可溶性PTX3人类脐带血液的间充质干细胞变弱氧肺损伤通过激活巨噬细胞极化在新生大鼠模型

文摘

治疗治疗各种炎症相关的疾病使用间充质干细胞(msc)近年有所增加,因为这些细胞的旁分泌作用,但显示了一些局限性。首先,MSC-based治疗表现出不同的功效;因此,生物标志物应该决心确定谁可能会受益于这些候选药物。第二,治疗效果的机制知之甚少。评估的影响人类脐带血液msc (UCB-MSCs)巨噬细胞,巨噬细胞细胞系NR8383刺激与脂多糖(LPS)被UCB-MSCs cocultured。我们发现UCB-MSCs介导巨噬细胞极化对M2与M1巨噬细胞的变化。识别潜在旁分泌作用UCB-MSCs的抗炎效果,UCB-MSCs暴露的分泌LPS-stimulated NR8383细胞使用生物素基于标签的507抗体阵列进行了测试。在分泌蛋白,我们选择pentraxin-related蛋白质PTX3 /肿瘤坏死factor-inducible基因14 (PTX3)调查其与UCB-MSCs巨噬细胞极化。我们发现人类PTX3分泌炎症条件下UCB-MSCs和增强M2巨噬细胞标记通过Dectin-1受体通过激活MSK1/2 NR8383细胞磷酸化信号。因此,击倒PTX3 UCB-MSCs显著减弱他们的治疗效果在一个新生儿氧肺损伤导致生存,减少肺alveolarization, M2标记表达式,Dectin-1水平,抗炎细胞因子,改善M1标记表达式和炎性细胞因子控制MSC-injected老鼠。 UCB-MSCs show therapeutic potential by controlling macrophage polarization. Interestingly, higher PTX3 levels in UCB-MSCs induced greater improvement in the therapeutic effects than lower PTX3 levels. Collectively, PTX3 is a potential marker with critical paracrine effects for predicting the therapeutic potential of MSC therapy in inflammatory diseases; quality control assessments using PTX3 may be useful for improving the therapeutic effects of UCB-MSCs.

1。介绍

间充质干细胞(msc)表现出持续的自我更新能力和分化成特定的细胞,以及再生能力受损组织和管理各种免疫细胞功能(1- - - - - -4]。研究积极关注使用msc治疗各种疾病的功能恢复受损的器官或组织5- - - - - -7]。

然而,一些研究报道低于预期治疗效果的msc注入受损组织。例如,在静脉注射的临床研究BM-MSCs,只有有限的临床疗效观察患者的严重炎症克罗恩氏病(8]。此外,皮下注射的msc皮肤缺损模型并没有导致伤口愈合效果(9]。这些研究结果可能归因于msc的异质性。(1)因为它们是可行的细胞,msc的疗效预测根据不同情况与传统药物显示一致的效果。(2)捐赠的变化会导致变量的影响。因此,临床应用msc仍然有限。这些问题可以通过确定解决标准选择高效的干细胞。

最近的研究报告说,在各种疾病,炎症调控msc可以诱导巨噬细胞极化,通过疗效观察等抑制炎症和增强抗炎(10- - - - - -12]。M1巨噬细胞是经典激活巨噬细胞;外部的刺激会导致炎症的行为通过分泌白介素- 1 (IL)α,il - 6、引发和肿瘤坏死因子-α。相比之下,M2巨噬细胞被激活或者激活并导致抗炎行动il - 4、il - 10, IL-13,精氨酸酶1 (__arg1)。作为标记,代表CD11b、CD40和CD80用于识别M1巨噬细胞,而CD163和CD206用于M2巨噬细胞(13- - - - - -15]。这样的巨噬细胞极化新兵关键转录监管因素,调节信号传感器之间的交互和转录的激活,干扰素调节因子、核因子- (NF)κB,激活蛋白1、过氧物酶体proliferator-activated受体-γ营响应binding元素(13,16,17),和其他各炎性疾病(调节巨噬细胞极化18]。

