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SCI.据/journal-id>

干细胞国际据/journal-title>

1687 - 9678据/issn> 1687 - 966 x据/issn>

Hindawi据/publisher-name>

10.1155 /三百六十○万八千二百八十四分之二千○二十零据/article-id> 3608284据/article-id>

研究文章据/subject>

HCTLA4-基因改性人骨骨髓衍生的间充质干细胞（HBMMSCs）维持Postn分泌，以增强通过整合素的同种异体HBMMSCs的迁移能力据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3 / FAK / ERK信号通路据/article-title>

https://orcid.org/0000-0002-0162-0282.据/contrib-id> 歌曲据/surname> 林雷据/given-names> ^1据/sup>

https://orcid.org/0000-0002-1957-0543.据/contrib-id> 张据/surname> 范据/given-names> ^2据/sup>

https://orcid.org/0000-0002-2861-7964据/contrib-id> 周据/surname> 鲁伊据/given-names> ^1据/sup>

肖据/surname> 君据/given-names> ^1据/sup>

https://orcid.org/0000-0003-3775-4124据/contrib-id> 他据/surname> 林雷据/given-names> ^1据/sup>

https://orcid.org/0000-0002-7651-8549据/contrib-id> 戴据/surname> 范据/given-names> ^1据/sup>

汉娜据/surname> 雅各布·H。据/given-names>

^{1据/sup>

骨科部门据/addr-line>

第一个附属医院据/addr-line>

陆军医科大学据/addr-line>

重庆400038据/addr-line>

中国据/country>

tmmu.edu.cn据/ext-link>} ^{2据/sup>

创伤骨科据/addr-line>

新疆军区总医院据/addr-line>

乌鲁木齐830000据/addr-line>

中国据/country>}

2020.据/year>

24.据/day> 3.据/month> 2020.据/year>

2020.据/volume> 21.据/day> 10.据/month> 2019年据/year> 25.据/day> 02.据/month> 2020.据/year> 04.据/day> 03.据/month> 2020.据/year> 24.据/day> 3.据/month> 2020.据/year>

这是在Creative Commons归因许可下分发的开放式访问文章，其允许在任何介质中不受限制地使用，分发和再现，只要正确引用了原始工作。据/license-p>

