新型立体定向套管的评价对中枢神经系统疾病的干细胞移植

摘要

细胞治疗中枢神经系统疾病已开始证明其安全性和有效性。实质内移植可作为细胞传递的一种选择;然而，关于这种方法的一个担忧是移植套管可能会造成额外的脑损伤。这包括导致脑出血的血管损伤，以及因脑碎片和/或细胞簇堵塞套管，需要更换套管或强制注射导致细胞悬浮液喷射。我们比较了用于临床试验的细胞输送套管(匹兹堡套管和瑞穗套管)和新设计的MK01套管，以评估其可用性。MK01为球形尖端，在套管一侧有一个扇形开口，防止血管损伤、脑碎片堵塞和射流现象。我们比较了大鼠颈动脉和腹腔动脉损伤的程度、套管内的碎屑量、造成射流所需的力量和细胞存活率。虽然在套管中细胞存活率几乎相同(约95%)，但匹兹堡套管造成了颈动脉损伤和随后的出血，因为它需要更小的力量穿透动脉壁。此外，匹兹堡套管在脑部穿刺后，针尖出现高频率脑碎片(约80%)，而瑞穗套管和MK01套管没有出现。在匹兹堡和瑞穗套管中，即使使用较小的力，也可以观察到注射液的射流，MK01持续出现低射流。 Thus, MK01 seems to be safer than the previously reported cannulas, although further investigation is necessary to validate its safety for clinical use.

1.简介

干细胞为中枢神经系统（CNS）疾病的移植在实验室已经显示出有希望的结果[1- - - - - -3.]，和几个临床试验已经开始证明其安全性和有效性[4- - - - - -7]。虽然理想的移植途径尚未确定，但与血管内移植相比，实质内移植可将足够数量的细胞输送到受损脑内，因此细胞输送仍是一种选择[6,8,9]。迄今为止，还没有管道已批准监管机构，包括美国食品药品管理局，以及不同类型的特殊设计或采用其他用途插管细胞移植被用于临床试验[6,10]。然而，直接移植的一个主要问题是移植套管对脑损伤的潜在风险。据报道，在整个手术过程中，电极插入引起脑出血的风险约为2-5% [11]，和干细胞移植推测具有这种并发症的相似或更高风险，因为套管插入到脑区域与预先存在的损伤[6,12]。另一个担心是脑碎片和细胞悬浮液可能会导致套管堵塞，因为大多数类型的干细胞具有粘附性，细胞在分娩到手术室后会保持稳定的位置一段时间。当细胞阻塞在套管内时，外科医生需要更换套管，从而对大脑造成额外的损伤，或加大注射器力度以打破细胞簇，导致细胞死亡和/或细胞悬浮液喷射，也会造成额外的脑损伤。为了克服这些问题，我们研制了一种新型的移植套管，其尖端为球形，侧面为扇形开口。在这份报告中，我们评估了这种新型套管的设计和性能，并与临床试验中使用的套管进行了比较。

2.材料和方法

2.1。实验伦理

动物实验协议都是动物实验伦理委员会批准的北海道大学研究生院医学(参考号17 - 0066),和所有动物过程中使用本研究按照制度进行动物实验的指导方针,适当的指导方针进行动物实验的科学理事会的日本,和到达(在体内实验动物研究:报告)的指导方针。所有人体实验，包括干细胞和血小板采集，均按照赫尔辛基宣言的指导原则进行，该研究得到了机构审查委员会的批准(参考编号012-0334)。所有参与者都提供了书面知情同意书参加本研究。

2.2。细胞传递插管

匹兹堡h cell implantation cannula and stylet (SB2023, Synergetics, O’Fallon, USA), Mizuho Biopsy/Injection needle (MES-CG07-200-01, Mizuho, Tokyo, Japan), and our newly designed cannula, MK01, were examined in this experiment. The Pittsburg and Mizuho cannulas have been used in clinical trials for injecting stem cells into the brain [6,10,13]。表中列出了套管的基本参数1。简单地说，匹兹堡套管的内孔直径为250 μm，细胞射出口位于套管的末端，其尖端外径略有收窄。瑞穗针的内孔为300μm, and the cell ejection orifice is located on the side of the needle, 7 mm from the distal end. MK01 was modified from the Mizuho cannula and has the following characteristics (Figure1): it is made of 100% stainless steel, the outer diameter of the cannula is 1.5 mm, and the internal bore diameter is 300 μm，它可以直接连接到Leksell立体定向电弧系统(Model G, Elekta，瑞典)。套管内容积为23.9μ，且仪器长度为19厘米，无弹性。MK01的一个特点是它的弹射孔位于套管的一侧而不是套管的顶端。此外，即使在高压下，引射孔也被设计成扇形展开以避免射流。套管头为球形，避免穿刺插入时损伤血管。开孔的远端是弯曲的刚好接近赤道线的球形尖端，以便开孔不出现在插入轨迹视图。套管可以用传统的蒸汽技术消毒。