检查参与组成分泌腺的已被证明释放各种治疗蛋白质的微环境在msc暴露于一个区域包含一个病变。因此,各种蛋白质由msc分泌功能恢复的损伤区域,这称为旁分泌作用[19,20.]。分泌治疗蛋白质是已知的作为血管生成因素,生长和营养因子,趋化因子和抗炎细胞因子,参与免疫调节(21]。特别是,根据一项研究,msc分泌肿瘤坏死factor-inducible暴露在炎症条件基因6 (TSG6)或前列腺素E2 (PGE2),这是被认为与巨噬细胞极化(22- - - - - -24]。然而,解释msc的治疗效果完全基于这两种蛋白质,当前的理解转换为抗炎条件不足和信号机制的研究应该是必要的。有必要确定额外的蛋白质参与巨噬细胞极化诱导msc和确定信号机制,增强了抗炎。

在这项研究中,选择高效的干细胞有效治疗炎症条件下,蛋白质从msc分泌受到质量鉴定、和PTX3 (PTX3 / TSG14 pentraxin-related蛋白质PTX3 /肿瘤坏死factor-inducible基因蛋白14日)被证实为一个潜在的标记。巨噬细胞极化的信号机制诱导也阐明基于Dectin-1受体介导促分裂原和压力激发了蛋白质kinase-1/2 (MSK1/2)磷酸化的巨噬细胞。此外,治疗效果和机制涉及PTX3在支气管肺的发育不良的动物模型,检测一个代表性的炎性疾病,证据确定最低标准PTX3收购。msc在炎症的抗炎治疗机制建立,我们发现msc的选择标准预测表现出卓越的功效可能会提高这些细胞的治疗效果。

2。方法

2.1。UCB-MSC准备

本研究机构审查委员会批准MEDIPOST有限公司有限公司(mp - 2015 - 6 - 4)。脐带血(UCB)收集从脐静脉与知情的产妇新生儿分娩后同意。收获的联合处理24小时内收集。UCB-MSCs,孤立和分离单核细胞与Ficoll-Paque™+(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典),清洗或悬浮在最低基本medium-alpha(美国纽约Gibco,大岛)补充10%胎牛血清(Gibco)。文化是维持在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂,培养基每周更换2次(25]。对于每一个通道,msc培养5天,收获与trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸(Gibco)计算,然后受移植者的细胞密度2000细胞/厘米²。我们跟着金等的方法。26]。在这项研究中,我们测试了七UCB-MSC很多分开的UCB样本来自不同的捐赠者;这些细胞的基本信息总结了补充表1。在所有的实验中,UCB-MSCs被用于通过6。获得了重组PTX3从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。

2.2。体外炎症条件

大鼠肺泡巨噬细胞细胞系NR8383(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)培养F-12K中补充15%胎牛血清。脂多糖(LPS大肠杆菌O55: B5, 1μg / mL, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被用来激活NR8383细胞( ),作为一个积极的控制炎症条件。经典激活NR8383细胞cocultured UCB-MSCs ( )3天24-well板。旁分泌作用,细胞细胞接触(直接)使用类似于临床应用状况。Coculture上层清液收集和鼠il - 1α大鼠il - 6,老鼠引发,鼠il - 10,和人类PTX3测量通过酶联免疫吸附试验(ELISA)(所有从研发系统)。immunofluorescent染色,NR8383细胞复染色与赫斯特33342年coculture前(表达载体),然后孵化一夜之间在4°C抗体鼠CD11b (Abcam,剑桥,英国),鼠CD163(圣克鲁斯生物技术有限公司、圣克鲁斯、钙、美国),或鼠Dectin-1 (Abcam)。三洗后,细胞被孵化的Alexa萤石®488或Cy3-conjugated二级抗体(杰克逊ImmunoResearch欧洲有限公司纽马克特,英国)1 h在黑暗中在室温下。荧光图像获得800年LSM共焦显微镜(蔡司、从、德国)。

