耦合的CRC阿里2 d和3 d的文化表达受体的新兴病毒和更适合于病毒感染的研究相比,传统的细胞系

文摘

新兴和重现病毒感染(冠,流感H1N1等)在很大程度上和全球影响人类健康。动物模型往往不能反映物种的生理状态,因为病毒感染的取向。传统的细胞系通常从初级细胞遗传和表型不同。开发一个在体外生理模型来研究新兴的感染病毒将促进我们对宿主细胞相互作用的理解,从而抗病毒药物发现中受益。在当前的工作中,我们首先建立正常的气道上皮细胞上呼吸道和下呼吸道(跟踪)在2 d和3 d的文化系统使用条件改变(CR)以及气液界面(ALI)技术。这些长期的文化保持分化潜能。更重要的是,这些细胞表达两种类型的流感病毒受体,α2-6-Gal - - -α2-3-Gal-linked唾液酸,血管紧张素转换酶2 (ACE2)受体冠。这些细胞被宽容感染大流行性流感H1N1 (H1N1pdm)。相比之下,肺癌细胞株A549和永生的气道上皮细胞(16 hbe)并不容易感染H1N1。细胞病理效应(CPE) 2 d CRC文化发达时间的方式。病理,传播效果也容易观察到顶端一层一层的基底的3 d阿里文化。这种集成的2 d CRC和3 d阿里文化提供生理和个性化在体外模型来研究新兴的感染病毒。这部小说模型可以用于研究病毒生物学和宿主反应病毒感染,抗病毒药物发现。

1。介绍

几个主要的新兴病毒引起的急性病毒性肺炎暴发本世纪以来极大地威胁公众健康。2009年3月,出现一种新型流感病毒在墨西哥和美国。这种病毒被发现重组流感H1N1源于多个species-derived病毒。H1N1pdm获得能力传播在人类和迅速蔓延到超过214个国家(1]。此后,H1N1病毒(甲型流感,H1N1pdm)成为全世界季节性病毒循环(2]。2003年2月,爆发的严重急性呼吸系统综合症(SARS)首次报道在中国的广东省。病原体被确认为SARS冠状病毒(冠)3]。冠是一种包膜RNA病毒和感染8096例并造成全球774人死亡。SARS-CoV2, 2019年12月,一种新的冠状病毒引起的急性肺炎的爆发在中国武汉市4]。2020年3月11日,世界卫生组织(WHO)宣布SARS-CoV2感染暴发(COVID-19)可以作为一个流行特点。这些新兴病毒开始感染呼吸道上皮细胞,主要通过呼吸道传播1,5]。阐明病毒取向的主要靶细胞可能帮助我们理解病毒宿主范围,发病机理和传播。

动物,如老鼠、猪、鹌鹑、雪貂、鸡和鸭子一直作为流感病毒研究模型2,6- - - - - -12]。已经采取了只雪貂和豚鼠作为人类流感感染的相关代理(5,11]。一些动物模型研究冠状包括非洲绿猴,猕猴,和老鼠13,14]。然而,动物模型并不总是反映了人类生物学。组织趋向性的病毒与病毒受体表达的靶细胞(15]。人类流感病毒优先结合α2-6-Gal-linked唾液酸,而禽流感病毒使用α2-3-Gal-linked唾液酸受体(5,16]。

人类呼吸道上皮是这些新兴的主要靶细胞病毒带给我们天真的模型。人类呼吸tract-related模型包括人类肺外植体,主气道上皮细胞和不灭的气道上皮细胞系或癌症细胞系。人类的肺移植组织并不容易获得并迅速恶化在体外。癌症细胞系(例如,A549)或oncogene-immortalized细胞(例如,SV40大t抗原永生化人支气管上皮细胞(16 hbe))可以维持他们的增长在体外。然而,这些细胞系的遗传背景和表型已经改变了。他们再也不能代表人类呼吸道上皮细胞生理功能,例如,正常分化潜能(17]。这是一个主要障碍为研究病毒-宿主细胞相互作用,从而限制抗病毒药物发现。

人类主要的气道上皮细胞应该是解决方案。然而,文化的主要细胞几十年来一直非常具有挑战性。这些主要可以培养的上皮细胞在体外有限的几个段落(18]。最近,两个研究小组使用人工气道瀑样评估传染性的流感病毒(19,20.]。然而,难接近顶端表面的病毒和不方便建立3 d瀑样大大限制了其应用。因此,生理相关的、可再生的和方便的模型在很大程度上仍需要研究取向,发病机理,新兴的传播病毒。在精密医学方面,有一个未满足的需求个性化的宿主细胞研究疾病和主机单独应对病毒感染。

