与hCTLA4-基因修饰人骨髓间充质干细胞（hBMMSCs）保持POSTN分泌通过整合到增强同种异体hBMMSCs的迁移能力αvβ3 / FAK / ERK信号通路

摘要

细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4- (CTLA4-)修饰的人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)可能是骨组织工程的种子细胞。然而，潜在的机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了ctla4修饰的hBMMSCs是否通过维持POSTN分泌参与异基因hBMMSCs (alloc -hBMMSCs)的迁移。hBMMSCs从不同的组中分离，分别命名为hBMMSCs和异源hBMMSCs。将表达CTLA4、POSTN或CTLA4+ POSTN shRNA的阴性对照(NC)、空腺病毒或重组腺病毒感染的hBMMSCs分别命名为NC hBMMSCs、CTLA4修饰的hBMMSCs、POSTN修饰的hBMMSCs或CTLA4+ shpostn修饰的hBMMSCs。然后以1:5和2.5的比例与pbmc共培养μg / mL植物凝集素(PHA)。收集共培养上清，用抗整合素处理异源hbmmscsαvβ3，IgG或阴性对照IgG，作为对照。在此之后，ELISA，Transwell检测，伤口愈合试验，并进行免疫印迹。我们发现，POSTN水平在CTLA4-和POSTN改性hBMMSCs的培养上清比NC hBMMSCs与PHA处理的PBMC共培养高。同种异体hBMMSCs的迁移能力增强，和该整αvβCTLA4-和postn修饰的hBMMSCs与PHA处理的PBMCs共培养上清可激活异源hBMMSCs中的3/FAK/ERK信号通路。此外，这些诱导作用可通过POSTN敲低而减弱，抗整合素阻断了异源hbmmscs的迁移能力αvβ3的IgG。总之，与hCTLA4基因修饰hBMMSCs保持POSTN分泌通过整合来增强异体hBMMSCs的迁移能力αvβ3/FAK/ERK信号通路在T细胞免疫激活环境中。

1.介绍

骨折、肿瘤切除和骨感染引起的大骨缺损在骨科临床实践中非常常见。近年来，组织工程骨(tissue engineering bone, TEB)发展迅速，在修复大骨缺损方面取得了良好的疗效[1]。人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)是TEB中重要的种子细胞[2，3.]. 然而，自体骨髓间充质干细胞受到患者个体差异和数量有限的限制；因此，自体MSCs不能满足临床治疗和TEB产业化的需要。因此，异基因骨髓间充质干细胞可能是骨组织工程的另一种种子细胞来源，因为它们的数量是无限的。虽然同种间充质干细胞的免疫原性很低，但不能完全忽视，因为它在同种移植中仍能诱导免疫排泄[4]。同种异体hBMMSC移植几乎总是导致移植排斥反应。因此，迫切需要克服移植排斥的新方法。

免疫抑制分子细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4)是一种著名的CD80/CD86配体，是一种表达于T细胞上的共抑制分子，介导T细胞功能的抑制。在我们之前的研究中，我们发现CTLA4在T细胞免疫激活模型中增强了同种异体hBMMSCs的成骨分化体外［5]。此外，我们观察到CTLA4有利于hBMMSC移植和异体受体成骨分化[6]。这些结果表明，ctla4修饰的hBMMSCs可能是骨组织工程的种子细胞。然而，这一过程背后的机制尚不清楚。

重要的是，我们发现，在脱钙骨基质上接种ctla4修饰的hBMMSCs的大多数细胞在移植后的2周、4周、8周和12周来自宿主自身[6]。因此，我们预测，CTLA4改性hBMMSCs可以提高主机MSCs的招募，从而促进异基因移植骨缺损的修复。最近我们另一个的研究表明，CTLA4促进成骨MSC在T细胞免疫激活的条件下异种移植通过维持骨膜素（POSTN）的表达[7]。POSTN又称成骨细胞特异性因子2 (OSF-2)，是成骨细胞及其祖细胞分泌的一种非胶原细胞外基质(ECM)蛋白[8]。POSTN与胶原纤维、纤维连接蛋白、透明蛋白、板层结合蛋白、骨结合蛋白和骨桥蛋白共同作用于骨组织的微环境[9，10.]。ECM在细胞通信中起着重要的作用[11.，12.]。此外，有报道称，POSTN可促进牙周韧带MSCs的迁移和成骨分化潜能[13.]. 因此，我们预测CTLA4修饰的HBMMSC通过增加POSTN的分泌参与宿主MSC的募集。