2.3。流式细胞术

仪分析培养细胞的表型,细胞被染色和荧光素在室温下15分钟isothiocyanate-conjugated抗体人类CD14和CD45和人类白细胞antigen-DR同形像(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国);phycoerythrin-conjugated抗体人类CD73和存在(BD生物科学)和CD90 CD105表达载体。相应isotype-matched鼠抗体被用作控制。这些细胞被洗磷酸盐(PBS、康宁、马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)和固定为1% ( )多聚甲醛(Sigma-Aldrich)。msc的immunotype决心通过流式细胞术FACSCalibur仪器(BD生物科学)和细胞表面抗原表达的百分比计算10000年gated-cell事件(26]。

2.4。细胞分化

这些细胞被培养在特定条件下诱导分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和他们multilineage潜力评估如前所述[27]。简而言之,成骨细胞和骨细胞形成评估通过测量碱性磷酸酶的活性(Sigma-Aldrich)。确认chondrogenic分化,cryosections分析红色染料染色(Sigma-Aldrich)。脂肪细胞形成评估基于油红O染色积累的脂质空泡(Sigma-Aldrich) [26]。

2.5。分泌数组

我们准备的媒体从每组(NR8383细胞单独或LPS-treated NR8383细胞;UCB-MSCs单独或与LPS-treated UCB-MSCs NR8383细胞)。使用基于标签的人类抗体蛋白表达进行了筛选数组,一个微分筛选抗体微阵列(美国RayBiotech桃树角落,GA)含有507抗体(补充表2)。抗体阵列实验是由E-biogen(首尔,韩国),根据既定的协议。荧光检测进行了使用GenePix 4000 b(轴突仪器,结合城市、钙、美国),直到玻璃芯片完全干燥,和芯片进行扫描GenePix×4000扫描仪(GenePix 4000 b,轴突仪器)和图像分析与GenePix Pro 6.0软件(轴突仪器)。后减去背景信号和正常化的价值观积极控制,信号强度和阵列图像之间进行比较,以确定每一个蛋白质的相对表达水平的差异群体之间(UCB-MSCs孤独与UCB-MSCs LPS-treated NR8383细胞)。

2.6。定量实时聚合酶链反应(qPCR)和小干扰RNA (siRNA)

qPCR执行使用LightCycler™480系统(罗氏、巴塞尔、瑞士)。TaqMan探针设计与通用探针库分析设计中心(罗氏公司;看到补充表3),用于定量检测PTX3和Dectin-1基因的mRNA水平。这些mrna的相对表达水平比较阈值周期计算方法(2^−ΔΔCt)与规范化β肌动蛋白mRNA表达水平(26]。Dharmacon拉斐特有限公司(美国)设计了小干扰rna,爬siRNA PTX3在核的实验中使用。siRNAs转染使用DharmaFECT 1转染试剂(Dharmacon)根据制造商的指示。核池由四个不同的核工器(见补充表3)。

2.7。动物模型

所有动物实验机构批准的动物保健和使用委员会MEDIPOST有限公司有限公司(mp -政治- 2015 - 12 - 1)。准备一个支气管肺的发育不良(桶)在活的有机体内模型中,定时怀孕Sprague-Dawley老鼠(Samtako生物韩国有限公司、乌山,韩国)自发送新生幼鼠如前所报道(28]。两个实验设计(补充表使用4)。常氧老鼠维持在正常室内空气,而氧大鼠生长在氧室(90%氧气)从出生直到产后14天(P)。哺乳期的母亲每天老鼠旋转氧过多与室内空气之间的窝,防止氧中毒。产后5天(P), UCB-MSCs移植气管内的(29日]。同等体积的PBS鞘内注射是控制。存活率是每日记录,直到出生后第14天。好,老鼠幼仔牺牲下深戊巴比妥麻醉(60毫克/公斤,腹腔内)和肺组织形态学和生化分析收获。固定的肺组织被嵌入在石蜡和分段4μ米厚度其次是与苏木精和伊红染色())。alveolarization的程度是衡量使用均值线性指数(多层互连)正如前面介绍的29日]。至少三个部分每鼠和100字段部分随机盲法的方式评估。注入msc移植是衡量人类的免疫荧光分析β2微球蛋白(β2毫克,Santa Cruz)可视化使用Alexa萤石®488 -标记的第二抗体(杰克逊ImmunoResearch欧洲有限公司)。抗体检测肺泡巨噬细胞,主要是用来检测CD11b, CD163, Dectin-1肺部分。幻灯片是孵化主要抗体在一夜之间在4°C。二次抗体与Alexa染色萤石®488或Cy3(杰克逊ImmunoResearch欧洲有限公司)在室温下1 h。核与赫斯特33342年复染色。共焦显微镜获得的部分图像。鼠il - 6的浓度、老鼠引发和鼠il - 10在支气管肺泡灌洗液(BALF)被ELISA检测(如前所述)(28,29日]。大鼠模型的基本方案总结了补充图1。