最近,一项新技术被称为“有条件重新编程”(CR)允许人类上皮细胞的无限增殖没有病毒或细胞基因转导(17,21]。CR方法可用于快速建立原代细胞培养和长期扩张从新鲜或冻存组织样本21]。CR细胞代表成年干细胞样状态条件下辐照小鼠成纤维细胞和ρ激酶抑制剂(22]。CR维持细胞谱系分化潜能在体外(17,22,23]。CR技术已经被用于快速扩大人类呼吸道上皮细胞功能临床移植的未满足的需求24]。在目前的研究中,我们首先建立了主要人类正常气管上皮细胞(HNTEC)和人类正常支气管上皮细胞(HNBEC)从两个捐助者。这些气道上皮细胞在培养条件定义迅速扩散。HNTEC和HNBEC正常的生物学特性和对刺激的反应。他们表达这两种类型的流感病毒受体和维护组织分化的潜能。耦合的2 d和3 d差异化的文化与人类正常气道上皮细胞可能会提供一个在体外生理模型来评估流感病毒的取向和生物学。此外,CR细胞较低气道跟踪表达了更高级别的病毒受体ACE2 mRNA上呼吸道CR细胞相比,表明这些细胞也将适用于冠状病毒的研究,如冠。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

正常气管或支气管标本通过软式支气管镜检查的病人。所有的病人给他们的知情同意。研究符合赫尔辛基宣言,协议是北京大学深圳医院伦理委员会批准。主要组织准备和文化过程进行根据先前的研究[21,25,26]。简单,组织收集碎和消化成单细胞悬液。主气管或支气管上皮细胞培养在基本培养基包含ρ激酶抑制剂y - 27632 (PECBM ImmorTech)辐照小鼠成纤维细胞或培养主要包含ρ激酶抑制剂的上皮细胞培养基y - 27632 (PECM ImmorTech)没有辐照小鼠成纤维细胞在37°C公司为5%₂。小鼠成纤维细胞3 t3-j2辐照如前所述[21)和来自Yongtech(深圳)。辐照小鼠成纤维细胞增殖停止,很容易被最初的30秒coculture系统中胰蛋白酶化。从深圳获得16 hbe细胞疾病控制和预防中心。(写明ATCC)和16 hbe细胞A549细胞在DMEM培养补充10%的边后卫。对3 d基底膜基质文化、单个细胞准备到分化培养基(ImmorTech,中国)与2%人工基底膜(BD生物科学)21]。气液界面(ALI)文化, 细胞被镀在PECBM 12毫米微孔PCF聚碳酸酯插入。两天后,培养基是取代阿里分化培养基(CELLnTEC先进细胞系统AG)、瑞士)根据制造商的指示。细胞培养在阿里19天。

2.2。STR分析

细胞dna HNTEC和提取HNBEC工具包(TIANGEN)。短串联重复序列(STR)分析根据先前的研究[26]。

2.3。核型分析

一个G-banded核型分析中描述以前的研究(25,27]。

2.4。病毒感染

大流行性流感H1N1 (H1N1pdm)以前深圳孤立的疾病控制和预防中心(28,29日]。H1N1pdm病毒传播的MDCK细胞(Madin-Darby犬肾)。在72小时postinfection (hpi),没有细胞培养基是收获,整除,储存在-80°C。病毒滴定法确定了空斑实验(19]。病毒感染,二维单层培养细胞接种病毒的感染复数(MOI) 0.001,和胰蛋白酶(TPCK)添加28]。阿里3 d文化被分化为19天,然后接种病毒的莫伊0.01在顶端层。病毒培养液1小时后被吸附。文化与PBS冲洗3次,补充新鲜培养基。在指定的时间点,2 d或3 d细胞文化收集或固定。

2.5。免疫印迹分析

2 D细胞文化第一次孵化有或没有放线菌素D收获前24小时。免疫印迹分析被执行根据前面的研究(27]。

2.6。Immunofluorescent化验

细胞在2 d或3 d文化中对待4% ( )多聚甲醛,然后用0.5% permeabilized Triton x - 100。第一个印迹抗体(鼠标5抗体黏液,Abcam;小鼠抗体p63 Abcam;Abcam鼠抗体细胞角蛋白14日;和鼠标抗体抗甲型流感病毒核蛋白,Abcam ab20343)是根据制造商的孵化过程和先前的研究23,25,27]。0.5μg / ml DAPI (D3571)是用于染色细胞核。所有的图片都被徕卡DM4000B荧光显微镜。