细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4-（CTLA4-）修饰的人骨髓来源的间充质干细胞（hBMMSCs）可能是有前途的种子细胞骨组织工程。但是，基本的机制尚不清楚。在本研究中，我们调查是否CTLA4-改性hBMMSCs通过保持POSTN分泌涉及同种异体hBMMSCs（同种异体hBMMSCs）的迁移。hBMMSCs从不同的组，一个名为hBMMSCs和异体hBMMSCs隔离。被感染的阴性对照（NC），清空该hBMMSCs腺病毒或腺病毒表达CTLA4，POSTN，或CTLA4加POSTN的shRNA的分别命名为NC hBMMSCs，CTLA4-改性hBMMSCs，POSTN改性hBMMSCs，或CTLA4 + shPOSTN改性hBMMSCs，分别。They were then cocultured with PBMCs in a 1 : 5 ratio with 2.5 据italic> μ.据/italic>G / ml植物植物血糖素（PHA）。收集了共培养的上清液以用抗整合蛋白治疗allo-hbmmss据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3 IgG或阴性对照IgG，作为对照。在此之后，进行ELISA，Transwell测定，伤口愈合测定和Western印迹。我们发现，CTLA4-和Postn改性HBMMSC的培养上清液中的Postn水平高于NC HBMMSCS与用PHA处理的PBMC共同化的NC HBMMSC。增强了Allo-HBMMSCS的迁移能力，整合了据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>CTLA4-和postn修饰的hBMMSCs与PHA处理的PBMCs共培养上清可激活异源hBMMSCs中的3/FAK/ERK信号通路。此外，这些诱导作用可通过POSTN敲低而减弱，抗整合素阻断了异源hbmmscs的迁移能力据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3 IgG。总之，HCTLA4-基因改性的HBMMSCs维持Postn分泌，以增强通过整合素的同种异体HBMMSS的迁移能力据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>T细胞免疫激活环境中的3 / FAK / ERK信号通路。据/p> 国家自然科学基金项目据/funding-source> 81874005据/award-id> 81601627据/award-id> 1.介绍据/title> <p>大的骨缺损，造成断裂，肿瘤切除术，和骨感染，在整形外科临床实践中非常普遍。最近，组织工程骨（TEB）迅速发展，在修复大的骨缺损得到有利的疗效[据xref ref-type="bibr" rid="B1"> 1据/xref>]．人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)是TEB中重要的种子细胞[据xref ref-type="bibr" rid="B2"> 2据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3.据/xref>]．然而，自体间充质干由患者的个体差异和它们的有限数目的限制;因此，自体的MSCs不能满足临床治疗和TEB工业化的需求。因此同种异体的MSC可以是用于骨组织工程另一个种子细胞来源，由于它们的数量不受限制。虽然同种异体MSC的免疫原性低时，它也不能完全忽视，因为它仍然能够诱导免疫排泄在异基因移植[据xref ref-type="bibr" rid="B4"> 4.据/xref>]．同种异体移植hBMMSC几乎总是导致移植排斥。因此，迫切需要克服移植排斥反应与同种异体沿着新路子。据/p> <p>免疫抑制分子细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）是CD80 / CD86的众所周知的配体，是在T细胞中表达的卷曲分子，介导T细胞功能。在我们以前的研究中，我们发现CTLA4在T细胞免疫激活模型中增强了同种异体HBMMSS的成骨分化据italic> 体外据/italic>[据xref ref-type="bibr" rid="B5"> 5.据/xref>]．此外，我们观察到CTLA4有利于同种异体接受者的HBMMSC植入和骨质发生分化[据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>]．这些结果表明，ctla4修饰的hBMMSCs可能是骨组织工程的种子细胞。然而，这一过程背后的机制尚不清楚。据/p> <p>重要的是，我们发现，大多数上脱钙骨基质细胞与CTLA4-改性hBMMSCs接种从主机本身，推导出在两个，四个，八个，并移植12周以后[据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>]．因此，我们预测ctla4修饰的hBMMSCs可能增强宿主间充质干细胞的募集，从而促进同种异体移植骨缺损的修复。我们最近的另一项研究表明，在T细胞免疫激活条件下，CTLA4通过维持骨膜蛋白(POSTN)的表达促进异种移植中的MSC成骨[据xref ref-type="bibr" rid="B7"> 7.据/xref>]．POSTN，也被称为成骨细胞特异性因子2（OSF-2），是一种非胶原细胞外基质（ECM）蛋白由成骨细胞及其祖细胞[分泌据xref ref-type="bibr" rid="B8"> 8.据/xref>]．Postn与胶原纤维，纤维结蛋白，透明蛋白，层状粘结蛋白，骨键合蛋白和骨囊蛋白和骨囊蛋白和骨膜蛋白和骨粘接蛋白的微环境有助于微观环境。据xref ref-type="bibr" rid="B9"> 9.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B10"> 10.据/xref>]．ECM在蜂窝通信中发挥着重要作用[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12.据/xref>]．此外，有报道称，POSTN可促进牙周韧带MSCs的迁移和成骨分化潜能[据xref ref-type="bibr" rid="B13"> 13.据/xref>]．因此，我们预测，CTLA4改性hBMMSCs通过增加POSTN的分泌参与宿主MSCs的招募。据/p> <p>在本研究中，我们研究了CTLA4修饰的HBMMSCs是否参与了通过在T细胞免疫活化微环境中维持Postn分泌物来迁移同种异体HBMMSCs的迁移据italic> 体外。据/italic>此外，我们阐明了潜在的机制。据/p> </sec> <sec id="sec2"> <title>2。材料和方法据/title> <sec id="sec2.1"> <title>2．1.hbmscs的分离与鉴定据/title> <p>所有提供骨髓的志愿者被随机分为两组(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M1"> <mml:mi> N据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>；所有的男性;年龄范围:25-28岁)。获得了所有志愿者的书面知情同意。本研究经军医大学第一附属医院伦理委员会批准。hBMMSCs按照我们之前描述的方法分离[据xref ref-type="bibr" rid="B5"> 5.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>]．从两组髂嵴骨髓抽吸物分别用于分离的MSC。从组中的一个分离的间充质干分别命名hBMMSCs和感染了腺病毒表达CTLA4，POSTN，或shRNA靶向POSTN（shPOSTN）。从另一组中分离的hBMMSCs分别命名为同种异体hBMMSCs（同种异体hBMMSCs）。Isolated hBMMSCs and allo-hBMMSCs were mixed in a 1 : 1 ratio and identified using stem cell positive markers CD105, CD44, and CD90 and stem cell negative markers CD34 and CD45, by flow cytometry.据/p> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>2.2。