在本研究中，我们研究了ctla4修饰的hBMMSCs是否通过维持T细胞免疫激活微环境中的POSTN分泌而参与异基因hBMMSCs的迁移体外。此外，我们阐明了潜在的机制。

2.材料和方法

2．1.hbmscs的分离与鉴定

所有提供骨髓的志愿者被随机分为两组( ；所有的男性;年龄范围:25-28岁)。获得了所有志愿者的书面知情同意。本研究经军医大学第一附属医院伦理委员会批准。hBMMSCs按照我们之前描述的方法分离[5，6]. 从两组的髂嵴抽取的骨髓分别用于分离骨髓间充质干细胞。从第一组分离的MSCs被命名为hBMMSCs，并被表达CTLA4、POSTN或针对POSTN的shRNA（shPOSTN）的腺病毒感染。从另一组分离的hBMMSCs称为异基因hBMMSCs（allo-hBMMSCs）。将分离的hBMMSCs和异体hBMMSCs混合在一个1 : 1比率，并通过流式细胞术使用干细胞阳性标记物CD105、CD44和CD90以及干细胞阴性标记物CD34和CD45进行鉴定。

2.2。外周血单核细胞的分离（PBMC）中

肝素化外周血取自健康志愿者。采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离PBMCs。分离的PBMC在RPMI 1640培养基（Gibco，Carlsbad，CA，USA）中培养，该培养基含有10%胎牛血清（Gibco），补充有100%胎牛血清 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素和2 谷氨酰胺。

２.３.实验模型的建立

为了建立T细胞免疫激活微环境，pbmc ( 细胞）与2.5刺激 μg/mL phytohemagglutinin (PHA) (Sigma, St. Louis, MO, USA)，一种用于刺激多克隆T细胞的试剂[14.]。经PHA处理或不经PHA处理24、48、72、96 h后，收集培养基，检测白细胞介素- (IL-) 2和干扰素- (IFN-)的水平。γ. IL-2和IFN的水平-γ采用ELISA试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)测定。

表达CTLA4、POSTN或POSTN的shRNA的重组腺病毒购自GenePharma公司(Shanghai GenePharma Co.， Ltd, Shanghai, China)。将表达CTLA4、POSTN、POSTN shRNA的阴性对照(NC)、空腺病毒或重组腺病毒感染的hBMMSCs分别命名为NC hBMMSCs、CTLA4修饰的hBMMSCs、POSTN修饰的hBMMSCs、CTLA4+ shpostn修饰的hBMMSCs。

NC hBMMSCs，CTLA4-改性hBMMSCs，POSTN改性hBMMSCs，或CTLA4 + shPOSTN改性hBMMSCs（ 细胞)与PBMCs ( cells) at a ratio of 1 : 5 with 2.5 μ克/毫升PHA。PHA处理72 h后，收集培养上清，使用ELISA试剂盒(R&D Systems)检测POSTN水平。培养上清按10:1的比例浓缩用于以下试验。

为了研究NC-hBMMSCs、CTLA4修饰的hBMMSCs、POSTN修饰的hBMMSCs或CTLA4+shPOSTN修饰的hBMMSCs对异基因hBMMSCs迁移的影响，将这些细胞与PHA刺激的PBMCs共培养的浓缩培养上清以1的比例添加到异基因hBMMSCs的培养基中 : 10和异基因HBMMSC分别命名为NC、CTLA4、POSTN和CTLA4+shPOSTN。

研究CTLA4或POSTN是否通过整合素影响异源hbmmscs的迁移αvβ3、2μg/mL阴性对照IgG或抗整合素αvβ3用CTLA4修饰的hBMMSCs或postn修饰的hBMMSCs与PHA刺激的PBMCs共培养的浓缩培养上清，在异体hBMMSCs培养液中加入IgG，将异体hBMMSCs命名为CTLA4+IgG, CTLA4+抗整合素αvβ3、POSTN+IgG和POSTN+抗整合素αvβ分别为3。

２.４.Transwell迁移分析

总共有10000个异源hbmmscs加入Transwell室的上部(24孔，8.0孔)μm).培养基(600μL)含20%胎牛血清加入下腔。在不同条件下培养24 h后,上表面allo-hBMMSCs摧毁了棉花球,和迁移到背面的allo-hBMMSCs Transwell膜是用PBS洗净,与5%戊二醛固定在4°C,并与结晶紫染色(0.5%)染色溶液5 - 10分钟。PBS洗涤2次后，在显微镜下随机观察5个野，计数每个野中迁移的异源hbmmscs数量。