2.8。统计分析

的所有数据 与SPSS分析软件(版本18;美国SPSS, Inc .,芝加哥,IL)。显著差异是由单向方差分析验证紧随其后的最低差事后测试。学生的 - - - - - -测试是用来比较两组之间的数据。值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。UCB-MSCs调节巨噬细胞极化在体外炎症模型

msc是广为人知的抗炎行动,通过细胞间接触发生,可溶性因子的活动包括生长因子、细胞因子、矩阵抑制剂,和细胞外囊泡,或者这些机制的组合(30.]。先前的研究表明,msc介导巨噬细胞极化的变化或者从M1 M2巨噬细胞激活巨噬细胞,可能导致炎症减少(13- - - - - -15]。巨噬细胞极化对促炎(M1)或抗炎(M2)巨噬细胞。M1巨噬细胞产生炎症通过释放促炎细胞因子(il - 1、il - 6、引发、TNF -α或干扰素-γ),而M2巨噬细胞分泌抗炎细胞因子(il - 10和TGF -β1)具有抗炎作用,并使组织再生后炎症条件(16]。M1和M2极化导致不同的表面标记高CD86的表达和高水平的CD11b或CD163 mannose-binding凝集素受体CD206 CD209 M2巨噬细胞(17,18]。这里,UCB-MSCs的巨噬细胞极化效应,分析大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383细胞)由有限合伙人与UCB-MSCs cocultured刺激。文化72 h后,NR8383沾M1促炎的标记(CD11b)或M2消炎标记(CD163),然后,阳性细胞的数量统计。CD11b激活在LPS-stimulated NR8383细胞;然而,这明显被coculture UCB-MSCs。在coculture CD163 NR8383细胞的表达明显增加(图1(一))。接下来,我们分析了促炎细胞因子(鼠il - 1的水平α、鼠il - 6和老鼠引发)和抗炎细胞因子(鼠il - 10)在NR8383细胞。分泌的促炎细胞因子升高LPS诱导后,虽然这些增加明显抑制coculture UCB-MSCs。抗炎细胞因子分泌NR8383细胞培养与UCB-MSCs显著高于单从NR8383细胞(图1 (b))。这些结果说明UCB-MSCs促进巨噬细胞极化在体外在炎症条件下。

3.2。分泌蛋白的识别UCB-MSCs刺激炎症条件下

虽然巨噬细胞极化的概念可能用msc、解释这些发现的生物相关性尚不清楚。提出了各种可溶性蛋白质来管理的有利影响msc、免疫调节和抗炎等作用[31日]。因此,我们假设UCB-MSCs使用分泌蛋白质,积极控制巨噬细胞极化。为了验证这个假设,我们分析的蛋白质分泌UCB-MSCs识别与巨噬细胞极化效应相关的旁分泌因子使用条件的507生物素基于标签抗体阵列媒体从每组(NR8383细胞单独或LPS-treated NR8383细胞;UCB-MSCs单独或与LPS-treated UCB-MSCs NR8383细胞)。没有分泌蛋白的表达变化观察到NR8383细胞没有LPS刺激(数据未显示),我们分析与UCB-MSCs在LPS刺激的存在与否NR8383(图2(一个))。蛋白质的比例超过2.0被认为是显示增加部分UCB-MSCs当cocultured LPS-stimulated NR8383细胞。调节蛋白质cocultured UCB-MSCs UCB-MSCs相比单独培养有关192的功能性生物学途径包括调节激素,神经发生、迁移、生长因子、分化、抗氧化、抗炎、抗凋亡、血管生成和粘附(图2 (b))。调节蛋白质在生物过程中,我们分析了提高蛋白质参与抗炎信号。我们选择10分泌蛋白质明显调节UCB-MSCs coculture后,PTX3, TIMP-2, Decorin, Frizzled-1, VEGF, FGF-5, FGF-11, Ang-1 TSP-1、和Gal3强度分析(图2 (c))。值得注意的是,PTX3显示最伟大upregulation inflammation-stimulation条件下。核实这些数组结果,我们分析了PTX3在UCB-MSCs的表达水平和cocultured UCB-MSCs从一个额外的4种不同的捐赠者通过ELISA。PTX3在炎症条件下提高水平在所有四个UCB-MSC很多测试,观察到增加的分泌MSC1(10倍),MSC2(9倍),MSC3(3.5倍),和MSC4(三倍),如图2 (d)。综上所述,我们选择PTX3作为一个潜在的标记进一步调查其参与UCB-MSCs的炎症。