2.7。轻拍(3 3Diaminobenzidine)染色

DAB染色是根据前面的研究(27),使用一种称为民建联的商品化试剂盒检测设备(EliVision超轻拍,Maixin生物技术)。主要的抗体使用如下:鼠标抗体p63 (ab735 Abcam),兔抗体CK5 (ab53121 Abcam),和鼠标抗体CK14 (sc - 23878,圣克鲁斯生物技术)。

2.8。组织化学

组织和3 d文化首次接受4% ( )多聚甲醛和根据标准石蜡包埋组织过程(27,30.]。组织部分是沾)(苏木精和伊红)(中山金桥公司)。组织学图像分析和捕获evo纯平显微镜(技术)。

2.9。软琼脂试验

软琼脂试验与 细胞在0.3%琼脂糖低熔点的点进行根据一项研究[26]。菌落图像进行了分析和捕获evo纯平显微镜(技术)。

2.10。凝集素免疫荧光染色

细胞在2 d或3 d文化固定和permeabilized如上所述,然后用生物素化的标记凝集素(20μg / ml,系统网络体系结构(SNA)、矢量实验室、伯林盖姆,CA, b - 1305;20μg / ml, MAA-I、向量实验室、伯林盖姆,CA, b - 1265;和20μg / ml, MAA-II、向量实验室、伯林盖姆,CA, b - 1315),然后检测荧光素亲和素DCS (a - 2011、向量实验室、伯林盖姆,CA)在37°C在黑暗中一个小时。0.5μg / ml DAPI (D3571)是用于染色细胞的细胞核。分析了染色和捕获徕卡DM4000B荧光显微镜。

2.11。RNA提取和实时rt - pcr

细胞总rna提取使用试剂盒试剂(表达载体),和实时rt - pcr进行如前所述[27]。ACE2信使rna的检测的引物序列5 - - - - - -CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT -3(意义)和5 - - - - - -GAGCTAATG-CATGCCATTCTCA-3(反义)从2864年到2886年英国石油公司(外显子18)和2950 - 2971个基点(外显子18),分别放大mRNA的地区107个基点。

3所示。结果

3.1。建立长期稳定正常气道上皮细胞的文化

它已经证明了CR技术可以有效地建立individual-derived原代细胞培养没有基因操作(21]。的建立主要CR细胞培养是快速的。与先前的研究一致,人类殖民地的气道上皮细胞2天内可以观察到细胞隔离。HNTEC形态和HNBEC cocultured与辐照小鼠成纤维细胞(支线)如图1(一)。CR技术是利用馈线细胞和ρ激酶抑制剂(y - 27632)诱导的细胞增殖在体外(21,24]。增长曲线HNTEC HNBEC如图1 (b)。短串联重复序列(STR)分析验证了两个新的文化从人体组织(图2(一个))。HNTEC HNBEC具备结构和数值正常核型46,XX(图2 (b))。这些细胞是karyotype-stable。HNTEC HNBEC并没有形成细胞殖民地和单个细胞或细胞碎片存在于软琼脂文化30天(图1 (d))。相比之下,癌症细胞系A549形成anchorage-independent殖民地(图1 (d))。这些结果表明,HNTEC和HNBEC nontumorigenic。调查是否HNTEC和HNBEC有完整p53-mediated与生长有关的通路和正常功能响应DNA损伤,细胞治疗与放线菌素D (D)行动图1 (c)表明p53水平调节与行动D细胞治疗和p21下游效应比未经处理的细胞(图也增加1 (c))。然而,在A549细胞治疗D, p53蛋白水平不是p21诱导和调节而未经处理的A549细胞。这些结果表明,气道上皮细胞通常对DNA损伤反应。综上所述,这些数据表明,我们建立了稳定的长期文化个性化的气道上皮细胞正常组织。