外周血单核细胞的分离（PBMC）据/title> <p>肝素化外周血从健康人类志愿者收集。将PBMC通过从外周血Ficoll密度梯度离心分离。The isolated PBMCs were cultured in the RPMI 1640 medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco), supplemented with 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, and 2 mM glutamine.据/p> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>２.３.实验模型的建立据/title> <p>为了建立T细胞免疫激活微环境，pbmc (据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M2"> <mml:mn> 5.据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>2.5刺激细胞)据italic> μ.据/italic>克/ mL的植物凝集素（PHA）（Sigma公司，圣路易斯，MO，USA），用于多克隆T细胞刺激的试剂[据xref ref-type="bibr" rid="B14"> 14.据/xref>]．After being treated with or without PHA for 24, 48, 72, and 96 h, the culture medium was collected to detect the levels of interleukin- (IL-) 2 and interferon- (IFN-)据italic> γ.据/italic>．IL-2和IFN-的水平据italic> γ.据/italic>采用ELISA试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)测定。据/p> <p>重组腺病毒表达CTLA4，Postn或Postn的ShRNA购自Genepharma（中国上海Genepharma Co.，Shanghai，China）。用阴性对照（NC），空腺病毒或重组腺病毒表达CTLA4，PostN或CORN的ShRNA的HBMMSCs被命名为NC HBMMSCs，CTLA4修饰的HBMMSCs，Postn-Demified HBMMSCs，或CTLA4 + Shpostn改性的HBMMSCs，分别。据/p> <p>NC hBMMSCs、CTLA4修饰的hBMMSCs、postn修饰的hBMMSCs或CTLA4+ shpostn修饰的hBMMSCs (据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M3"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞用PBMC（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M4"> <mml:mn> 5.据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞）以1：5的比例为2.5 据italic> μ.据/italic>g / ml pha。在用PHA进行72小时处理后，收集培养上清液以使用ELISA试剂盒（R＆D Systems）检测Postn的水平。培养上清液以下列测定的比例为10：1的比例浓缩。据/p> <p>为了研究NC hBMMSCs，CTLA4-改性hBMMSCs，POSTN改性hBMMSCs，或CTLA4 +的效果shPOSTN改性hBMMSCs上同种异体hBMMSCs的迁移，从这些细胞中的浓缩的培养物上清液共培养用的PBMC用PHA刺激的加入到culture medium of allo-hBMMSCs at a ratio of 1 : 10, and allo-hBMMSCs were named as NC, CTLA4, POSTN, and CTLA4+shPOSTN, respectively.据/p> <p>研究CTLA4或POSTN是否通过整合素影响异源hbmmscs的迁移据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3,2 据italic> μ.据/italic>克/ mL的阴性对照IgG或抗整联据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3的IgG加入到异体hBMMSCs与CTLA4-改性hBMMSCs或POSTN改性hBMMSCs浓缩培养物上清液的培养基用的PBMCs共培养用PHA刺激，同种异体hBMMSCs分别命名为CTLA4 + IgG抗体，CTLA4 +抗整据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3，POSTN + IgG和POSTN +抗整据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3。据/p> </sec> <sec id="sec2.4"> <title>２.４.Transwell迁移分析据/title> <p>完全，将10,000个Allo-HBMMSC添加到Transwell室的上部（24孔，8.0 据italic> μ.据/italic>m）。培养基（600 据italic> μ.据/italic>含20％L）FBS加入到下室。After culturing in different conditions for 24 h, the upper-surface allo-hBMMSCs were wiped off with cotton balls, and the allo-hBMMSCs that migrated to the reverse side of the Transwell membrane were washed with PBS, fixed with 5% glutaraldehyde at 4°C, and stained with crystal violet (0.5%) stain solution for 5-10 min. After washing with PBS twice, five fields were randomly observed under the microscope to count the number of migrated allo-hBMMSCs per field.据/p> </sec> <sec id="sec2.5"> <title>2.5。伤口愈合测定据/title> <p>绘制在6孔板的底部五条直线后，据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M5"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 6.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/异源hbmmscs被播种。次日，沿5条直线用无菌200据italic> μ.据/italic>L吸管小费。用PBS冲洗异源hbmmscs三次，去除分离的细胞。随后，2.5 mL无血清培养基中含有10%的MSCs、MSCs- ctla4、MSCs- postn或MSCs- ctla4 - shpostn组的浓缩培养上清，或ctla4修饰的hBMMSCs或postn修饰的hBMMSCs的浓缩培养上清据italic> μ.据/italic>g / ml阴性对照IgG或整合素据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3，加入细胞并在37°C、5% CO的湿化气氛中培养据sub>2据/sub>．48 h时，用相位反差显微镜(Motic Microscopy, Xiamen, China)监测创面宽度并拍照。