SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/4085617 4085617 研究文章 小说评价立体定向插管对中枢神经系统疾病的干细胞移植 https://orcid.org/0000 - 0002 - 3574 - 8380 Kawabori Masahito Tanimori 阿基 Kitta Shinri https://orcid.org/0000 - 0003 - 2910 - 4711 Shichinohe Hideo Houkin Kiyohiro Chatterjee Sumanta 神经外科和神经细胞疗法 北海道大学医学院毕业 札幌 北海道 日本 hokudai.ac.jp 2020年 11 2 2020年 2020年 10 11 2019年 20. 01 2020年 30. 01 2020年 11 2 2020年 2020年 版权©2020 Masahito Kawabori et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

细胞治疗中枢神经系统(CNS)疾病开始证明其安全性和效率。Intraparenchymal移植的细胞可以选择交付;然而,关于这种方法的一个问题是,移植插管可能会导致额外的脑损伤。这些包括血管损伤,导致脑部出血,和套管的阻塞大脑碎片和/或细胞集群,需要更换套管或强制注射导致细胞悬液的射流。我们比较细胞交割的套管用于临床试验、匹兹堡和瑞穗套管,一个新设计,MK01,评估他们的可用性。MK01与扇状spherical-shaped提示开孔的套管,防止血管损伤,大脑碎片堵塞,射流现象。我们比较大鼠颈部和腹部动脉损伤的程度与套管,套管的碎片,导致射流,所需的力和细胞生存能力。而细胞的生存能力通过套管之间的套管几乎是相同的(约95%),颈动脉损伤引起的匹兹堡插管和随后的出血,因为它需要一个小得多的力量穿透动脉壁。此外,匹兹堡插管,但不是瑞穗和MK01套管,显示高频率的大脑碎片针尖端大脑穿刺后(大约80%)。当射流喷射液体的观察即使当使用较小的部队在匹兹堡和瑞穗套管,MK01不断显示低射流发生。 Thus, MK01 seems to be safer than the previously reported cannulas, although further investigation is necessary to validate its safety for clinical use.

 艾湄湾 JP17bk0104045 1。介绍

移植的干细胞在中枢神经系统(CNS)疾病在实验室展示了有前景的结果( 1- - - - - - 3),和几个临床试验开始证明其安全性和有效性( 4- - - - - - 7]。虽然,一个理想的移植路线尚未确定,intraparenchymal移植细胞传递仍是一个选择,因为它使交付足够多的细胞与血管内受损的大脑相比,实现移植( 6, 8, 9]。到目前为止,没有套管由监管机构批准用于细胞移植,包括FDA和不同类型的套管特别设计或采用其他用途是用于临床试验 6, 10]。然而,直接移植的一个主要问题是由移植插管脑损伤的潜在风险。脑出血的风险电极插入在脑深部电刺激术据报道约2 - 5%,整个过程( 11,干细胞移植可能也有类似的或更高的风险等并发症,随着套管插入大脑区域与先前存在的损害( 6, 12]。另一个问题是,大脑碎片和细胞悬液可能导致套管堵塞,因为大多数干细胞类型依从性属性,和细胞保存在一个稳定的位置在交付到手术室。套管细胞堵塞时,外科医生需要改变套管,造成额外伤害大脑,或推动注射器强打破细胞集群,导致细胞死亡和/或细胞悬液的射流,这也会导致额外的脑损伤。为了克服这些问题,我们开发了一个新颖的移植插管,spherical-shaped提示和fan-like-shaped开孔。在这个报告中,我们的设计和性能评价这部小说套管相比,套管用于临床试验。

 2。材料和方法 2.1。实验伦理

动物实验协议都是动物实验伦理委员会批准的北海道大学研究生院医学(参考号17 - 0066),和所有动物过程中使用本研究按照制度进行动物实验的指导方针,适当的指导方针进行动物实验的科学理事会的日本,和到达(在体内实验动物研究:报告)的指导方针。所有人类的实验包括干细胞和血小板收获进行了按照《赫尔辛基宣言》的指导原则,以及研究机构审查委员会批准的(参考号012 - 0334)。所有参与者提供书面知情同意参与这项研究。