3.2。组织人类正常气道上皮细胞的分化潜能

正常细胞的微分潜力是重要的生理功能31日]。流感病毒的复制也极大地影响了国家的区别(32]。CR细胞通常具有区分能力(22]。基底膜基质基底膜矩阵是一个重要的调节因子维持体内平衡的细胞和组织形态发生(33]。我们进行人工基底膜三维(3 d)文化评估这些个性化的微分电位气道上皮细胞正常。图3(一个)表明HNTEC形成组织良好和极化球体在基底膜基质3 d文化。相比之下,肺癌A549细胞生成的紊乱和非极性聚合物。3 d阿里文化也被用来评估气道上皮细胞的分化潜能。我们做了比较气管组织之间的组织学结构和3 d阿里的文化。HNTEC-derived 3 d阿里文化形成了一个pseudostratified上皮纤毛;这是类似于原始的气管组织(图3 (b))。粘蛋白表达5 ac HNTEC-derived阿里3 d文化分泌杯状细胞(图表示3 (c))。因此,CR气道上皮细胞具有正常的分化潜能在体外。

有条件地重组上皮细胞维持成年干细胞样状态(22]。接下来,我们分析了组织的标志HNTEC免疫荧光和DAB染色。二维(2 d)培养HNTEC表达epithelium-specific标记细胞角蛋白14 (CK14)和气道基底细胞标志物细胞角蛋白5 (CK5)一样的气管组织(数字S1和S2)。此外,HNTEC也表达了具备干细胞标记p63(图S2)。在分化条件下,HNTEC-derived人工基底膜或阿里3 d文化表达CK14 CK5(图类似于原来的气管组织开通和S2 (c))。综上所述,我们的研究结果表明,气道CR正常上皮细胞保持了组织分化的潜能。人类正常气道上皮细胞来源的3 d文化模仿原始的气管、支气管上皮细胞形态结构和生理上。

3.3。表达的病毒受体正常气道上皮细胞和分化HNTEC-Derived 3 d的文化

唾液酸α2,3-galactose(新航α2-3-gal)和唾液酸α2,6-galactose(新航α2、6-gal)两种典型类型的流感病毒受体(34]。人类流感病毒优先结合α2-6-Gal-linked唾液酸,而禽流感病毒表现出偏爱α2-3-Gal-linked唾液酸(5,16]。凝集素结合分析通常是用来检测流感病毒的受体。Sambucus黑质凝集素(SNA)可以明确识别α2-6-linked唾液酸,而Maackia amurensis凝集素(MAA)我承认α2、3 N-linked唾液酸和MAA-II承认α2、3 O-linked唾液酸(5]。唾液酸受体的表达和分布产生重大影响细胞的敏感性或放纵人类禽流感病毒(32]。因此,我们评估的凝集素结合唾液酸受体的表达与免疫荧光测定。图4(一)表明,MAA-I MAA-II,系统网络体系结构(SNA)可以绑定到HNTEC。绑定到HNTEC MAA-I具有强烈的系统网络体系结构(SNA)和MAA-II弱(图4(一))。结果表明,这两种受体对流感病毒感染在2 d培养HNTEC表示。单层差异化HNTEC表达禽流感病毒受体。我们也观察到,系统网络体系结构(SNA)、MAA-I MAA-II绑定到基底和顶端层HNTEC-derived 3 d阿里文化(图4 (b))。丰富的系统网络体系结构(SNA)绑定是最强的。MAA-II绑定比MAA-I和系统网络体系结构(SNA)中的弱。结果表明,高分化HNTEC-derived 3 d文化表达更多的人类流感病毒受体类似于气管组织(32]。因为其他新兴或重现病毒也会感染呼吸道上皮细胞,例如,SARS-CoV2,导致武汉COVID-19爆发,中国,我们还要求这些气道上皮细胞是否表达ACE2(潜在的受体SARS-CoV2感染)。有趣的是,HNTEC和HNBEC ACE2 mRNA表达虽然低气道上皮细胞(HNBEC)表达了ACE2 mRNA水平较高(图4 (c))。