伤口愈合百分率计算公式如下据disp-formula> <mml:math display="block" xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M6"> <mml:mtable> <mml:mlabeledtr id="eq1"> <mml:mtd> <mml:mtext> （1）据/mml:mtext> </mml:mtd> <mml:mtd> <mml:mtext> 百分比据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 的据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 伤口据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 关闭据/mml:mtext> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mfrac> <mml:mrow> <mml:mtext> 伤口据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 宽度据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 在据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mn> 0.据/mml:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> H据/mml:mtext> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mtext> 伤口据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 宽度据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 在据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mn> 48据/mml:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> H据/mml:mtext> </mml:mrow> </mml:mfrac> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:mn> 100.据/mml:mn> <mml:mi> ％据/mml:mi> <mml:mo> ．据/mml:mo> </mml:mtd> </mml:mlabeledtr> </mml:mtable> </mml:math> </disp-formula></p> </sec> <sec id="sec2.6"> <title>2.6。Western Blot.据/title> <p>完全，据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M7"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 6.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>每孔异源hbmmscs播种在6孔板中，在不同条件下培养。培养24 h后，收集细胞进行western blot检测MMP2、MMP9、integrin的表达水平据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3，FAK，P-FAK，ERK1 / 2，P-ERK1 / 2，AKT1 / 2和P-AKT1 / 2。如前所述进行蛋白质印迹[据xref ref-type="bibr" rid="B5"> 5.据/xref>]．据/p> </sec> <sec id="sec2.7"> <title>2.7。统计分析据/title> <p>三个独立实验的结果显示为据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M8"> <mml:mtext> 意味着据/mml:mtext> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mtext> 标准据/mml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 偏差据/mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>．使用SPSS 19.0 (IBM, Chicago, IL, USA)软件进行统计分析。采用单因素方差分析和事后LSD检验进行统计分析。的值据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M9"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>被认为是统计显著。据/p> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>结果据/title> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。细胞模型构建成功据/title> <p>对于hBMMSCs，干细胞标志物阳性CD44，CD105，和CD90的细胞的比例分别为99.27％，98.12％，和99.91％，和干细胞阴性标记CD34和CD45的细胞的比例分别为7.63％和1.99％，（数字据xref rid="fig1" ref-type="fig"> 1据/xref>）.对于同种异体hBMMSCs，干细胞标志物阳性CD44，CD105，和CD90的细胞的比例分别为99.22％，99.42％，和99.33％，而那些干细胞阴性标记CD34和CD45的分别为2.68％和4.53％，（图据xref rid="fig1" ref-type="fig"> 1据/xref>）.这些结果表明hBMMSCs和异源hBMMSCs被成功分离。据/p> <fig id="fig1"> <label>图1据/label> <p>成功孤立HBMMSCs和Allo-HBMMSS。通过流式细胞术分析鉴定了干细胞阳性标记物（CD44，CD105和CD90）和干细胞阴性标记物（CD34和CD45）的细胞比例。据/p> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.001"></graphic> </fig> <p>如图所示据xref rid="fig2" ref-type="fig"> 2据/xref>，CTLA4在CTLA4修饰的HBMMSCS和CTLA4 + SHPOSTN改性的HBMMSCs中成功过表达，PTLA4改性的HBMMSCS和Postn-Modified HBMMSCs中成功过表达。CTLA4 + Shpostn改性的HBMMSC中的Postn水平小于CTLA4修饰的HBMMSCs中，与NC HBMMSC相比没有明显的变化，表明SHPOSTN成功沉默CTLA4诱导的Postn Upregulation。据/p> <fig-group id="fig2"> <label>图2据/label> <p>在NC hBMMSCs，CTLA4-改性hBMMSCs，POSTN改性hBMMSCs，或CTLA4 + CTLA4和POSTN水平shPOSTN改性hBMMSCs。（一）免疫印迹的代表性图。相对蛋白质表达（b）的统计结果基于三个独立的实验。据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M10"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> *据/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，与NC HBMMSCS相比;据sup>＃据/sup> <inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M11"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，与Postn-Modified HBMMSC相比。据/p> <fig id="fig2a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.002a"></graphic> </fig> <fig id="fig2b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.002b"></graphic> </fig> </fig-group> <p>如图所示据xref rid="fig3" ref-type="fig"> 3.据/xref>，IL-2和IFN的水平据italic> γ.