脂肪形成的,Chondrogenic和成骨的血统

IHDPCs油红O染色阳性,阿尔新蓝染色,碱性磷酸酶(ALP)染色(图 4 (d))。IHDPCs表现出更高的表达过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγ γ),CCAAT /增强子结合蛋白α(C / EBP α),脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)(基因参与脂肪形成的差异化)(图 4 (e)),表现出较高的胶原蛋白的表达2 a1,胶原蛋白10 a1, aggrecan (chondrogenic分化基因)与对照组相比(图 4 (e))。在成骨的文化后5天/牙原性的媒介,IHDPCs显示较弱的成骨分化与HDPCs相比(图 4 (d))。IHDPCs展出的高山的表达,runt-related转录因子2 (RUNX2) collagen-1 (COL1) DSPP,牙本质基质蛋白1 (DMP1)在成骨的文化/牙原性的介质(图5天或14天 4 (e))。

从这些结果来看,iHDPCs HDPCs等多功能。然而,结果表明,iHDPCs HDPCs相比不太容易区分。我们怀疑这可能是归因于iHDPCs的高增殖能力。

 3.6。FLP切除SV40 T抗原由重组酶有助于IHDPCs的恢复效果

IHDPCs有效感染Ad-GFP或Ad-FLP(图 5(一个))。SV40 T抗原是有效地清除Ad-FLP-infected iHDPCs,相比Ad-GFP集团(数字 5 (b)和 5 (c))。dHDPCs的增殖活动减少,集落形成试验评估,CCK8细胞增殖试验和结晶紫染色(数字 5 (d)- - - - - - 5 (g))。流仪分析表明,细胞周期分布dHDPCs HDPCs相似但iHDPCs(数字 5 (h)和 5(我))。与此同时,流式细胞术分析细胞凋亡揭露dHDPCs保持较低的细胞凋亡率(数据 5 (j)和 5 (k))。与iHDPCs一样,裸鼠肿瘤移植实验表明dHDPCs满意的特点没有肿瘤发生与SSC4细胞(图 5(左))。总的来说,这些结果表明,dHDPCs保持优越的特点可以成功地建立了扭转iHDPCs的不朽。

Deimmortalized人类牙髓细胞。(一)IHDPCs转导效率Ad-FLP建立deimmortalized人牙髓细胞(dHDPCs)。(b)的mRNA表达SV40T-Ag deimmortalization后表达下调( ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。(c)的表达在dHDPCs SV40T-Ag。(d)的可行性dHDPCs集落形成试验测试。(e)细胞增殖CCK8评估的试验( ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。(f)结晶紫染色法测定细胞增殖评估。(g)定量测定染色细胞溶解的A570 nm ( ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 )。(h和i)流仪分析显示HDPCs的周期分布,iHDPCs和dHDPCs ( ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。(j和k)流仪分析显示细胞凋亡HDPCs和iHDPCs ( ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。(左)裸鼠致瘤性试验是用来测试的致肿瘤性dHDPCs相比,SCC-4细胞作为阳性对照。没有产生肿瘤dHDPC组后三个星期。相比之下,有许多不正常有丝分裂图像SCC-4组(箭头)。

 3.7。IHDPCs可以分化为成磷酸结合Beta-Tricalcium脚手架和BMP2的增长因素

正如前面确认的,高山活动iHDPCs比HDPCs下降 在体外(图 4 (d))。为了达到更好的成骨的或牙原性的分化、生长因子BMP2被添加到iHDPCs或dHDPCs。牙原性的分化的细胞被高山化验后染色文化牙原性的介质(图5天 6(一))。最后,BMP2有效获救的分化和矿化iHDPCs和dHDPCs受损不灭 在体外(图 6(一))。评估的可行性应用iHDPCs和dHDPCs纸浆再生 在活的有机体内, βtcp /细胞复合材料是皮下植入BALB / c裸小鼠(图 6 (b))。四个星期后,我们发现,细胞可以生长在支架(图 6 (c)),更成熟的矿化结节(深蓝色)观察BMP2组相比,绿色荧光蛋白组(图 6 (d))。此外,Ad-BMP2-infected组显示增加DSPP odontoblast-specific标志(图的表达式 6 (e))。一致,这些结果表明iHDPCs可以分化成成特别是与BMP2组合应用程序中使用。

IHDPCs可以分化成成磷酸结合beta-tricalcium支架和生长因子 在活的有机体内。(一)BMP2 iHDPCs和dHDPCs促进分化和矿化 在体外。高山iHDPCs染色和dHDPCs牙原性的媒介文化后5天。(b)复合材料的支架和细胞植入背很仔细的裸小鼠皮下地区4周。(c))复合材料的染色 βtcp支架和iHDPCs / dHDPCs对待BMP2皮下植入后4周。马森(d)的复合材料的三色的染色。(e)的DSPP的水平 βtcp脚手架iHDPC / dHDPC复合材料进行了分析,采用免疫染色。