 2.2。细胞交付套管

匹兹堡细胞植入插管和探针(美国SB2023、协同学、O ' fallon),瑞穗活检/注射针(mes - cg07 - 200 - 01,瑞穗,东京,日本),和我们的新设计的套管,MK01,这个实验检查。匹兹堡和瑞穗套管已用于临床试验将干细胞注入大脑( 6, 10, 13]。套管的基本参数表中列出 1。简单地说,匹兹堡套管内部的内径是250 μm,细胞喷射孔位于套管,在顶端显示了外径略有缩小。瑞穗的内部孔针是300 μm,细胞喷射孔位于一侧的针,从远端7毫米。从瑞穗插管MK01被修改,(图具有以下特征 1):它是由100%的不锈钢、外套管的直径是1.5毫米,和内部的内径是300 μ米,使直接附件Leksell立体定向弧系统(模型G, Elekta,瑞典)。套管的内部体积是23.9 μL,仪器长度是19厘米,没有灵活性。MK01的特征是它的喷射孔位于一侧的插管而非插管的尖端。此外,喷射孔设计在扇状展开形式避免射流,即使在高压力。此外,插管的顶端球形状,避免血管穿刺和插入期间的伤害。远端一侧的开孔是弯曲的只是近球形的赤道线提示,这样开孔没有出现从插入轨迹视图。套管可以使用传统的蒸汽消毒技术。

套管的基本特征。

外直径 内部内径 内部体积 灵活性 注入孔 尖的形状
匹兹堡 不锈钢 890毫米 250毫米 20毫升 是的 提示 缩小与开放的提示
瑞穗 不锈钢 1500毫米 300毫米 23.9 μl 没有 一边 夷为平地
MK01 不锈钢 1500毫米 300毫米 23.9 μl 没有 一边 球形

的照片MK01插管和开孔的形状。远端一侧的开孔是弯曲的只是近球形的赤道线提示,这样开孔没有出现从插入轨迹视图。

 2.3。实验动物

八周大的雄性老鼠Sprague-Dawley(克丽日本,Inc .,东京,日本),重260 - 300克,被用于实验。动物被安置在一个受控环境(温度25°C,湿度50%,和12小时的光暗周期),并允许自由获取食物和水。老鼠与异氟烷麻醉的初始浓度为4.0% 70% N2O和30%啊2麻醉气体,维持在2.0%的浓度,通过一个面膜,如前所报道( 2]。实验动物的直肠温度是36.5和37.5°C之间保持整个过程使用一个自动化的热垫。动物安乐死深麻醉如前所述使用5.0%异氟烷以人道的方式颈椎脱位紧随其后。

 2.4。细胞培养

人类骨髓干细胞(BMSC)和血小板溶解产物(PL)收获从三个健康的捐赠者,正如前面报道( 10]。简而言之,骨髓单核细胞通过密度梯度离心分离Ficoll-Hypaque®(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典)和细胞被播种在175厘米2裸瓶(EasYFlask 159910;密度约Nunc) 20. × 10 5 细胞/厘米2在25毫升 α最小基本培养基含有10% PL来源于健康的志愿者和40 μ硫酸庆大霉素的g / mL。24小时后,不依从细胞通过改变介质中删除。培养基是取代每周两次。bmsc通过前两到三次使用它们的后续过程。bmsc的水瓶收集使用TrypLe选择®(一种重组胰岛素替代品,Gibco)和离心机。上层清液提供了,细胞被轻轻的在resuspended ARTCEREB®(灌溉和灌注的解决方案用于脑脊髓手术;大冢制药工厂,Inc .、火影忍者、日本)的浓度 5 × 10 7 细胞/毫升。细胞的大小是衡量使用一个自动化的单元格大小计算器(iSpect DIA-10,日本岛津公司有限公司,京都,日本)。

 2.5。细胞生存能力分析

细胞生存能力通过插管前后检查使用LUNA自动细胞计数(标志生物系统公司、韩国),根据制造商的指示。四个不同的程序进行,相对比之前和之后的细胞生存能力细胞注入计算。

 2.6。血管穿刺实验

麻醉诱导后,双边颈总动脉(CCA)通过下腹正中切口的脖子。胶板是由CCA稳定。动脉插管提示被放置在通过应用温和的压力是否套管可以穿透动脉。如果动脉受损,温柔压缩大约10分钟使动脉的动脉出血停止。十个程序为每个在不同动脉插管进行位置。程序后,老鼠安乐死,腹主动脉是收获(大约7 - 10毫米长度可以收获)。动脉管被打开,放在塑料薄膜覆盖在塑料3毫米的洞。动脉被针稳定在塑料薄膜上,六角钉在1毫米的塑料边。套管连接使用一个数字测力计监测(ZTA-50N, IMADA,丰桥,日本),和穿透动脉壁测量的力量。六种不同的程序为每个套管进行( n = 3 对于每个实验和两个穿刺/动物)。