据/italic>在用PHA治疗24,48,72和96小时和IL-2和IFN-后，PBMC的培养上清液增加。据italic> γ.据/italic>在72小时达到峰值。因此，以PHA处理pbmc 72 h为适宜时间代表T细胞免疫激活微环境。据/p> <fig id="fig3"> <label>图3据/label> <p>IL-2和IFN-的水平据italic> γ.据/italic>在用PHA处理的PBMC培养上清液中。在用24,48,72和96h，IL-2和IFN的治疗后处理或不含PHA后据italic> γ.据/italic>采用ELISA法检测。采用从三种独立细胞处理中分离的培养上清进行ELISA。据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M12"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> *据/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>．据/p> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.003"></graphic> </fig> <p>如图所示据xref rid="fig4" ref-type="fig"> 4.据/xref>中，POSTN水平在CTLA4-和培养上清更高POSTN改性hBMMSCs比在数控hBMMSC共培养用PHA处理的PBMC。此外，CTLA4 + Shpostn改性的HBMMS培养上清液中的Postn水平低于CTLA4改性HBMMSCs的培养上清液中的Postn水平，与NC HBMMSCs的培养上清液相比没有明显的变化，表明ShPostn成功抑制分泌由CTLA4维持的PTLA4改性HBMMSCs与用PHA处理的PBMC共同化。据/p> <fig id="fig4"> <label>图4据/label> <p>POCULLULL上清液中的POSTN水平。NC HBMMSCs，CTLA4修饰的HBMMSCs，Postn改性的HBMMSCs或CTLA4 + Shpostn改性的HBMMSCs与用PHA处理72小时处理的PBMC，分离番茄菌以通过ELISA检测PERTN水平。使用从三个独立细胞处理中分离的共培养上清液进行ELISA。据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M13"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> *据/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>相比，NC组时;据sup>＃据/sup> <inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M14"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，与Postn组相比。据/p> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.004"></graphic> </fig> <p>以上结果表明，在T细胞免疫激活微环境中，CTLA4-或POSTN修饰的hBMMSCs培养上清中过表达POSTN，这些细胞模型适用于研究ctla4修饰的hBMMSCs是否通过促进T细胞免疫激活微环境中的POSTN分泌而参与异基因hBMMSCs的迁移据italic> 体外据/italic>．据/p> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。异基因hBMMSCs的迁移功能是通过CTLA4-和POSTN修饰hBMMSCs共培养的培养上清增强与PHA处理的PBMC据/title> <p>Transwell实验结果显示，CTLA4和POSTN组迁移的alloc - hbmmscs数量多于NC组，CTLA4+shPOSTN组迁移的alloc - hbmmscs数量少于CTLA4组(图)据xref rid="fig5a" ref-type="fig"> 5（a）据/xref>）.CTLA4和Postn组伤口闭合的植物百分比高于NC组中，CTLA4 + SHPOSTN组的Allo-HBMMSCs的伤口闭合百分比低于CTLA4组（图据xref rid="fig5b" ref-type="fig"> 5（b）据/xref>）.此外，CTLA4和Postn基团中Allo-HBMMSCs中的MMP2和MMP9表达水平高于NC基团中的MMP2，CTLA4 + SHPOSTN组的ALLO-HBMMSCs中的MMP2和MMP9表达水平低于CTLA4组（数字据xref rid="fig5c" ref-type="fig"> 5（c）据/xref>）.据/p> <fig-group id="fig5"> <label>图5据/label> <p>同种异体hBMMSCs的迁移能力，通过用用PHA处理的PBMC共培养CTLA4-和POSTN改性hBMMSCs的培养上清液增强。The concentrated culture supernatant from NC hBMMSCs, CTLA4-modified hBMMSCs, POSTN-modified hBMMSCs, or CTLA4+shPOSTN-modified hBMMSCs cocultured with PBMCs treated with PHA was added into the culture medium of allo-hBMMSCs in a ratio of 1 : 10, and the treated allo-hBMMSCs were named as NC, CTLA4, POSTN, and CTLA4+shPOSTN, according to their treatment. The migration capability of allo-hBMMSCs in each group was evaluated by Transwell assay (a), wound healing assay (b), and western blot to detect MMP2 and MMP9 levels (c). For all panels, left is the representative graphs and right is the statistical results based on three independent experiments.据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M15"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> *据/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，与NC组相比;据sup>＃据/sup> <inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M16"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，与Postn组相比。据/p> <fig id="fig5a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.005a"></graphic> </fig> <fig id="fig5b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.005b"></graphic> </fig> <fig id="fig5c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.005c"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.3"> <title>3.3。Integrin <italic>α</斜体> v <斜斜体>β</斜体> 3 / fak / Erk信号通路在Allo-HbmMSCs中激活CTLA4-和Postn-Modified HBMMSCs的培养上清液，通过用PHA处理的PBMCs与PBMC进行了分类据/title> <p>整合素据italic> α.