缺氧通过调节Mettl3和旁分泌因子促进脂肪来源干细胞（ADSC）的血管平滑肌细胞（VSMC）分化

抽象

脂肪来源干细胞(ADSC)是一种可用于组织再生生物治疗策略的间充质干细胞的替代来源，侵袭性较小，其治疗应用取决于对其生理特性的了解。n6 -甲基ladenosine (m6A)是mrna最常见的化学修饰，最近被发现在细胞分化和发育中发挥重要作用。然而，m6A修饰在ADSCs血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)分化中的作用尚不清楚。在此，我们研究了n6 -腺苷甲基转移酶(Mettl3)和去甲基化酶(Fto和Alkbh5)的表达，发现Mettl3在血管平滑肌分化诱导的ADSCs中表达上调。此外，沉默Mettle3降低了vsmc特异性标记物的表达水平，包括αsma, SM22α钙蛋白和SM-MHC。同时，Mettl3基因敲低也降低了旁分泌因子VEGF、HGF、TGF-的表达β、GM-CSF、bFGF和SDF-1。此外，我们的结果提示，缺氧应激促进ADSC向VMSCs分化，调节VEGF、HGF、TGF-的分泌β、GM-CSF、bFGF和SDF-1通过介导Mettl3基因表达。这些观察结果可能有助于理解表切调控在ADSCs VSMC分化中的作用，并为新的组织再生治疗策略提供了前景。

1.介绍

N6-甲基ladenosine (m6A)是rna中腺苷N6位置的甲基化修饰，是真核mrna中最丰富的修饰[1,2]。作为哺乳动物动态可逆的过程，甲基转移酶和METTL3 METTL14，二M6A“作家，”形成复合物来介导的加入甲基基团与在靶RNA腺苷[3.]，而去甲基化是由两个“擦除剂”介导的:FTO和ALKBH5 [4,5]。此外，YTH结构域家族蛋白是典型M6A“阅读器”的蛋白质，这是负责识别M6A改性转录调节M6A修饰的下游效应[6]。既往研究表明，m6A修饰对mRNA的代谢和功能，包括mRNA的稳定性起着至关重要的作用[7,8]，本地化[9]，及翻译[10,11]。越来越多的证据证实m6A甲基化影响多种生物学过程，如胚胎的增殖和分化[12,13]、应激反应[14，以及学习[15]。

间充质干细胞（MSCs）是非造血成体干细胞的异源群体，存在于组织中，例如骨髓，脂肪和肌肉[的真实性16,17]。他们有自我更新和多向分化能力的财产，并已广泛应用在干细胞移植，基因治疗，组织工程和免疫[18- - - - - -20.]。人脂肪来源干细胞(Human adipose-derived stem cells, ADSCs)是一种从脂肪组织中分离出来的间充质干细胞，具有多向分化潜能和丰富的存储能力等多种优势在活的有机体内，易于获取，和扩展[18- - - - - -20.，这表明有更广泛的干细胞来源可用于组织工程。此外，许多研究表明ADSCs具有诱导向平滑肌细胞分化的潜力[21,22]。

脂肪干细胞是具有多向分化能力的细胞，在一定条件下可以分化为平滑肌细胞。Mizuno发现ADSCs在肌生成环境中表达平滑肌细胞特异性基因[23]。连战等人。发现，干细胞分化成平滑肌细胞亚型TGF-诱导下β1 (24]。据报道，TGF-ββ通过直接与平滑肌I型受体结合并激活其下游Smad信号调节平滑肌分化[24]。Hayashi等报道TGF-β1通过磷脂酰肌醇3-激酶的信号传导途径[维持平滑肌细胞亚型分化25]。此外，骨形态发生蛋白4（BMP4）可以发起的ADSC成平滑肌细胞的分化间接依赖于TGF-β的β通路。Lagna等。报道，BMP4起着平滑肌细胞的转化中起主要作用由合成到收缩性细胞，并且只有完整的RhoA / ROCK信号可以完成这个过程，而TGF-的抑制剂β途径无法阻止此信号[26]。此外，近期研究发现LncRNA HULC通过上调BMP9促进ADSCs平滑肌样分化[21]。