2.3。实验动物

8周大雄性Sprague-Dawley大鼠(CLEA Japan, Inc.， Tokyo, Japan)体重260-300 g，用于实验。动物被饲养在受控环境中(温度25℃，湿度50%，昼夜循环12小时)，并允许自由获取食物和水。用初始浓度为4.0%的70% N异氟醚麻醉大鼠₂O和30％氧气₂气，和麻醉维持在2.0％的浓度，通过一个面膜，如先前报道[2]。实验动物的直肠温度下保持36.5并在整个使用自动热垫的程序37.5℃之间。如前所述，使用5.0％异氟烷颈椎脱位以人道的方式提及动物通过深麻醉安乐死。

2.4。细胞培养

人类骨髓干细胞（BMSC）和血小板裂解物（PL）从三个健康供体收获，如先前报道[10]。简单地说，在Ficoll-Hypaque®(Pharmacia, Uppsala, Sweden)通过密度梯度离心分离骨髓单核细胞，并将细胞接种于175 cm的区域²无涂层烧瓶(EasYFlask 159910;(Nunc)密度约为 细胞/平方厘米²在25毫升α-从健康志愿者中提取的含有10% PL的最低必需培养基和40μg/mL硫酸庆大霉素。24小时后，通过改变培养基去除非贴壁细胞。每周更换两次培养基。BMSCs在随后的手术中通过了2 - 3次。使用TrypLe Select®(一种重组胰蛋白酶替代品，Gibco)收集瓶中的BMSCs并离心。将上清液倒出，细胞在ARTCEREB®(脑脊术用的灌洗灌注液;大冢制药厂股份有限公司，火影忍者，日本)到一个集中地 细胞/毫升。使用自动细胞大小计算器(iSpect DIA-10, Shimadzu Co.， Kyoto, Japan)测量细胞的大小。

2.5。细胞活力分析

使用LUNA自动细胞计数器(韩国Logos Biosystems公司)，根据制造商的说明，检查通过套管之前和之后的细胞存活率。采用四种不同的方法，计算细胞注射前后细胞存活率的相对比。

2.6。血管穿刺实验

麻醉诱导后，双侧颈总动脉（CCA）通过颈部的腹侧正中切口暴露。的橡胶片放置在CCA下使它们稳定。插管尖端通过施加轻微的压力以查看是否插管能渗透动脉放置在动脉的顶部。如果动脉受损，约10分钟动脉温柔启用压缩停止动脉出血的。在不同的位置的动脉每个套管进行了十次的程序。After the procedure, rats were euthanized, and the abdominal aorta was harvested (approximately 7-10 mm length can be harvested). The arterial tube was opened and placed on the plastic sheet to cover a 3 mm hole in the plastic. The artery was stabilized on the plastic sheet by pins, which were hexagonally nailed at 1 mm from the plastic edge. Cannulas were attached using a digital force gauge monitor (ZTA-50N, IMADA, Toyohashi, Japan), and the power to penetrate the arterial wall was measured. Six different procedures were performed for each cannula ( 每个实验，每只动物穿刺两次)。

2.7。脑、肝穿刺实验

麻醉诱导后，动物被固定在立体定向装置上。如先前报道的，使用小型牙钻在bregma左右各3毫米处钻一个直径2毫米的钻孔。1]。The cannulas were slowly inserted into the brain parenchyma until the tip reached the skull base (approximately 10 mm from the surface of the dura matter). After withdrawing the cannula from the brain, the cannula was flushed with saline to assess the presence of brain debris present in the cannula. Three independent experiments consisting of 10 punctures were performed for each cannula ( 每个实验，每只动物穿刺10次)。在脑部实验后，腹部被一个线性皮肤切口暴露出来。然后，插管被缓慢地插入离肝表面5毫米的地方，并再次冲洗插管以检查上面提到的碎片的存在。