3.3。通过巨噬细胞极化PTX3 UCB-MSCs增加抗炎效应

确定PTX3 UCB-MSCs分泌物的功能导致巨噬细胞极化,我们阻止了PTX3表达式使用核。与目标核控制实验表明,治疗有效减少PTX3表达分泌水平(补充图2)。coculture后第三天,探讨巨噬细胞极化,NR8383细胞被沾染了M1促炎的标记(CD11b)或M2消炎标记(CD163)和阳性细胞的数量计算。治疗siRNA PTX3在UCB-MSCs显著激活CD11b表达式,而CD163表达在很大程度上减少而天真的细胞或小干扰rna(图处理控制3(一个))。细胞因子水平,PTX3核细胞显示炎性细胞因子的分泌增加(鼠il - 6或老鼠引发),而抗炎细胞因子的水平(鼠il - 10)减毒相比,对照组(天真或控制核(图3 (b))。此外,检查PTX3行动的致病因子在炎症条件下,我们添加了100 ng / mL PTX3重组蛋白在LPS刺激NR8383细胞72 h。正如所料,PTX3治疗CD11b表达降低,增加CD163表达式。此外,proinflammation治疗组明显下降,显示突出的分泌抗炎分子(补充图3)。总的来说,这些结果说明PTX3分泌的旁分泌作用中扮演一个重要的角色在炎症条件下UCB-MSCs巨噬细胞极化。

3.4。PTX3增强巨噬细胞极化效应通过激活Dectin-1下游信号

调查PTX3-induced巨噬细胞极化的信号通路,我们评估是否PTX3与已知的受体。虽然PTX3-specific细胞受体并不知名,最近的研究表明巨噬细胞刺激与PTX3表达高水平的Dectin-1 [32),这可能是一种间接PTX3的行动。我们评估的相关性PTX3在巨噬细胞分泌和Dectin-1诱导炎症条件。Dectin-1在巨噬细胞高水平cocultured UCB-MSCs(天真或控制siRNA)但明显下调PTX3 siRNA-treated细胞(图4(一))。检查是否Dectin-1表达式功能导致巨噬细胞极化,我们用siRNA NR8383细胞抑制Dectin-1表达式。与目标核控制实验表明,治疗有效地抑制Dectin-1表达式在基因水平(补充图4)。在coculture后第三天,评价巨噬细胞极化、治疗与Dectin-1 siRNA增强巨噬细胞炎性细胞因子(鼠il - 6,老鼠引发)释放和减少抗炎细胞因子分泌(图(鼠il - 10)4 (b))。值得注意的是,沉默的Dectin-1巨噬细胞极化的影响。Dectin-1进一步证明了结果的重要性,表明治疗PTX3重组蛋白增加Dectin-1水平(补充图4)。这些结果清楚地表明,Dectin-1扮演主要角色在巨噬细胞极化触发UCB-MSCs PTX3的抗炎作用。接下来,我们研究Dectin-1下游信号。已知的蛋白质激酶MSK1/2至关重要调制器限制炎性细胞因子和抗炎细胞因子的生产增加巨噬细胞Dectin-1 [33]。此外,据报道,Dectin-1诱发M2巨噬细胞极化的引发MSK1/2 [33]。检查是否PTX3 Dectin-1信号级联使用一个类似的机制,我们研究是否PTX3或者Dectin-1可以调解彼此的表情。我们抑制PTX3或Dectin-1用siRNA UCB-MSCs和NR8383细胞。coculture的第3天,MSK1/2磷酸化在NR8383增加细胞cocultured控制UCB-MSCs(天真或控制核)。然而,MSK1/2表达显著降低当UCB-MSCs PTX3 siRNA对待。此外,MSK1/2水平显著降低NR8383细胞接受Dectin-1 siRNA(补充图5和5 b)。重要的是,治疗SA747651A, MSK1/2化学抑制剂,显著废除老鼠引发的减少和增加大鼠il - 10分泌NR8383 cocultured与UCB-MSCs(补充图5度)。这些数据表明,PTX3在UCB-MSCs通过控制Dectin-1受体中扮演一个重要的角色在巨噬细胞,导致巨噬细胞通过MSK1/2信号极化。