然而，鲜为人知的是，M6A修饰的脂肪干细胞中的平滑肌细胞分化中的作用。低氧之间的连接影响脂肪干细胞的分化VSMC过程，M6A修饰也仍有待确定。因此，本研究的目的是探讨应对缺氧M6A甲基化对脂肪干细胞和其作用的血管平滑肌细胞分化的影响。

2.材料和方法

2.1。ADSCs的分离、培养和鉴定

从谁符合伦理委员会批准的程序进行腹部吸脂，具有25年的平均年龄患者获得新鲜人类皮下脂肪组织。The adipose tissue was washed three times with sterile phosphate-buffered saline (PBS) buffer and dispensed into a 50 ml centrifuge tube in a volume of 25 ml. Then, the tissue was digested with 0.075% collagenase type I (Gibco, Carlsbad, CA, USA) at 37°C for 60 min on a shaker and centrifuged at 1500 rpm for 10 min. The tissue cells at the bottom of the tube were then resuspended in LG-DMEM growth medium containing 10% fetal bovine serum. Undigested tissue was removed with a 200 mesh screen. The cells were seeded at a density of 在直径为100mm的细胞培养皿中，在100%湿度、5% CO的条件下培养²和37℃。24小时后，原来的培养液吸出，并PBS洗涤两次以除去血细胞和未附着的细胞。然后，更改隔日液体。〜80〜90％达到汇合时传代细胞，并在以下研究中使用的那些细胞在传代3。不同的细胞表面标记物，包括CD13 +，CD44 +，CD90 +，CD45 - ，和CD34 - ，的表达水平，通过流式细胞术确定的。脂肪干细胞向成骨细胞和成脂分化进行了以确定茜素红和油红O染色脂肪干细胞分别的多向分化。

2.2。诱导VSMC分化

将第3代脂肪源性干细胞接种于60mm培养皿中，培养至60%融合时，丢弃培养基，PBS洗涤3次。在细胞诱导前一天，加入饥饿液(1%胎牛血清在低糖DMEM培养基中)培养24小时。然后，平滑肌细胞诱导液(mg - dmem, 1%胎牛血清，5 ng/ml TGF-)β1、加入BMP4 2.5 ng/ml)，连续7天，每隔一天换液一次。每天在显微镜下观察细胞的生长和形态变化。

2.3。ADSCs的成骨和成脂分化

成骨分化, 细胞/厘米²接种于T75瓶，2天后用完全STEMPRO成骨分化培养基(Gibco)替代生长培养基。14和21天后，用油红O染色细胞以染色脂质。通过播种，ADSCs向成脂系分化 细胞/厘米²置于T75瓶中，2天后用完全脂肪形成分化培养基(Gibco)替换培养基。14和21天后，对细胞进行茜素红S染色，检测培养物中的钙沉积。

2.4。通过shRNA转染Mettl3敲除

质粒转染进行了根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）中。在此研究中使用Mettl3击倒的一篇文章中报道的方法[27]。简而言之，设计Mettl3、AGTCACAAACCAGATGAAATA的siRNA靶标序列和一个非特异性shRNA构建物，克隆到hu6 - mc -泛素- egfp - ires -puromycin载体中，转染到293FT细胞中。转染48 h后收集病毒，转导至ADSCs。细胞在嘌呤霉素溶液中孵育(1)μg/ml, Sigma) 2周，稳定克隆维持在0.5μg/m嘌呤霉素保证>90%的转染率。Western blotting检测Mettl3的沉默作用。将细胞独立分为对照组(未转染组)、shCtrl阴性对照组和shMettl组。另外，shCtrl和shMettl细胞在21%常氧和1%低氧条件下培养²条件。

2.5。免疫印迹分析

匀浆使用裂解缓冲液(50 mM Tris (pH 7.4)、150 mM NaCl、1% TritonX-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS和2 mM焦磷酸钠)。然后将蛋白质装载电泳，将转移到PVDF膜上的凝胶上的蛋白质用10%的脱脂牛奶阻断30分钟。将膜上的蛋白分别与抗mettl3(1:1000)、抗fto(1:1000)、抗alkbh5(1:1000)、抗sm22a(1:1000)、抗-孵育αα-SMA（1：1000），抗钙调蛋白（1：1000），和抗SM-MHC（1：1000），和抗GAPDH抗体（CST，MA，USA）在4℃过夜，并吸出第一抗体和rinsed with TBST for 5 minutes, then incubated with secondary antibodies for 2 h. Analysis of protein expression was carried out with bands on membranes using ECL reagent (Pierce, IL, USA). The data are from 3 independent experiments.