3.4。流感病毒感染分化2 d和3 d气道上皮细胞的文化

我们的研究结果表明,人类正常的气道上皮细胞分化和相应的3 d文化表达这两种类型的流感病毒受体(图4)。接下来,我们调查了他们对病毒感染的易感性。二维单层培养HNTEC HNBEC可能感染甲型流感病毒H1N1 (H1N1pdm)(图S3)。早在12小时postinfection,我们可以观察细胞病变效应(CPE)在人类正常的气道上皮细胞。开发的CPE HNBEC比HNTEC要快多了。甲型流感病毒蛋白质的免疫荧光染色法显示的外观(条目)病毒在HNBEC现病史12和24 hpi在HNTEC(图5(一个))。结果表明,HNBEC更敏感比HNTEC H1N1pdm病毒感染(图5 (c))。这些可能是由于不同捐赠者的个人或解剖网站或病毒受体的表达。控制癌症细胞系A549细胞可以被H1N1pdm病毒感染,但CPE出现在24 hpi和病毒复制本品72居民(增加数据5 (b)和5 (c)和图S3)。其他控制细胞行16 hbe (oncogene-immortalized人类支气管上皮细胞)细胞不够敏感H1N1pdm病毒感染和复制,CPE观察和免疫荧光试验(如图所示的数据5 (b)和5 (c)和图S3)。HNTEC-derived 3 d阿里文化被用来调查易感性H1N1pdm分化良好型的气道上皮细胞的病毒。H1N1pdm病毒接种到顶端层分化3 d阿里文化中描述的材料和方法。CPE由组织学检查(图6(一))。在12 hpi HNTEC-derived 3 d文化变得紊乱。现病史在24和48 hpi, pseudostratified上皮结构逐渐被破坏。在72居民,顶端层完全脱离基底层,和3 d结构。免疫荧光染色的甲型流感病毒核蛋白质的表示H1N1pdm病毒的复制从24日开始(图的快乐指数6 (b))。H1N1pdm病毒传播,直到72年观察到的时间进程的快乐指数。

4所示。讨论

人类呼吸道上皮细胞是主要的目标和流感病毒的宿主细胞。取向和复制能力的流感病毒在呼吸道病毒传播的后果和发病机理35]。许多努力都将建立相关的生理实验模型来研究人类流感病毒的病毒学和发病机理。转换或gene-immortalized人类细胞系被排除生理模型因其重要的差异从相应的组织在活的有机体内(17]。人类呼吸道外植体体外首次采用在1960年代和文化仍用于流感病毒研究[32,36]。但常规可用性和维护组织的可行性呼吸道外植体尚未解决的问题。主要人工气道上皮细胞已经广泛使用虽然这些细胞通常接受衰老后几个段落菜(5,32]。流感病毒的取向和复制是极大地影响气道上皮细胞的分化状态(19,32]。主气道细胞被认为是使用分化在气液界面(ALI)文化或者瀑样(或者叫人工基底膜3 d文化)。的存在mucin-secreting pseudostratified上皮杯状细胞和纤毛是细胞分化的关键标记上皮(19,32]。CR维持细胞谱系分化潜能(17,22,23]。在分化条件下(撤回支线细胞和岩石抑制剂),自动CR细胞区分在体外并形成3 d“miniorgan”取回原组织的结构和生理功能17,22]。我们的研究结果表明,HNTEC-derived阿里3 d文化形成分层与纤毛上皮结构相比原来的气管组织和表示粘蛋白5 ac。此外,HNTEC-derived人工基底膜或阿里3 d文化表达CK14 CK5,类似于原来的气管组织。CR气道epithelial-derived 3 d文化形成一个模仿一个分化良好型的气道上皮细胞在活的有机体内气道上皮细胞结构。

最近,有报道称使用人类呼吸道3 d瀑样和派生的二维单层培养确定感染流感病毒(19,20.]。瀑样文化的过程是嵌入孤立主要细胞基底膜基质。人工基底膜包含一个细胞外基质富含层粘连蛋白和维护正常的体内平衡和组织形态(33]。由于人工基底膜提取肉瘤细胞,不同品牌,甚至批产品影响瀑样的形态和成功率。瀑样的另一个限制是无法理解的顶端层病毒培养液。为了克服这一弱点,3 d瀑样必须消化和播种在插入在优化培养基培养(Transwell)和(19]。主细胞嵌入在基底膜基质不能再为特征。整个过程建立3 d瀑样和2 d单层气道的文化实际上是不方便的或可再生的生物有关。相比之下,主要可以建立气道上皮细胞正常的CR方法充分和迅速扩大。因为这些CR细胞连续的细胞培养,我们可以清晰地定义他们的遗传背景和生物学特性。CR气道上皮细胞保持永生化细胞系的优点和主要的文化。这些CR气道上皮细胞也满足需要的选择相关的表型个体对新兴病毒研究。在未来的研究中,更多的样本不同解剖网站来自同一个人可能需要评估的不同病毒的敏感性HNTEC HNBEC。