2．5．伤口愈合实验

在6孔板底部绘制五条直线后， 细胞/异源hbmmscs被播种。次日，沿5条直线用无菌200μ大号移液管尖端。同种异体hBMMSCs用PBS洗涤三次以除去分离的细胞。Subsequently, a 2.5 mL serum-free medium containing a 10% concentrated culture supernatant from MSCs, MSCs-CTLA4, MSCs-POSTN, or MSCs-CTLA4-ShPOSTN groups, or a concentrated culture supernatant from CTLA4-modified hBMMSCs or POSTN-modified hBMMSCs with 2 μ克/ mL的阴性对照IgG或整αvβ3，加入细胞并在37°C、5% CO的湿化气氛中培养₂．48 h时，用相位反差显微镜(Motic Microscopy, Xiamen, China)监测创面宽度并拍照。伤口愈合百分率计算公式如下

2.6。免疫印迹

完全, 每孔异源hbmmscs播种在6孔板中，在不同条件下培养。培养24 h后，收集细胞进行western blot检测MMP2、MMP9、integrin的表达水平αvβ3、FAK, p-FAK, ERK1/2, p-ERK1/2, AKT1/2, p-AKT1/2。Western blot如前所述[5]。

2.7。统计分析

三次独立实验的结果如下 ．使用SPSS软件版本19.0（IBM，芝加哥，IL，USA）进行统计分析。统计分析进行了使用单向ANOVA然后事后LSD检验。价值 被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.成功构建细胞模型

hBMMSCs中，干细胞阳性标记CD44、CD105、CD90的细胞比例分别为99.27%、98.12%、99.91%，干细胞阴性标记CD34、CD45的细胞比例分别为7.63%、1.99%(图3)1). 对于异基因HBMMSC，干细胞阳性标记物CD44、CD105和CD90的细胞比例分别为99.22%、99.42%和99.33%，而干细胞阴性标记物CD34和CD45的细胞比例分别为2.68%和4.53%（图1)．这些结果表明hBMMSCs和异源hBMMSCs被成功分离。

如图所示2，CTLA4成功超表达在CTLA4-改性hBMMSCs和CTLA4 + shPOSTN改性hBMMSCs，和在POSTN CTLA4-改性hBMMSCs和POSTN改性hBMMSCs成功过表达。在CTLA4 + shPOSTN改性hBMMSCs的POSTN水平明显低于在CTLA4-改性hBMMSCs并与NC hBMMSCs无明显变化，这表明shPOSTN成功沉默CTLA4诱导POSTN上调。

如图所示3.， IL-2和IFN-的水平γin the culture supernatant of PBMCs increased after being treated with PHA for 24, 48, 72, and 96 h, and IL-2 and IFN-γlevels reached their peak at 72 h. Therefore, the conditions under which PBMCs were treated with PHA for 72 h were chosen as the appropriate time to represent the T cell immune activation microenvironment.

如图所示4中，POSTN水平在CTLA4-和培养上清更高POSTN改性hBMMSCs比在数控hBMMSC共培养用PHA处理的PBMC。另外，在CTLA4 + shPOSTN改性hBMMSCs的培养上清液POSTN水平高于在CTLA4-改性hBMMSCs的培养上清液下部，并与NC hBMMSCs的培养上清液无明显变化，这表明shPOSTN成功抑制分泌POSTN的结合与PHA处理的PBMC共培养CTLA4-改性hBMMSCs保持通过CTLA4。

所有上述结果表明，POSTN在CTLA4-或POSTN改性hBMMSCs的培养上清液中的过表达可在T细胞的免疫活化的微环境能够维持的，并且这些细胞模型适合于调查是否CTLA4-改性hBMMSCs参与同种异体hBMMSCs的通过在T细胞免疫激活的微环境促进POSTN分泌迁移体外．

３．２．CTLA4-和postn修饰的hBMMSCs与PHA处理的pbmc共培养的培养上清液增强了异源hBMMSCs的迁移能力

Transwell小测定的结果表明，在CTLA4和POSTN组迁移同种异体hBMMSCs的数量超过该NC组中，和CTLA4 + shPOSTN组中迁移同种异体hBMMSCs的数量明显低于在CTLA4组（图5(一个))．在CTLA4和POSTN基同种异体hBMMSCs的伤口闭合的百分比比NC组高，并且CTLA4 + shPOSTN组中同种异体hBMMSCs的伤口闭合的百分比明显高于CTLA4组低（图5 (b))．此外，CTLA4和POSTN组的alloi - hbmmscs MMP2和MMP9表达水平高于NC组，CTLA4+shPOSTN组的alloi - hbmmscs MMP2和MMP9表达水平低于CTLA4组(图)5（c）)．