2.6。茜素红S染色

接种于6孔板的ADSCs在成骨培养基中诱导14天，检测矿化结节的形成，培养后用PBS冲洗细胞，4%多聚甲醛溶液固定20 min。1%茜素红S溶液室温染色10 min，洗涤5次。矿化结节在显微镜下拍照(Axiovert 40C;卡尔蔡司公司，德国耶拿)。

2.7。油红O染色

After 14 days of in vitro osteogenic induction, cells were washed twice with PBS and subsequently fixed with 4% neutral formaldehyde for 30 min at room temperature. Fixed cells were then stained with Oil Red O (Sigma-Aldrich) at room temperature. Cells were washed again in PBS and observed under a light microscope (magnification, ×200).

2.8。实时定量PCR（定量PCR）

使用TRIzol试剂（Invitrogen，卡尔斯巴德，NM，USA）提取从脂肪干细胞的总RNA，并将cDNA使用Superscript IV第一链合成系统（Invitrogen，卡尔斯巴德，NM，USA）合成并在下面的测定基因的使用表达。进行PCR，并使用的LightCycler 480监测，并且在这项研究中使用的引物列于表1。

2.9。ELISA

定量检测VEGF、HGF、TGF-β采用VEGF人ELISA试剂盒(Invitrogen)、HGF人ELISA试剂盒(Invitrogen)、TGF-进行条件培养基中GM-CSF、bFGF和SDF-1的检测βELISA试剂盒(马里兰州盖瑟斯堡)、GM-CSF ELISA试剂盒(澳大利亚新南威尔士萨里希尔斯Medical Resources Ltd.)、bFGF ELISA试剂盒(英国白金汉郡Amersham)、SDF-1Quantikine试剂盒(R&D)。

2.10。m6A检测

根据制造商的说明书使用EpiQuik M6A RNA甲基化定量试剂盒（EpiQuik，USA）细胞的N6甲基腺苷水平进行定量。简言之，总RNA被绑定到使用RNA高结合溶液的孔中。M6A使用捕获和检测抗体检测。The m6A level was then quantified by reading the 450 nm absorbance.

2.11。统计分析

所有实验都进行了三次。所有数据均以 （SD），并使用Stata的SE15.0（Stata的公司）进行分析。单因子变异数分析被用来比较的实验组。值< 0.05为有统计学意义。

3.结果

3.1。选择和脂肪干细胞的鉴定

成功分离出人脂肪源性干细胞，鉴定出ADSCs的形态，如图所示1。结果显示，CD13、CD90、CD44表达阳性，CD34、CD45表达阴性，表明ADSCs纯度高，排除了内皮细胞和造血细胞的污染(图)1(一)和图1（b）)。此外，在诱导分化培养基中培养ADSCs时，茜素红染色和油红O染色分别可以分化成成骨样细胞和脂肪样细胞(图)1 (h)和1(我))。这些数据证实了分离，培养脂肪干细胞的状态。

3.2。m6A甲基转移酶和去甲基化酶在ADSCs VSMC分化中的表达

在脂肪干细胞的分化VSMC，将细胞在诱导培养基中在指定的时间点进行培养，并在显微镜下观察细胞形态。第三至第五代表现为成纤维细胞样，在显微镜下梭形细胞脂肪干细胞。诱导后TGF-ββ1+BMP4时，细胞仍呈纺锤形，但较脂肪来源的干细胞稍短、稍平，显微镜视野呈“峰谷”样生长(图)图2（a）)。