据/italic>v /据italic> β据/italic>3，P-FAK，P-ERK1 / 2，并且在CTLA4和POSTN基同种异体hBMMSCs P-AKT1 / 2的表达水平高于NC组更高，而总FAK，ERK1 / 2，和AKT1/ 2的表达水平没有表现出相当大的变化（图据xref rid="fig6" ref-type="fig"> 6.据/xref>）.另外，整合蛋白据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3、CTLA4+shPOSTN组的异源hbmmscs中p-FAK、p-ERK1/2和p-AKT1/2的表达水平低于CTLA4组，而总FAK、ERK1/2和AKT1/2的表达水平没有明显变化(图)据xref rid="fig6" ref-type="fig"> 6.据/xref>）.这些结果表明整合蛋白据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3 / FAK / ERK信号通路由CTLA4-和后修饰的HBMMSC的培养上清液激活，所述HBMMSC与用PHA处理的PBMC可与PBMC一起进行，并且CTLA4诱导的激活可以通过SHPOSTN抑制。据/p> <fig-group id="fig6"> <label>图6据/label> <p>整合素的据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>CTLA4-和postn修饰的hBMMSCs与PHA处理的PBMCs共培养上清可激活异源hBMMSCs中的3/FAK/ERK信号通路。从数控hBMMSCs集中文化上层清液,CTLA4-modified hBMMSCs, POSTN-modified hBMMSCs,或CTLA4 + shPOSTN-modified hBMMSCs cocultured与PBMCs对待PHA的培养基添加到allo-hBMMSCs的比率1:10,和对待allo-hBMMSCs名叫数控,CTLA4, POSTN, CTLA4 + shPOSTN,根据他们的待遇。整合素中关键因子的蛋白水平据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>western blotting检测3/FAK/ERK信号通路。(a) western blotting的代表性图;(b)三次独立实验的相关蛋白表达的统计结果。据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M17"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> *据/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>相比，NC组时;据sup>＃据/sup> <inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M18"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，与Postn组相比。据/p> <fig id="fig6a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.006a"></graphic> </fig> <fig id="fig6b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.006b"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.4"> <title>3.4。抗整联<斜体>α</斜体> v <斜体>β</斜体> 3阻止CTLA4-和POSTN改性hBMMSCs共培养的培养上清中的作用与用PHA处理的PBMC据/title> <p>整合素据italic> α.据/italic>v /据italic> β据/italic>3，在CTLA4+抗整合素中，异源hbmmscs中p-FAK、p-ERK1/2和p-AKT1/2的表达水平据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>图3和POSTN +抗整据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3组均高于所述CTLA4 + IgG和POSTN + IgG的组低，而总FAK，ERK1 / 2，和AKT1 / 2的表达水平没有表现出相当大的变化（图据xref rid="fig7" ref-type="fig"> 7.据/xref>）.这些结果表明抗整合素据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>图3阻断了CTLA4-和POSTN改性HBMMSCs的培养上清液的效果与用PHA处理的PBMC与PBMC一起获得。据/p> <fig-group id="fig7"> <label>图7据/label> <p>整合素据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3 / FAK / ERK信号通路被抗整合素阻塞据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3治疗。大约2 据italic> μ.据/italic>克/ mL的阴性对照IgG或抗整联据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>用来自CTLA4改性的HBMMSCs的浓缩培养上清液中加入到Allo-HBMMSCs的培养基中，或者通过用PHA处理的PBMC与PBMC一起获得的浓缩培养上清液，并将处理的Allo-HBMMSS命名为CTLA4 + IgG，CTLA4 +反整合素据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3，POSTN + IgG或POSTN +抗整据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>的关键因素在整合3.蛋白质水平据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>western blotting检测3/FAK/ERK信号通路。(a) western blotting的代表性图;(b)三次独立实验的相关蛋白表达的统计结果。据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M19"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> *据/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>中，当相比于IgG的组。据/p> <fig id="fig7a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.007a"></graphic> </fig> <fig id="fig7b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.007b"></graphic> </fig> </fig-group> <p>Transwell实验结果显示，在CTLA4+抗整合素中迁移的异源hbmmscs的数量据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3，POSTN +抗整据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3组均低于在CTLA4 + IgG和POSTN + IgG的组（图据xref rid="fig8a" ref-type="fig"> 8(一个)据/xref>）.CTLA4 +抗整合蛋白的Allo-HBMMSCs的伤口闭合百分比据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>图3和POSTN +抗整据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3组低于CTLA4 + IgG和Postn + IgG组的组（图据xref rid="fig8b" ref-type="fig"> 8 (b)据/xref>）.