2.8。喷流试验

The cannulas were attached using an automated injection pump, and saline with 2% trypan blue was continuously injected at various injection speeds ranging from 0 to 11 mL/min. The cannula opening orifice was placed horizontally 10 cm above the floor, and the distance reached by saline was compared among 10 experiments for each cannula. Then, the cannula holes were vertically placed and attached using an 1 mL syringe containing saline with 2% trypan blue. The syringe, attached by a digital force gauge, was pushed to assess the force needed to cause a liquid fountain. Then, a phantom brain gel was prepared by 33% borax, as previously described with modifications [14]。将套管置于凝胶中，距表面3cm，以不同速度注射2%台盼蓝30秒。注射的生理盐水的形状被拍照以检查射流的存在。

2.9。统计

所有数据都表示无论是作为 或中值（四分位数间距（IQR））。所有统计分析使用JMP 12版（SAS公司，卡里，NC，USA）进行。连续数据进行方差随后的Tukey HSD测试的单因素分析比较。根据初步实验，选取的样本大小。简言之，在一个单向ANOVA的研究中，从3个基团，其方式是要进行比较得到2样本大小。的6名或10个受试者的总样品达到100％的功率，以检测手段与使用相等的装置的替代性之间的差异测试用0.0500显着性水平。在装置的变化的大小是可以通过标准偏差是0.83表示。一组内的共同的标准偏差假设为1.00。我们使用PASS 14.0.9（PASS软件由国家福利理事会，LLC）来计算统计力量。< 0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1。不同套管的细胞存活率无差异

新鲜制备的人骨髓基质干细胞是通过插管通过。Median cell size was 30 mm, (IQR 20-70 mm). Cell viability with the Pittsburg, Mizuho, and MK01 cannulas was , ,和 ,分别。然而，在使用瑞穗插管的四次尝试中，有一次发生了细胞簇堵塞。

3.2。与匹兹堡插管动脉血管损伤高周波

每根套管轻压动脉时，只有匹兹堡套管穿透动脉，造成大出血(图)图2（a）和图2（b）)。不过，瑞穗和MK01cannulas没有引起动脉血管破裂。穿透腹壁动脉壁与匹兹堡套管显著降低所需要的力（ )比用瑞穗（ )和MK01 ( )套管(图图2（c）)。

3.3。大脑碎片被发现在匹兹堡套管

脑碎片经常只在匹兹堡插管发现（ ),虽然有在瑞穗和MK01插管无杂物（图图3（a）和3 (b))。所有针头均未发现肝碎片。

3.4。MK01的射流能力最低

When the needle holes were horizontally placed and injected with colored saline, all showed dripping of the liquid at a rate between 0 and 3 mL/min; however, the Pittsburg cannula started to show horizontal jet flow at 4 mL/min, with the flow distance continuing to expand as the injection speed increased. The Mizuho needle also started to show jet flow from 5 mL/min, with the distance also expanding at higher speeds. However, MK01 did not show jet flow for speeds up to 11 mL/min (Figures4(一)和4 (b))。然后，我们用一个数字测力监视器，通过推动指针来检查造成喷射喷泉所需的力。三种套管有显著的差异，匹兹堡套管需要的力量明显较小( ),接着瑞穗套管（ ),而MK01表明需要对喷流的最高阻力（ )(图4 (c))。当着色盐水注入凝胶模仿脑，匹兹堡和瑞穗插管显示注射生理盐水的突起在1000和2000的速度 μ而MK01持续呈球形注射(图)5)。

4。讨论

这项研究表明，新研制的MK01插管显著减少血管损伤和喷流现象的发生，同时保持注射细胞活力，与匹兹堡和瑞穗插管进行比较。

基于干细胞的疗法正在成为一个有前途的治疗各种神经疾病和损伤的。有几种途径目前可用于细胞移植，包括实质内，静脉内，动脉内和鞘内注射。虽然最佳细胞移植路线尚未确定，大部分临床研究已申请实质内或移植的静脉途径[15]。实质内途径可将足够数量的细胞送入所需的脑损伤，与静脉途径相比有很大优势，静脉途径只能输送少量细胞[2，大部分被困在肺和脾脏。静脉输注法仍然是有效的，因为神经营养因子从细胞中释放出来，在免疫调节和抗炎症中至关重要，特别是在疾病的急性阶段。然而,当考虑到亚急性和慢性阶段,提供细胞受损区域需要重要的重组受损的神经元,和最近的系统性分析报道,intraparenchymal细胞移植优于静脉从功效的角度来看,在临床前和临床试验证明(15]。然而，实质内移植有一个严重的负担，即移植套管可引起实质内出血，并可能发生套管堵塞。