为了揭示m6A修饰在ADSCs分化潜能中的作用，我们测定了诱导ADSCs过程中m6A甲基转移酶(Mettle3)和去甲基化酶(Fto, Alkbh5)的表达模式和表达模式。诱导7和14天后Mettl3和Alkbh5的mRNA和蛋白水平均升高(图)图2（b）)。虽然F至在后7天和14天的mRNA水平增加，与7天后诱导的蛋白水平相比，诱导后14天的蛋白水平无差异显著。因此，分化过程中Mettl3和Alkbh5的表达模式与矿化相关的标志物的一致（图2 (c))。

3.3。下调Mettl3对ADSCs VSMC分化潜能的影响

为了研究m6A在ADSCs VSMC分化过程中的作用，我们选择Mettl3进行敲除实验。应用特异性shRNAs下调Mettl3在ADSCs中的表达，通过荧光细胞比例定量测定ADSCs中慢病毒基因转移效率。转染48小时后，转染效率高达90%(图)3(一个))。与阴性对照组相比，shRNA组(#sh1)的Mettl3蛋白水平下降了约55%，表明Mettl3在ADSCs中被有效沉默(图)3 (b))。此外，沉默Mettl3对总RNA水平无显著影响(图)3 (c)），而水平M6A而Mettl3在ADSC中沉默是显著降低（图3（d）)。由此选择Mettl3-SH1用于进一步的实验。

为了研究Mettl3沉默后ADSCs的分化潜能，我们测量了几种vsmc特异性标记物的表达水平。结果表明，Mettl3敲除降低了平滑肌肌动蛋白的mRNA水平(α-SMA)，平滑肌22 alpha (SM22)α），在分化诱导7和14天后脂肪干细胞钙调蛋白，和心脏肌球蛋白重链（SM-MHC）（图图3（e）)。免疫荧光染色的结果αsma, SM22α、钙ponin和SM-MHC表现出相同的趋势。

3.4。缺氧上调Mettl3促进脂肪干细胞的分化VSMC

为了研究缺氧对脂肪干细胞的分化VSMC的效果，测定Mettl3和几个VSMC特异性标志物的表达水平。结果表明，缺氧条件促进ADSC分化成平滑肌细胞。的mRNA水平αsma, SM22α低氧诱导分化7、14天后，ADSCs的钙ponin、SM-MHC升高。缺氧诱导后Mettl3的mRNA和蛋白水平呈现同样的升高趋势(图)4(一))。此外，与Mettl3-SH1组相比，低氧胁迫能促进ADSC分化成平滑肌细胞，并在mRNA水平的αsma, SM22α低氧诱导分化7和14天后，ADSCs的钙钙蛋白和SM-MHC升高(图)图4（b）)。因此，分化过程中的Mettl3表达模式与那些VSMC特异性标志物是一致的。结果表明，缺氧通过介导Mettl3促进脂肪干细胞的分化VSMC。

3.5。缺氧对旁分泌因子表达的影响

为了探讨缺氧对旁分泌方式的影响，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了几种旁分泌因子的表达水平。结果表明，缺氧可提高血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子的表达水平β(TGF -β)、粒细胞-巨噬细胞集散刺激因子(GM-CSF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和基质细胞来源因子-1 (SDF-1)(表)2)。此外，Mettl3的敲低降低VEGF，HGF，TGF-的表达β、GM-CSF、bFGF和SDF-1。综上所述，结果表明，Mettl3可以减少几个旁分泌因子的表达，而缺氧的压力，可能颠倒这个过程中，以促进从脂肪干细胞的分化VSMC。

4.讨论

m6A是mrna中一种高频率的表切修饰，广泛存在于单细胞生物、植物和脊椎动物中[28,29]。RNA m6a甲基化修饰由核心复合物METTL3、METTL4和WTAP介导，并被FTO和ALKBH5去除。越来越多的证据证明m6A参与调控ESCs的多能性、分化和体细胞重编程。有报道称m6A甲基化调节组蛋白修饰参与胚胎神经干细胞自我更新过程[30.]。最近的研究表明造血干细胞的分化过程中M6A的不可或缺的作用[31]。此外，mettl3介导的m6A被证明可以调控精原分化和减数分裂的启动[32]。