3.3。整合素αvβ3 / FAK / ERK信号通路在异基因hBMMSCs通过CTLA4-和POSTN改性hBMMSCs共培养的培养上清中活性与用PHA处理的PBMC

整合素αv /β3、CTLA4组和POSTN组的异源hbmmscs中p-FAK、p-ERK1/2和p-AKT1/2的表达水平高于NC组，而总FAK、ERK1/2和AKT1/2的表达水平没有明显变化(图)6)．此外,整合素αvβ3，P-FAK，P-ERK1 / 2，并在CTLA4 + shPOSTN组中同种异体hBMMSCs P-AKT1 / 2的表达水平高于所述CTLA4组低，而总FAK，ERK1 / 2，和AKT1/ 2的表达水平没有显示出显着变化（图6)．这些结果表明整合素αvβCTLA4-和POSTN修饰的hBMMSCs与经PHA处理的PBMCs共培养的培养上清激活3/FAK/ERK信号通路，shPOSTN可抑制CTLA4诱导的激活。

3.4。抗整合αvβ3阻断CTLA4-和postn修饰的hBMMSCs与PHA处理的pbmc共培养上清的作用

整合素αv /β3，P-FAK，P-ERK1 / 2和p-AKT1 / 2的表达在CTLA4 +抗整合同种异体hBMMSCs水平αvβ3和POSTN+抗整合素αvβ3组低于CTLA4+IgG和POSTN+IgG组，而总FAK、ERK1/2和AKT1/2表达水平没有显示出显著变化（图1）7)．这些结果表明抗整合素αvβ3阻断CTLA4-和postn修饰的hBMMSCs培养上清与PHA处理的PBMCs共培养的作用。

Transwell实验结果显示，在CTLA4+抗整合素中迁移的异源hbmmscs的数量αvβ3和POSTN+抗整合素αvβ3组均低于CTLA4+IgG和POSTN+IgG组(图)8（a）)．同种异体hbmmscs在CTLA4+抗整合素中创面愈合的百分比αvβ3和POSTN+抗整合素αvβ3组均高于CTLA4 + IgG和POSTN + IgG的组低（图8 (b))．此外，在CTLA4+抗整合素中，异源hbmmscs中MMP2和MMP9的表达水平αvβ3和POSTN+抗整合素αvβ3组均高于所述CTLA4 + IgG和POSTN + IgG的组低（图8 (c))．

4.讨论

hbmscs是TEB中重要的种子细胞[2，3.]。与自体hBMMSCs一样，异源hBMMSCs也是TEB中重要的种子细胞来源，因为它们数量无限。然而，同种异体hBMMSC移植引起的移植排斥反应限制了其在临床上的应用。我们前期研究表明，ctla4修饰的hBMMSCs在T细胞免疫激活微环境中可以保持成骨分化在活的有机体内［5]，表明CTLA4-改性hBMMSCs可以是用于TEB有希望的来源。因此，关键是要进一步评估它们的潜在作为在TEB CTLA4-改性hBMMSCs克服移植排斥种子细胞源。我们的研究表明，CTLA4改性hBMMSCs可以提高主机MSCs的招募以某种方式[6]。因此，我们预测ctla4修饰的hBMMSCs参与了异基因hBMMSCs的迁移。除了验证这一假设，我们还讨论了潜在的机制。

为了研究ctla4修饰的hBMMSCs对异源hBMMSCs在T细胞免疫激活微环境中的迁移能力的影响，将ctla4修饰的hBMMSCs与PHA处理的PBMCs共培养，模拟免疫激活微环境，收集共培养液处理异源hBMMSCs。我们的结果显示，CTLA4和POSTN组中迁移的alloi - hbmmscs数量多于NC组，CTLA4和POSTN组中alloi - hbmmscs伤口愈合的百分比高于NC组。此外，CTLA4和POSTN组的异体hbmmscs中MMP2和MMP9表达水平高于NC组。MMP2和MMP9是促进细胞迁移的重要蛋白质[15.，16.]。综上所述，我们的结果表明，ctla4修饰的hBMMSCs培养上清液可以增强异源hBMMSCs在T细胞免疫激活微环境中的迁移能力。这和我们以前的一致在活的有机体内在该研究中，在脱钙骨基质上接种ctla4修饰的hBMMSCs的大多数细胞在移植后2周、4周、8周和12周来自宿主自身[6]。