此外，CTLA4 +抗整合素中的Allo-HBMMSS中的MMP2和MMP9表达水平据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>图3和POSTN +抗整据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3组低于CTLA4 + IgG和Postn + IgG组中的组（图据xref rid="fig8c" ref-type="fig"> 8 (c)据/xref>）.据/p> <fig-group id="fig8"> <label>图8据/label> <p>每个组中的同种异体hBMMSCs的迁移能力是由抗整抑制据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3治疗。大约2 据italic> μ.据/italic>克/ mL的阴性对照IgG或抗整联据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>用CTLA4改性的HBMMSCS或PSTN改性的HBMMSCS或与用PHA处理的PBMC共培养的PBMC共同培养的血液改性的HBMMSCs和Allo-HBMMSCs的培养基中加入培养基中，并将处理的Allo-HBMMSC为CTLA4 + IgG，CTLA4 +抗整合蛋白据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3，POSTN + IgG或POSTN +抗整据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3.通过Transwell实验(a)、创面愈合实验(b)和western blotting检测MMP2和MMP9水平(c)来评估各组异体hbmmscs的迁移能力。所有图中，左边是具有代表性的图像或印迹，右边是基于三个独立实验的统计结果。据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M20"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> *据/mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.05据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>中，当相比于IgG的组。据/p> <fig id="fig8a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.008a"></graphic> </fig> <fig id="fig8b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.008b"></graphic> </fig> <fig id="fig8c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/3608284.fig.008c"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4。讨论据/title> <p>HBMMSCS是TEB中的重要种子细胞[据xref ref-type="bibr" rid="B2"> 2据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3.据/xref>]．除了自生HBMMSCs旁，Allo-HBMMSCs还是TEB中的一个关键种子细胞来源，因为它们无限数量。然而，通过同种异体HBMMSC移植诱导的移植抑制限制其在临床中的应用。我们以前的研究表明，CTLA4改性的HBMMSCs可以保持T细胞免疫激活微环境中的骨质发生分化据italic> 在活的有机体内据/italic>[据xref ref-type="bibr" rid="B5"> 5.据/xref>，提示ctla4修饰的hBMMSCs可能是TEB的一个很有前景的来源。因此，进一步评估其作为TEB中ctla4修饰的hBMMSCs种子细胞来源的潜力，以克服移植排斥是至关重要的。我们的研究表明，ctla4修饰的hBMMSCs可能以某种方式增强宿主MSCs的招募[据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>]．因此，我们预测CTLA4修饰的HBMMSCs涉及同种异体HBMMSCs的迁移。除了测试这个假设外，我们还讨论了潜在的机制。据/p> <p>为了研究CTLA4改性HBMMSCS对T细胞免疫活化微环境中Allo-HBMMSCs的迁移能力的影响，CTLA4改性的HBMMSC与用PHA处理的PBMC共同化，以模拟免疫激活微环境，并将共培培养介质收集到治疗Allo-HBMMSCS。我们的研究结果表明，CTLA4和Postn组中迁移的Allo-HBMMSCs的数量大于NC组中，CTLA4和Postn组中的Allo-HBMMSCs的伤口闭合百分比高于NC组．此外，CTLA4和Postn组中的Allo-HBMMSCs中的MMP2和MMP9表达水平高于NC组中的MMP2和MMP9表达水平。MMP2和MMP9是促进细胞迁移的重要蛋白[据xref ref-type="bibr" rid="B15"> 15.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B16"> 16.据/xref>]．综上所述，我们的结果表明，ctla4修饰的hBMMSCs培养上清液可以增强异源hBMMSCs在T细胞免疫激活微环境中的迁移能力。这和我们以前的一致据italic> 在活的有机体内据/italic>其中用CTLA4改性的HBMMSC播种的衰减骨基质的大多数细胞均以移植后的两周，四个，八个和12周衍生自宿主本身[据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>]．据/p> <p>我们发现Postn改性HBMMSCs和CTLA4改性HBMMSCs的培养上清液对T细胞免疫激活微环境中Allo-HBMMSCs的迁移能力类似的影响。此外，迁移的Allo-HBMMSCs的数量，Allo-HBMMSCs的伤口闭合百分比，CTLA4 + Shpostn组的Allo-HBMMSCs中的MMP2和MMP9表达水平低于CTLA4组，表明Postn敲低通过用PHA处理的PBMC，通过PBMC削弱CTLA4改性的HBMMSCs的培养上清液诱导的效果。我们的目前的结果支持预测CTLA4改性的HBMMSCs通过维持T细胞免疫活化微环境中Postn的分泌来增强Allo-HBMMSCs的迁移能力。这可能是CTLA4改性的HBMMSC依据的机制参与宿主MSCs的招募[据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>]．我们的结果可以通过Postn在MSCS中迁移的作用来支持。据报道，重组Postn蛋白刺激人类脂肪组织衍生的MSC的迁移据italic> 体外据/italic>[据xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17.据/xref>]．据/p> <p>为了充分阐明机制，应该解决一个重要问题：CTLA4修饰的HBMMSCS的Postn分泌如何影响Allo-HBMMSCS的迁移能力？据报道，Postn通过激活来调节MMP-2表达据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3整/ ERK途径在人牙周膜细胞中的表达[据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>]．此外，由人牙周韧带成纤维细胞产生的PARTN促进人体MSC的迁移据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3整合蛋白/ FAK / PI3K / AKT路径[据xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19.据/xref>]．整合素据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3，整合素家族的成员，是整联蛋白亚基αv（CD51）和整合蛋白亚基β3（CD61）的复合物[据xref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.据/xref>]．POSTN是一种ECM蛋白，在细胞通讯中起重要作用[据xref ref-type="bibr" rid="B9"> 9.