近年来，脂肪干细胞用于重建和整形外科的应用已经非常增加。ADSC是一种重要的间充质干细胞（MSC），并能分化成脂肪细胞[33]，骨细胞[34]，和血管平滑肌细胞[35]。在组织工程中的应用，脂肪干细胞能够分化成多种表型的修复受损组织。此外，脂肪干细胞可以分泌各种蛋白质，细胞因子和生长因子刺激的迁移，增殖和受损区域的局部细胞的分化。截至目前，底层分子机制尚未阐明[36]。为探讨m6A在ADSCs VSMC分化中的作用，采用平滑肌细胞诱导液培养ADSCs建立VSMC模型。检测m6A主要甲基转移酶和去甲基化酶Mettl3、Fto和Alkbh5的表达水平。结果表明，VSMC诱导后Mettl3和Alkbh5的mRNA和蛋白水平升高，而Fto和Alkbh5的蛋白表达在VSMC分化和不分化时无显著差异。提示mettl3依赖的RNA甲基化可能参与了ADSCs的VSMC分化。

METTL3是主要为甲基甲基M6A关键[37]。Mettl3的缺失或过表达改变了总m6A甲基化水平，直接影响细胞存活、干细胞维持和谱系的确定[12,38]。拟南芥中Mettl3同源基因的缺失改变了其生长模式，降低了顶端优势度。果蝇Mettl3同源基因(Dm ime4)的敲除已被证明可以抑制卵细胞发生。Mettl3抑制导致细胞m6A水平降低，人Hela细胞凋亡[39]。为了阐明Mettl3在ADSCs VSMC分化中的作用，我们在ADSCs中沉默Mettl3，并研究敲低Mettl3对细胞分化的影响。结果表明，抑制Mettl3可降低vsmc特异性标记物的表达αsma, SM22α钙蛋白和SM-MHC。此外，我们确定Mettl3对的旁分泌因子的表达的影响。结果表明VEGF，HGF，TGF-的水平降低β沉默Mettl3基因表达后，GM-CSF、bFGF和SDF-1的表达。因此，上述数据提示Mettl3增加了ADSCs的VSMC分化，影响了旁分泌因子的表达，可能参与了细胞的迁移、增殖和分化。

越来越多的证据表明，缺氧是细胞存活，增殖和迁移有益在体外。Buizer等报道，与常氧条件相比，1%或2%的氧促进了间充质干细胞的增殖和血管生成因子的表达[40]。此外，也有人证明，缺氧促进MSC和脂肪干细胞[增殖41,42]。Yu等人进行了scratch和transwell实验，结果表明1%氧与低剂量炎症刺激可以协同增强骨髓间充质干细胞的迁移[43]。在本研究中，我们研究了缺氧对VSMC向ADSCs分化的影响以及m6A在这一过程中的作用。结果表明，缺氧促进了ADSCs向VSMCs的分化。同时，沉默Mettl3可降低缺氧对ADSCs VSMC分化的影响，提示缺氧通过介导Mettl3的表达参与了ADSCs的分化过程。此外，缺氧应激使VEGF、HGF、TGF-等旁分泌因子表达升高β，GM-CSF，bFGF和SDF-1，这将最终参加VEGF，HGF，TGF-β、GM-CSF、bFGF和SDF-1。进一步阐明ADSCs分化过程的分子机制有待进一步研究。

五，结论

综上所述，本研究估计了m6A甲基转移酶和去甲基化酶在ADSCs VSMC分化过程中的表达模式，证明了Mettl3在VSMC分化过程中是高表达的。研究Mettl3对细胞分化的调控作用，发现Mettl3缺失抑制了ADSCs的VSMC分化潜能。此外，缺氧胁迫加速了ADSC向VSMCs的分化，这可能与Mettl3和旁分泌因子表达上调有关。这些发现可能推动了关于表切转录组在VSMC分化中的作用的新进展，并为血管网络再生的创新治疗策略的开发提供了一个很有前景的前景。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在本文中。

的利益冲突

作者否认任何利益冲突。

致谢

我们承认由中国国家自然科学基金（81801526）和中国国家重点研究发展计划（2018YFC100300）的财政支持。

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