 2.7。大脑和肝脏穿刺实验

麻醉诱导后,动物被固定到一个立体定向仪。头骨被曝光,和一个2毫米直径磨洞前囱3毫米左右,使用一个小牙钻,之前报道( 1]。套管是慢慢地插入大脑实质,直到提示达到颅底(大约10毫米的表面硬脑膜)。撤回的插管脑后,套管与生理盐水冲洗评估大脑碎片出现在套管的存在。三个独立实验的10为每个套管穿刺进行( n = 3 每个实验和10穿刺/动物)。大脑的实验后,腹部被一个线性接触皮肤切口。然后,套管在慢慢插入到肝脏,从地面5毫米,插管又刷新了检查的碎片如前所述。

 2.8。射流实验

套管连接使用一个自动化的喷射泵,并与2%台盼蓝不断注入生理盐水在不同注入速度从0到11毫升/分钟。套管开孔板水平放置10厘米以上地板,和10之间的距离达到盐水比较每个套管实验。然后,套管孔垂直放置,并使用一个包含盐2%台盼蓝1毫升注射器。注射器,连接于数字测力计,被评估所需的力导致液体喷泉。然后,一个幽灵大脑凝胶制备33%硼砂,与修改(如前所述 14]。套管放在凝胶,表面3厘米以下,2%台盼蓝注射速度,持续30秒。注射生理盐水的形状被拍到检查射流的存在。

 2.9。统计数据

所有的数据表达 的意思是 ± 标准 偏差 或中位数(四分位范围(差))。所有统计分析使用JMP版本12 (SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)。连续数据比较用单因素方差分析的图基HSD测试。样本大小选择基于初步实验。简单地说,在单向方差分析研究中,样本大小的从3组获得2意味着相比。6到10个科目的总样本检测差异达到100%力量与平等意味着使用的替代手段 F 测试0.0500显著性水平。变化的大小为代表的意思是他们的标准偏差为0.83。常见的标准偏差在一组假定为1.00。我们曾经通过14.0.9(通过软件的存在,LLC)计算统计力量。 p 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。没有区别不同套管之间的细胞生存能力

刚做好的人bmsc是通过套管。平均细胞大小30毫米,(IQR 20 - 70毫米)。细胞生存能力与匹兹堡、瑞穗和MK01套管 95.8 ± 8.1 % , 93.8 ± 8.8 % , 94.1 ± 9.9 % ,分别。然而,闭塞的套管发生细胞集群使用瑞穗插管尝试四次。

 3.2。高频率的动脉血管损伤与匹兹堡插管

当轻轻按下动脉插管,只有匹兹堡插管渗透动脉和导致大出血(数字 2(一个)和 2 (b))。然而,瑞穗和MK01cannulas没有引起动脉血管破裂。所需要的力量穿透腹部动脉壁与匹兹堡显著降低插管( 1.06 ± 0.13 N 比瑞穗() 3.28 ± 0.89 N )和MK01 ( 2.91 ± 0.38 N )套管(图 2 (c))。

的照片压缩使用匹兹堡的颈动脉插管(a)和后大出血的动脉血管渗透(b)。图显示所需的力量穿透腹部动脉壁与每个插管(c),匹兹堡插管要求小得多的力量穿透动脉与瑞穗和MK01套管。

 3.3。大脑碎片位于匹兹堡插管

大脑碎片被发现,只有在匹兹堡插管( 77.1 ± 20.6 % ),而没有碎片在瑞穗和MK01套管(数字 3(一个)和 3 (b))。没有肝残骸中发现的任何针。

大脑的残骸中发现的每个插管(a)和代表人物的碎片(b,箭头)。

 3.4。MK01最低射流的能力

当针洞是水平放置和注射的盐水,所有显示滴液体的速度介于0和3毫升/分钟;然而,匹兹堡插管开始显示水平射流4毫升/分钟,继续扩大与流动距离的注入速度增加。瑞穗针也开始显示射流从5毫升/分钟,距离也在更高的速度扩张。然而,MK01没有显示射流速度11毫升/分钟(数据 4(一)和 4 (b))。然后我们检查所需的力导致飞机喷泉通过推针使用数字测力计监测。有显著差异的三套管,与匹兹堡插管要求明显较小的力( 1.62 + 0.18 N ),其次是瑞穗插管( 2.62 ± 0.27 N ),而MK01显示最高的阻力需要对喷射流( 5.76 ± 0.55 N )(图 4 (c))。当彩色盐水注入凝胶模仿大脑,匹兹堡和瑞穗套管显示突出的注射盐水1000年和2000年的速度 μL / min, MK01不断显示球注入(图 5)。

喷射流的代表人物,每个套管(箭头),和距离达成的盐水(b) (对此,§ p < 0.05 比MK01)。所需的力(N)导致垂直射流(喷泉)(c) ( ∗ p < 0.05 )。