通过插管脑实质出血是一种严重的并发症。深部脑刺激过程被示为具有引起刺激的插管脑出血的大约5％，而心室引流在与沿着导管轨道性脑叶出血1.5％的死亡率脑积水的结果。一项临床试验报告的一个硬膜下血肿18例谁接受使用匹兹堡插管[脑实质内干细胞移植6而接受实质内人类神经干细胞移植的患者中，每13例中就有1例[8]。与此相反，Levi等。showed no needle (30-gauge) complication when injecting human CNS stem cells in 29 patients with cervical and thoracic cord injury, with four to eight sites and a depth of 3-4 mm from the spinal cord surface being selected for injection [16]。然而，造成注射插管脑实质出血的可能性不应被低估，因为它可能会导致灾难性的并发症。匹兹堡插管，这是我们在本研究中使用的，具有带窄形末端，其可以在插入过程中损伤血管的开口孔。与此相反，瑞穗针具有平的端部，其是安全的，但仍连接到容器时，可能会导致容器损坏。因此，我们使用新开发的插管具有圆形形状的针尖和开口孔超出球形赤道的边缘，确保球形形状从轨迹（桶）视图保留。

插管阻塞的是，应始终被视为另一种并发症[17,18]。脑碎片或细胞簇可导致插管的阻塞。事实上，我们发现的细胞存活检查过程中四个试验，以及使用匹兹堡插管时大脑碎片的比例非常高，在一个套管阻塞了。此外，我们也遇到了插管梗阻3出7例使用瑞穗套管（未发表数据）干细胞移植[10]。当套管受阻，外科医生可推动注射器强一点，或者可能需要更换套管。当注射器是为了推更强的破细胞簇，这可能引起强烈的力施加到所述的细胞或细胞悬浮液中，导致细胞死亡和/或细胞悬浮液的实质内喷流。细胞悬浮液的喷流可以反过来引起的脑损伤的附加，考虑到喷流实际上是适用于脑肿瘤切除[19,20.]。我们在这里开发的插管具有扇状形开口孔。扇形形状的孔被示出，以产生紊流当液体从它们射出，而紊流减小投影速度并禁止突出物质译者运动[21]。

有在这项研究中的一些限制。首先，针的评价在体外研究大多完成。当考虑脑出血，在这项研究中比较了针太大的啮齿动物的大脑来考虑。较大的动物将是适宜的针监测脑出血发生的评估，但它不适合但从动物福利的角度。其次，插管梗阻原因是没有充分研究。瑞穗插管经常显示阻塞在这个实验以及临床试验，但不能与MK01具有几乎相同的内部形状。在针的末端曲线可能是原因的差异之一，但进一步的评估是必要的，以实现更好的插管发展。

5.结论

我们开发了用于实质内细胞移植，其具有球形末端上侧的扇状开口孔更安全的插管。新的套管减少血管损伤和喷流现象的发生率，比此前公布的插管更安全，但进一步的调查是必要的，以验证其临床使用的安全性。