我们发现，postn修饰的hBMMSCs和ctla4修饰的hBMMSCs培养上清液对异源hBMMSCs在T细胞免疫激活微环境中的迁移能力有相似的影响。此外，CTLA4+shPOSTN组移植的异体hbmmscs数量、异体hbmmscs创面愈合率、异体hbmmscs MMP2和MMP9表达水平均低于CTLA4组，提示POSTN敲除可减弱ctla4修饰的hBMMSCs与PHA处理的PBMCs共培养的培养上清的作用。我们目前的研究结果支持ctla4修饰的hBMMSCs通过维持T细胞免疫激活微环境中POSTN的分泌来增强异源hBMMSCs的迁移能力的预测。这可能是ctla4修饰的hBMMSC参与宿主MSCs招募的机制[6]。我们的结果可以被POSTN在间充质干细胞迁移中的作用所支持。有报道称，重组POSTN蛋白可促进人脂肪组织来源的间充质干细胞的迁移体外［17.]。

为了充分阐明其机制，需要解决一个重要问题:ctla4修饰的hBMMSCs分泌POSTN如何影响异源hBMMSCs的迁移能力?有报道称，POSTN通过激活MMP-2调控MMP-2的表达αvβ3整合素/ERK通路在人牙周韧带细胞中的表达[18.]。此外，POSTN产生由人类牙周膜细胞通过促进人MSC的迁移αvβ3整合素/FAK/PI3K/Akt通路[19.]。整合素αvβ3是整合素家族的一员，是整合素亚基α V (CD51)和整合素亚基β 3 (CD61)的复合物[20.]。POSTN是一种ECM蛋白，在细胞通讯中起重要作用[9，12.]。基于这些报道，我们预测ctla4修饰的hBMMSCs分泌的POSTN可以激活整合素αvβ3 .异源hbmmscs的FAK/ERK信号通路，导致异源hbmmscs迁移能力增强。我们发现整合素αvβ3 / FAK / ERK信号传导途径在同种异体hBMMSCs通过在T细胞免疫激活的微环境中培养CTLA4-和POSTN改性hBMMSCs的培养上清液激活，和抗整联αvβ3的IgG阻断CTLA4-和培养物上清液的效果POSTN改性对T细胞的免疫活化的微环境同种异体hBMMSCs的迁移能力培养hBMMSCs。因此我们目前的结果支持上述预测。

5。结论

hctla4基因修饰的hBMMSCs维持POSTN分泌，通过POSTN/integrin增强异体hBMMSCs的迁移能力αvβ3 / FAK / ERK信号传导途径。基于这个结论，我们推测，接种TEB CTLA4改性hBMMSCs可以招募主机hBMMSCs骨缺损的位置在活的有机体内．由于宿主hBMMSCs可以逃避移植排斥反应，因此在TEB中通过ctla4修饰的hBMMSCs招募宿主hBMMSCs可以促进骨缺损的修复。这些结果进一步支持了ctla4修饰的hBMMSCs作为TEB种子细胞的应用。然而，在临床环境和动物模型中，TEB和种子细胞诱导的免疫反应是复杂的，不仅仅是T细胞免疫激活。因此，hctla4基因修饰的hBMMSCs在临床环境和动物模型中是否具有类似的功能是一个问题。在进一步的研究中，我们将在整个免疫激活环境中验证我们目前的结果体外和动物模型。

缩写

TEB：	组织工程骨
hBMMSCs：	人骨髓间充质干细胞
CTLA4:	细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4
POSTN:	Periostin
ECM：	细胞外基质
shPOSTN:	shRNA-targeting POSTN
PBMCs:	外周血单个核细胞
PHA:	植物凝集素
2:	白细胞介素-2
干扰素-γ：	干扰素-γ．

数据可用性

目前的研究过程中产生的和/或分析数据集可从上合理请求相应的作者。

伦理批准

这项研究是经第一附属医院的军医大学的研究伦理委员会。参与这项研究的所有参与者收到关于这项研究的目的口头和书面的信息，并提供了书面知情同意书。

的利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

LS和FZ设计并策划了本次研究。RZ、JX和LH分析了数据。RZ是手稿的主要贡献者。FD设计了研究，并对手稿进行了修改。所有作者阅读并批准了最终的手稿。宋雷、张飞对这一工作做出了同样的贡献。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no。81601627也没有。81874005)。

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版权

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