彩色的盐水注射凝胶模仿大脑。匹兹堡和瑞穗针显示射流突出(箭头所指),享年2000岁 μL / min(箭头),而MK01没有造成凸起。

 4所示。讨论

本研究表明,新开发的MK01插管显著减少血管损伤和射流现象的发生,同时保留注入细胞生存能力,而匹兹堡和瑞穗套管。

干细胞治疗正在成为一个有前途的治疗各种神经系统疾病和损伤。目前有几种途径可用于细胞移植,包括intraparenchymal、静脉、动脉内的,鞘内注射。尽管最佳的细胞移植的路线还未确定,大多数临床研究应用intraparenchymal或静脉移植的途径 15]。intraparenchymal路线提供足够数量的细胞所需的脑损伤,拥有强大优势静脉途径,只有少量的细胞可以交付 2),其中大部分被困在肺和脾。静脉注射方法仍是有效的,因为神经营养因子释放的细胞,在免疫调节和抗炎至关重要,尤其是在疾病的急性期。然而,当考虑到亚急性和慢性阶段,提供细胞受损区域需要重要的重组受损的神经元,和最近的系统性分析报道,intraparenchymal细胞移植优于静脉从功效的角度来看,在临床前和临床试验证明( 15]。然而,intraparenchymal移植有严重的负担,即移植套管可以诱导intraparenchymal出血,可能发生阻塞的插管。

Intraparenchymal出血的套管是一种严重的并发症。脑深部电刺激程序显示有大约5%的脑出血刺激引起的套管,同时为脑积水脑室引流导致1.5%的死亡率与沿导管追踪大叶性出血。一个临床试验报道一个硬脑膜下血肿在18个病人intraparenchymal干细胞移植使用匹兹堡插管[ 6),另一个在13个病人intraparenchymal人类神经干细胞移植( 8]。相比之下,利等人没有针(30-gauge)并发症患者注射人类中枢神经系统干细胞在29日颈椎和胸椎脊髓损伤,4至8个网站和深度的3 - 4毫米注入脊髓表面被选中的( 16]。然而,intraparenchymal出血的可能性注入引起的套管不应该被低估,因为它可能会导致灾难性的并发症。匹兹堡插管,我们使用在这项研究中,有一个开孔狭窄形尖,这可能会伤害到船在插入过程中。相比之下,瑞穗针有一个平坦的提示,更安全,但仍可能导致血管损伤时连接到容器。因此,我们使用一个新开发的套管与圆形的小费和开放孔球形赤道的边缘之外,确保保留了球形的轨迹(桶)视图。

套管阻塞是另一个应该考虑的并发症( 17, 18]。大脑碎片或细胞集群可以导致梗阻的套管。事实上,我们发现套管阻塞在一个细胞生存期间的试验检查,以及一个非常高的比例的大脑碎片当使用匹兹堡插管。此外,我们遇到了套管阻塞3的7干细胞移植患者使用瑞穗插管(未发表的数据) 10]。套管阻塞时,外科医生可能推动注射器有点强或可能需要更换套管。当注射器推强为了打破细胞集群,这可能导致细胞或细胞悬液的强相互作用,导致细胞死亡和/或intraparenchymal细胞悬液的射流。细胞悬液的射流可能反过来造成额外伤害大脑,考虑到射流是申请脑瘤切除( 19, 20.]。我们这里开发的插管fan-like-shaped开孔。Fan-like-shaped孔产生湍流流场显示液体时出现,而湍流流动减少了投影速度和禁止的翻译运动预测物质( 21]。

这项研究有一些局限性。首先,针的评估主要是在体外研究完成的。当考虑脑出血,针在这项研究相比太大的啮齿动物的大脑需要考虑。大型动物适合于评估这个针监控脑出血的发生,但它不适合从动物福利的观点。第二,套管阻塞的原因是没有完全检查。瑞穗套管经常显示阻塞在这个实验中,以及在临床试验中,但是不是MK01内部形状几乎相同。曲线的针可能差别的一个原因,但需要进一步评估达到更好的套管的发展。

 5。结论

我们开发了一个更安全的插管intraparenchymal细胞移植,具有球形提示与扇状开孔。新的套管减少血管损伤的发生率和射流现象,更安全比之前报道的套管,尽管进一步的调查来验证其临床使用安全是必要的。

 数据可用性

北海道大学的原始数据生成。派生数据支持本研究的发现可以从相应的作者(可)以合理请求。

 的利益冲突

北海道大学持有专利(待定)MK01套管的形状的方法。Kawabori专利的发明者。

 确认

本研究支持下艾湄湾格兰特JP17bk0104045数量。

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