数据可用性

在北海道大学产生的原始数据。导出的数据支持该研究的结果可从上合理请求对应的作者（MK）。

利益冲突

北海道大学拥有设计MK01型套管的专利。Kawabori是这项专利的发明者。

致谢

本研究由阿米德资助，授权号为JP17bk0104045。

参考

1. M. Kawabori，S.黑田，M. Ito等人，“定时和细胞剂量确定在脑梗死模型大鼠骨髓基质细胞移植的治疗效果，”神经病理学第33卷，no。2，第140-148页，2013。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
2. M. Kawabori, S. Kuroda, T. Sugiyama等，“脑内而非静脉移植骨髓基质细胞促进脑梗死大鼠功能恢复:一项光学成像研究”，神经病理学卷。32，没有。3，第217-226，2012。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
3. J.陈，李Y.和M. Chopp，“MCAO大鼠后骨髓与BDNF的脑移植”神经药理学卷。39，没有。5，第711-716，2000。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
4. O. Honmou, K. Houkin, T. Matsunaga等，“静脉注射自体血清扩张自体间充质干细胞治疗中风，”大脑卷。134，没有。6，第一七九〇年至1807年，2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
5. D. C.赫斯，L. R.韦氏，W. M. Clark等人，“安全和在急性缺血性中风的多能成体祖细胞的功效（MASTERS）：随机，双盲，安慰剂对照，2期临床试验，”。《柳叶刀神经病学卷。16，没有。5，第360-368，2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
6. G. K. Steinberg, D. Kondziolka, L. R. Wechsler等，“移植改良骨髓间充质干细胞在卒中中的临床结果:1/2a期研究”，中风卷。47，没有。7，第1817-1824，2016。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
7. 李振华，“自体间充质干细胞移植在中风病人中的应用”，神经病学纪事卷。57，没有。6，第874-882，2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
8. 。D. Kalladka，J.辛登，K. Pollock等人，“人神经干细胞在慢性缺血性中风（PISCES）：相位1，先入人的研究，”《柳叶刀》卷。388，没有。10046，第787-796，2016。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
9. S. I.萨维茨，J.斯莫尔，J.武，G.五亨德森，P.斯泰格和L. R.卡普兰，“患者基底节梗塞胎儿猪细胞的Neurotransplantation：初步安全性和可行性研究，”脑血管疾病第20卷，no。2005年，第101-107页。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
10. H.七户，M. Kawabori，H.饭岛等人，“研究使用新颖骨髓干细胞（RAINBOW）先进的干预：一个研究协议用于相I，开放标记，自体不受控制的，剂量 - 反应试验在急性缺血性脑卒中的骨髓基质干细胞移植，”BMC神经第17卷，no。1，第179页，2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
11. J.博赫斯，R. Hilker，K.Bötzel等人，“三十天手术后并发症的发生率进行深脑刺激进行的，”运动障碍第22卷，第2期。10，第1486-1489页，2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
12. G. Deuschl, C. Schade-Brittinger, P. Krack等，“深度脑刺激对帕金森病的随机试验”，新英格兰医学杂志卷。355，没有。9，第896-908，2006年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
13. D. Kondziolka, G. K. Steinberg, S. B. Cullen, M. McGrogan，“神经细胞移植在中风患者中的外科技术评估”，细胞移植卷。13，没有。7-8，第749-754，2004。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
14. H. Shichinohe, S. Kuroda, K. Kudo等人，“使用3.0-T mria进行神经移植临床试验的超顺磁ioron氧化物(SPIO)标记骨髓基质细胞的可视化”平移卒中研究卷。3，没有。1，第99-106，2012。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
15. L. L. Cui, D. Golubczyk, A. M. Tolppanen, J. Boltze, J. Jolkkonen，“缺血性中风的细胞治疗:临床前和临床研究设计的差异是导致转化疗效损失的原因吗?”神经病学纪事卷。86，没有。1，第5-16，2019。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
16. A. D. Levi, D. O. Okonkwo, P. Park等，“慢性颈、胸脊髓损伤患者神经干细胞髓内移植的新安全性”，神经外科卷。82，没有。4，第562-575，2018。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
17. S. Yamada, V. Khankaldyyan, X. Bu等，“一种精确地将肿瘤细胞注入小鼠大脑尾状核/壳核的方法，”东海中华实验和临床医药杂志第29卷，no。4, 167-173页，2004年。视图:谷歌学术搜索
18. S. C. Vermilyea，J.路，M. Olsen等人，“实时术诱导的多能干细胞衍生的神经元的MRI脑内递送，”细胞移植第26卷，no。4，第613-624页，2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
19. A.中川，T.隈部，M. Kanamori等，“脉冲激光诱导液体射流的临床应用：在神经胶质瘤手术初步报告”。没有Shinkei Geka第36卷，no。11, 1005-1010页，2008。视图:谷歌学术搜索
20. A. Nakayashiki，T.川口，A. Nakagawa等人，“水面纱从脉冲射流装置的效果控制飞溅：使用外科抽吸器最小化传播的潜在风险，”。杂志神经外科某一部分：中欧神经外科卷。79，第309-315，2018。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
21. “紊流管道中减阻的实验研究”。见第83卷第809页)，”能源《中国日报》，第64卷，第818-827页，2014。视图:谷歌学术搜索

版权

版权所有©2020正人Kawabori等。这是下发布的开放式访问文章知识共享署名许可，允许在任何媒体中不受限制地使用、发布和复制原创作品，只要原稿被正确引用。