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12.据/xref>]．基于这些报告，我们预测CTLA4修改的HBMMSCs分泌的Postn可以激活整数据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3 .异源hbmmscs的FAK/ERK信号通路，导致异源hbmmscs迁移能力增强。我们发现整合素据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>通过在T细胞免疫激活微环境中培养的CTLA4-和Postn-Modified HBMMSCS的培养上清液激活Allo-HBMMSCs中的3 / FAK / ERK信号通路，并抗整合蛋白据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3 IgG阻断了CTLA4-和postn修饰的hBMMSCs培养上清液对异源hBMMSCs在T细胞免疫激活微环境中的迁移能力的影响。因此，我们目前的结果支持上述预测。据/p> </sec> <sec id="sec5"> <title>5。结论据/title> <p>HCTLA4-Gene改性的HBMMSCs维持Postn分泌，以通过Postn /整合蛋白增强同种异体HBMMSCS的迁移能力据italic> α.据/italic>V.据italic> β据/italic>3 / FAK / ERK信号通路。基于这一结论，我们假设ctla4修饰的hBMMSCs在TEB中可以募集宿主hBMMSCs到骨缺损部位据italic> 在活的有机体内据/italic>．因为主机hBMMSCs可以从移植排斥逸出，通过在TEB CTLA4-改性hBMMSCs招募主机hBMMSCs能促进骨缺损的修复。这些结果进一步支持在未来TEB使用CTLA4-改性hBMMSCs的作为种子细胞。然而，通过TEB和种子细胞诱导的免疫应答是在临床环境中和动物模型中，不仅T细胞免疫激活复合物。因此，有一个问题与hCTLA4基因修饰hBMMSCs是否有在临床和动物模型类似的功能。在进一步的研究中，我们将验证在整个免疫激活环境我们目前的结果据italic> 体外据/italic>和动物模型。据/p> </sec> <back> <glossary> <title>缩写据/title> <def-list> <def-item> <term> TEB：据/term> <def> <p>组织工程骨骼据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> HBMMSCS：据/term> <def> <p>人骨髓间充质干细胞据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> CTLA4：据/term> <def> <p>细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> POSTN:据/term> <def> <p>Periostin据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> ECM:据/term> <def> <p>细胞外基质据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> Shpostn：据/term> <def> <p>shrna-posting postn据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> PBMCs:据/term> <def> <p>外周血单核细胞据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> PHA：据/term> <def> <p>Phytohemagglutinin.据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> 2:据/term> <def> <p>白细胞介素-2据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> 干扰素-据italic> γ.据/italic>：据/term> <def> <p>干扰素 -据italic> γ.据/italic>．据/p> </def> </def-item> </def-list> </glossary> <sec sec-type="data-availability"> <title>数据可用性据/title> <p>在当前研究期间生成和/或分析的数据集可从合理请求的相应作者获得。据/p> </sec> <sec> <title>伦理批准据/title> <p>该研究经受军医大学第一次附属医院研究伦理委员会的批准。参与本研究的所有参与者都获得了关于该研究目标的口头和书面信息，并提供了书面知情同意书。据/p> </sec> <sec sec-type="COI-statement"> <title>利益冲突据/title> <p>两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。据/p> </sec> <sec> <title>作者的贡献据/title> <p>LS和FZ设计并计划了这项研究。RZ，JX和LH分析了数据。RZ是写作稿件的主要贡献者。FD设计了研究并修改了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。雷松和飞张同等为这项工作贡献。据/p> </sec> <ack> <title>致谢据/title> <p>这项研究是由来自中国国家自然科学基金（编号81601627号81874005和）资助。据/p> </ack> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1据/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> orciani.据/surname> <given-names> m据/given-names> </name> <name> <surname> 芬尼据/surname> <given-names> m据/given-names> </name> <name> <surname> Di Primio据/surname> <given-names> R.据/given-names> </name> <name> <surname> Mattioli-Belmonte据/surname> <given-names> m据/given-names> </name> </person-group> <article-title> 生物制造和骨组织再生：细胞来源，途径和挑战据/article-title> <source> <italic> 生物工程和生物技术的边疆据/italic> <year> 2017年据/year> <volume> 5.据/volume> <fpage> 17.据/fpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.3389 / FBIOE.2017.00017据/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2-S2.0-85042209577据/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B2" content-type="article"> <label>2据/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 道森据/surname> <given-names> J.I.据/given-names> </name> <name> <surname> kanczler.据/surname> <given-names> J.据/given-names> </name> <name> <surname> t据/surname> <given-names> R.据/given-names> </name> <name> <surname> 卡西姆据/surname> <given-names> m据/given-names> </name> <name> <surname> Oreffo据/surname> <given-names> r . 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