 4所示。讨论

龋齿和牙科创伤高发疾病导致硬组织损伤和纸浆炎症。许多成年干细胞来源,被应用于口腔颌面部组织再生,如HDPCs干细胞来源于根顶端乳头(SCAP),从人类脱落乳牙干细胞(棚),干细胞冻存牙周韧带(PDLSCs),人类间充质干细胞(hPCy-MSCs)、根尖周的囊肿和口腔粘膜祖细胞( 22, 24其中HDPCs是最常见和容易获得提取人的牙齿。HDPCs成功再生牙质pulp-like结构 在活的有机体内当移植与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA / TCP)粉( 25]。基于上述性质,HDPCs不仅承诺为牙齿再生细胞由于分化成成的能力和创造修缮的牙质也已引起关注,因为他们修复众多组织的能力之外的牙齿( 1, 26, 27]。然而,隔离的成体干细胞人体将导致道德讨论尽管再生的潜在应用。与此同时,很难分离出足够的牙髓组织细胞从有限的人类。建立永生化人牙髓细胞提出了克服这一问题。细胞永生化细胞已经意识到通过自发的随机诱变的主要细胞,抑制癌基因的过度表达,和肿瘤抑制基因( 18]。根据文献,建立了永生化人牙髓细胞的帮助下参与不朽的逆转录病毒载体系统( 6- - - - - - 8]。在我们的研究中,我们利用piggyBac transposon-mediated系统(图 1(一))稳定表达SV40 t ag比逆转录病毒已被证明是更有效的基于矢量的可逆不灭系统相关的各种细胞的高效的不朽包括小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠肝细胞,鼠标和鼠标cardiomyogenic细胞,黑色素细胞( 11, 14, 15, 17, 28, 29日]。有很多突出的特征piggyBac transposon-mediated系统[ 30.]。简单地说,它可以插入外源DNA片段的100 kb为人类和小鼠的基因组细胞( 28, 31日)在多个位置和有效整合DNA元素( 32]。此外,几乎没有证据表明突变与piggyBac转座子系统由于其罕见的集成附近活跃的基因或癌症相关基因( 33]。此外,piggyBac转座酶可以可逆地永生化细胞通过删除不灭FLP基因的帮助下SV40 t ag重组酶( 18]。因此,piggyBac转座子系统是一个优越的DNA转座子提供基因与其他转座子( 33]。

参与组织工程的种子细胞应具备繁殖和分化潜能 在活的有机体内。在我们的研究中,我们进行更详细的测试和描述牙齿再生的细胞特性与先前建立永生化HDPCs。结果显示,iHDPCs具有优越的扩散能力,迁移,细胞凋亡没有肿瘤发生(数字 2和 3)和已被证明来表达相同的干细胞表面标记模式作为主要HDPCs(数字 4(一)和 4 (b))表明它们包含相同数量的干细胞。与此同时,我们能够可逆地永生化细胞通过删除不灭SV40 t ag基因。deimmortalized细胞仍保留了优越的特性包括一个高增殖率、低细胞凋亡,牙原性的分化能力(图 5)。这些结果表明iHDPCs可能是另一个主要领域的牙髓细胞浆和牙质再生。

然而,他们的成骨的牙原性的分化能力并不是令人满意的(图 4 (d))。在文献中有大量证据表明,细胞增殖和分化是负相关。细胞保持高增殖率时细胞周期,并退出细胞周期与细胞分化[紧密协调 34, 35]。因此,我们估计受损牙原性的分化能力可能归因于高细胞增殖能力(图 2)和大型G2 / m期分数(数据 3(一个)和 3 (b))。BMP2是一种最常用的每个位置,可以诱导成牙质细胞分化和牙本质的形成和表达DSPP和DMP1增强转录因子的活动( 36, 37]。因此,我们选择使用BMP2生长因子在我们的研究中。正如预期的那样,取得了理想的效果,BMP2有效地促进了分化和矿化iHDPCs dHDPCs 在体外和 在活的有机体内。

尽管结果支持的潜在使用iHDPCs纸浆和牙质工程,其成骨和牙原性的分化能力是没有生长因子不令人满意。所以,未来实验需要提高电池性能迎合上级组织再生。此外,由于多种因素影响组织内稳态和再生,如炎症条件和类型的生长因子,还需要更多的实验来检测炎症条件在组织再生和确定最优条件的治疗应用iHDPCs [ 38, 39]。

 5。结论

我们证明了建立永生化人牙髓细胞是稳定的,可逆的,高度增殖和nontumorigenic细胞,为研究牙髓炎的机制应该是有价值的,修复牙本质的形成,和牙原性的分化的细胞。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

 作者的贡献

李x导致概念、设计、数据采集、分析、解释和起草和修订后的手稿。l .王造成数据采集、分析和解释和修订后的手稿。问:苏、l .你们和x周参与概念和设计和修订后的手稿。d .歌曲和d .黄了概念、设计、数据分析、解释并起草和修订后的手稿。所有作者给了最终批准和同意负责所有方面的工作。

 确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81771063)、中国博士后科学基金会(2019 m653441),和四川大学的博士后资助(2018 scu12023)。PB向量pMPH86和PB转座酶表达AdpBase运载体,Ad-FLP, Ad-GFP, Ad-BMP2 Tong-Chuan博士的礼物他来自芝加哥大学的医学中心。

 中岛美嘉 M。 Akamine 一个。 应用组织工程再生纸浆和牙本质牙髓学 牙髓学杂志》 2005年 31日 10 711年 718年 10.1097/01. don.0000164138.49923.e5 2 - s2.0 - 26844537679 16186748 Tatullo M。 马瑞利 M。 Shakesheff k . M。 白色的 l . 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