病毒受体的表达和分布是另一个关键问题来评估为呼吸道病毒感染相关的生理模型。据报道,分化良好型的人类支气管上皮细胞表现出强烈的绑定与MAA-I (α2 - 3 N-linked加,禽流感病毒的受体)和系统网络体系结构(SNA) (α2-6-Gal人类流感病毒的受体)和弱绑定MAA-II (α2 - 3 O-linked加)[5,32]。其他报道,人类流感病毒可能复制足够多的禽流感病毒在人类呼吸道上皮细胞分化[37]。我们的结果符合这些发现,绑定HNTEC-derived阿里3 d系统网络体系结构(SNA)具有强烈的文化和H1N1pdm复制有效分化良好型的HNTEC-derived 3 d的文化。我们也调查了流感病毒受体的表达差异在二维培养气道上皮细胞。虽然二维单层培养气道上皮细胞表达禽流感病毒受体,人类流感病毒可以有效地复制在2 d无差别的气道上皮细胞。HNTEC和HNBEC孤立从两个捐助者展示了不同的对H1N1感染的敏感性;这些可能是由于不同捐赠者的个人或解剖网站或病毒受体的表达。癌症细胞系或gene-immortalized细胞表现出没有或对病毒感染的敏感性很低。这些数据表明,CR气道上皮细胞可以作为一个可靠的生理相关实验系统研究新兴或重现病毒。

我们目前的研究主要集中在建立一个在体外阿里CRC 2 d和3 d集成为病毒感染(图模型及其可行性7)。进一步和协作调查病毒学、发病机理和抗病毒药物发现将之后的出版物。

5。结论

我们建立了2 d和3 d的文化从正常人气道上皮细胞,表达受体的新兴病毒和适用于病毒感染;这种文化的结合提供了一个生理和个性化在体外模型来研究新兴的感染病毒。这部小说模型可以用于病毒生物学,宿主对病毒感染,抗病毒药物发现。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和补充材料。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

概念化是由霍奇金淋巴瘤。方法是由HL和科幻小说。实验室工作和数据分析是由SX,杰,YY, MW, LY, SC, TZ, ZZ, KZ, KC, XL, WG和科幻小说。资源促进了XL和工作组。起草这份手稿是由SX,杰,霍奇金淋巴瘤。所有作者都阅读和批准提交的版本的手稿。思玉夏,刘骏贡献了同样的工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金委(中国国家自然科学基金资助数字是81571396和81571396)和科学、技术和创新委员会深圳直辖市(批准数字JCYJ20170411090932146和JCYJ20170818110544730)。

补充材料

图S1:组织标记的表达在人类气管组织。(一)人类气管组织的免疫组织化学染色。组织与4%多聚甲醛固定 ),石蜡包埋,切片免疫组织化学染色法探测到的特定抗体CK5,层粘连蛋白,DSG-1和钙粘蛋白。规模的酒吧,50μm。(B)人类气管组织免疫荧光染色。组织与4%多聚甲醛固定 ),permeabilized 0.5% Triton x - 100,并与主CK14抗体标记。的表达CK14免疫荧光试验检测到的。细胞核是沾染了0.5μ克/毫升DAPI。放大20 x。图S2:表达的组织标记HNTEC和派生的3 d文化。(A)表达在HNTEC组织标记。HNTEC培养在无菌玻璃盖玻片在适当的密度和固定在4% ( )0.5%多聚甲醛,permeabilized Triton x - 100,并与主CK14抗体标记,CK5,分别和p63。这三种蛋白标记免疫荧光试验检测到的。细胞核是沾染了0.5μ克/毫升DAPI。蛋白质与二级抗体染色goat-anti-mouse免疫球蛋白g - 488。酒吧,100μm。(B)表达的组织标记的人工基底膜3 d HNTEC文化。单细胞悬浮HNTEC和A549细胞在含有5%的基底膜基质培养基中培养7天。人工基底膜3 d文化与4%多聚甲醛固定w/v特里同x - 100年),permeabilized 0.5%,并与主CK14抗体标记,CK5和p63。酒吧,100μm。(C)表达的组织标记阿里3 d HNTEC文化。HNTEC在气液界面培养(ALI)与4%多聚甲醛(19天和固定 ),石蜡包埋,切片使用标准的组织程序。的表达组织标记检测通过与CK14抗体免疫组织化学染色,CK5和p63。规模的酒吧,50μm。图S3: H1N1感染的2 d培养气道上皮细胞正常。HNTEC和HNBEC被播种 每在6-well盘子H1N1pdm病毒的接种前24小时。A549和16 hbe细胞被用作控制细胞。形态的细胞被拍到在指定的时间点。放大20 x。酒吧,100μm。(补充材料)

引用

1. c . m . Hendrickson和m . a . Matthay“病毒病原体和急性肺损伤:调查受到SARS和2009年H1N1流感大流行,”研讨会在呼吸道和危重病医学,34卷,不。4、475 - 486年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. f·s . Dawood s . Jain l . Finelli et al .,“出现小说swine-origin甲型流感(H1N1)病毒在人类,”《新英格兰医学杂志》上,卷360,不。25日,第2615 - 2605页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. t . g . Ksiazek d . Erdman c·s·戈德史密斯et al .,“一种新型冠状病毒与严重急性呼吸系统综合症,”《新英格兰医学杂志》上,卷348,不。20日,第1966 - 1953页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. c·w·h·Lu Stratton, y . w . Tang“肺炎病因不明的爆发在武汉,中国:神秘和奇迹,”医学病毒学杂志,卷92,不。4、401 - 402年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. m·c·w·r·w·Chan Chan j·m·尼科尔斯和裴伟士j . s .”使用体外和在体外文化人类呼吸道的研究取向和宿主反应的高致病性禽流感(H5N1)和其他流感病毒,”病毒的研究,卷178,不。1,第145 - 133页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 美国田村和t . Kurata”防御机制对流感病毒感染的呼吸道粘膜,”日本传染病》杂志上卷,57号6,236 - 247年,2004页。视图:谷歌学术搜索
7. e·A·Prokopyeva中情局水列夫,m . v . Prokopyev和A . m . Shestopalov”改编的甲型流感(H1N1) pdm09病毒在实验小鼠模型,”感染、遗传与进化39卷,第271 - 265页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. r . K.-K。梁,J.-W。周,w .关,研究。李,Z.-F。杨和美国K.-W。徐,”调制的潜在pH1N1病毒感染呼吸道病原体,”临床微生物学和传染病,19卷,不。10日,930 - 935年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. n . Charoenvisal j . Keawcharoen d Sreta et al .,”泰国重组实验感染猪流感病毒H1N1大流行性流感起源引起的疾病,”病毒学杂志,10卷,不。1,p。88年,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 川口,铃木t y Ohara et al .,“过敏性气道炎症的影响在肺部病理甲型流感病毒感染的小鼠模型,”《公共科学图书馆•综合》,12卷,不。2篇文章e0173008 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 净化m . Imai t .渡边,m . et al .,“实验适应流感H5 HA授予呼吸道飞沫传播重组H5 HA / H1N1病毒在雪貂,”自然,卷486,不。7403年,第428 - 420页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. j .林j .夏y . t . Chen刘贤,y曾庆红,和杨问:“H9N2禽流感病毒增强BMDCs的免疫反应显示miR29c,”疫苗,35卷,不。5,729 - 737年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. s . l .香港p .崔b Lim和m . Salto-Tellez”阐明急性呼吸窘迫综合征的分子生理病理学在严重急性呼吸系统综合症患者中,“病毒的研究,卷145,不。2、260 - 269年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. s . l .史密特j·m·a·范品牌,a . de朗et al .,“不同的严重急性呼吸系统综合症coronavirus-induced急性肺损伤途径在两个不同的非人类的灵长类动物的物种,”病毒学杂志,卷85,不。9日,第4245 - 4234页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 松山,n .经营k . Shirato m·森m .武田和f .田口,“有效的激活严重急性呼吸系统综合症冠状病毒跨膜蛋白的蛋白酶TMPRSS2,”病毒学杂志,卷84,不。24日,第12664 - 12658页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. y郭,e . Rumschlag-Booms j . Wang et al .,“hemagglutinin-mediated条目分析取向H5N1禽流感,”病毒学杂志》第六卷,没有。1,39页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. 诉Ory x Liu, s·查普曼et al .,“摇滚抑制剂和馈线细胞诱导上皮细胞的条件改变,”美国病理学杂志》上,卷180,不。2、599 - 607年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. j·k·李,j·布鲁姆,a . Zubeldia-Plazaola j . c . Garbe m·r·斯坦福·m·a·LaBarge公司,“不同的文化媒体调节生长、异质性和衰老在人类乳腺上皮细胞培养,“《公共科学图书馆•综合》,13卷,不。10篇文章e0204645 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. j .周c, n (goldman Sachs) et al .,“分化人类呼吸道瀑样评估新兴流感病毒的传染性,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷115,不。26日,第6827 - 6822页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. k . p . y .回族r·h·h·Ching s·k·h·陈et al .,”取向、复制能力,流感病毒和先天免疫反应:分析人工气道瀑样和体外支气管文化,”《柳叶刀》杂志上呼吸医学》第六卷,没有。11日,第854 - 846页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. f·a·e . x Liu。杰哈卡胡奇Suprynowicz et al .,“有条件的重组和长期的正常和肿瘤细胞从人类biospecimens扩张,”自然的协议,12卷,不。2、439 - 451年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. f . a . Suprynowicz g·阿帕德海耶,e . et al .,杰哈卡胡奇”有条件地重新编程细胞代表成人上皮细胞的干细胞样状态,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷109,不。49岁,20035 - 20040年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 杨朱y, y, j .郭et al。”来自体内的2 d和3 d HSV-2感染模型使用人类正常的阴道上皮细胞,”Oncotarget,8卷,不。9日,第15282 - 15267页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. c·r·巴特勒,r . e . Hynds k·h·c·高尔et al .,“快速扩张的人类适合气道上皮干细胞组织工程”美国呼吸和重症监护医学杂志》上,卷194,不。2、156 - 168年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. y z张呗,Chen等人“有条件地重组人类正常支气管上皮细胞表达类似水平的细胞色素p450和敏感BaP感应,“生物化学和生物物理研究通信,卷503,不。3、2132 - 2138年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. w·冯j .郭黄h . et al .,“人类正常支气管上皮细胞:一种新的体外细胞毒性评价模型”《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。4篇文章e0123520 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. l . l . Wang, g·魏et al .,“有条件的重组人类缘的上皮细胞是一个新颖的体外细胞模型药物的反应,”生物化学和生物物理研究通信,卷499,不。4、735 - 742年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. x叮,j . Lu r . Yu et al .,“初步A549细胞的蛋白质组学分析感染禽流感病毒的H7N9甲型流感病毒H1N1,”《公共科学图书馆•综合》,11卷,不。5篇文章e0156017 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. 方,k, t . Wang et al .,“主要研究病变和特定蛋白质BEAS-2B细胞诱导2009 A (H1N1)流感病毒,”应用微生物学和生物技术,卷98,不。23日,第9701 - 9691页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. n . a . Ilyushina m . r . Ikizler y Kawaoka et al .,”比较研究流感病毒复制的MDCK细胞和在初级细胞来源于扁桃腺和气道上皮细胞,”病毒学杂志,卷86,不。21日,第11734 - 11725页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. f . Megiorni g . l . Gravina s Camero et al .,“药理针对ephrin受体激酶的信号通过GLPG1790体外和体内恢复oncophenotype,诱发肌原性的分化与radiosensitizes胚胎性横纹肌肉瘤细胞,”血液学和肿瘤学杂志》上,10卷,不。1,p。161年,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. r . w . y . Chan k . m .袁w·c·l . Yu et al .,“流感H5N1和H1N1病毒复制和先天免疫反应在支气管上皮细胞分化状态的影响,”《公共科学图书馆•综合》,5卷,不。1,文章e8713, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. g . y .李·a·肯尼·e·h·李,和m . j .比塞尔”三维培养模型的正常和恶性乳腺上皮细胞,”自然方法,4卷,不。4、359 - 365年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. k . Shinya m . Ebina山田,m .小野n .开赛,y Kawaoka“禽流感:流感病毒受体在人工气道,“自然,卷440,不。7083年,第436 - 435页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. 梁w . y . Chen, s .杨et al .,“人类感染新兴从湿货市场家禽禽流感A H7N9病毒:病毒基因组的临床分析和描述,“《柳叶刀》,卷381,不。9881年,第1925 - 1916页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. k . p . y .回族l . l . y . Chan d i t郭鹤年et al .,”取向和天生的流感A / H5N6病毒的宿主反应:分析ofex vivoandin vitrocultures人类呼吸道的,”欧洲呼吸杂志卷,49号3,1601710条,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. c·汤普森,w·s·巴克利,m . c . Zambon和r . j .泡菜,“感染人类的呼吸道上皮由人类和鸟类流感病毒的病毒,“病毒学杂志,卷80,不。16,8060 - 8068年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2020年夏思玉等。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。