3.5。PTX3改善UCB-MSCs的治疗能力在高氧肺损伤大鼠模型

我们调查的意义的能力PTX3控制的抗炎效果在活的有机体内模型。我们准备了不同类型的UCB-MSCs包括天真,控制核和小干扰rna,然后将这些细胞注入PTX3严重鼠氧肺损伤模型(桶)P5和比较治疗效果。我们观察到PTX3 siRNA组PTX3分泌减少,抑制保持长达13天(补充图6)。MSC移植后九天好,人类PTX3蛋白质检测对照组(天真或控制核),但不是PTX3 siRNA MSC集团(补充图6 b)。老鼠的存活率是47.8%桶组已经去世,而大多数老鼠与天真的msc移植(77.3%)、控制siRNA msc(82.3%)、或PTX3 siRNA msc(68.1%)(图中幸存下来5(一个))。大鼠肺组织,代表显微照片显示组织病理学证实的差异由多层互连的形态学分析。受损的观察肺泡增长减少肺泡或更大肺泡的桶组相比,在正常组。高氧肺损伤由多层互连减少在天真的MSC和反面siRNA MSC组而不是PTX3 siRNA MSC组(图5 (b))。结果免疫荧光染色检测M1炎症标记(CD11b)或M2消炎标记(CD163)巨噬细胞极化量化通过计算阳性细胞的数量在大鼠肺组织。CD11b桶组中被激活;然而,这明显被注入msc在对照组(天真或控制核)。CD163桶模型中的表达明显增强治疗与MSC控制。正如预期的那样,PTX3 siRNA-treated集团增加CD11b表达和减少CD163表达式MSC相比对照组(数字5 (c)和5 (d))。此外,Dectin-1-positive细胞显著减少PTX3核组(图5 (e))。当我们分析道细胞的数量与抗体染色的肺组织特定的人类β2毫克,PTX3 siRNA显示小肺的移植能力比对照组(图5 (f))。接下来,我们测量肺BALF中细胞因子表达水平。炎性细胞因子的水平包括鼠il - 6和老鼠引发显著调节桶模型与正常大鼠相比。氧过多刺激增加桶大鼠炎性细胞因子释放,这是一般控制MSC组显著降低但不是PTX3 siRNA组。抗炎细胞因子水平(鼠il - 10)在桶大鼠BALF更有效地减少PTX3 siRNA MSC比天真的MSC治疗或控制siRNA-treated MSC(图5 (g))。这些结果表明,PTX3分泌中起着重要的作用在UCB-MSC巨噬细胞极化效应在活的有机体内疾病模型。综上所述,这些数据表明,抑制PTX3表达式加速msc治疗桶的治疗效果。

在一组不同的实验中,我们比较PTX3分泌的治疗效果使用在新生大鼠高氧肺损伤模型。使用的三个MSC很多:MSC5被定义为低很多(1.5 ng / mL), MSC6被定义为媒介(6 ng / mL),和MSC7用作高很多(20 ng / mL)。评估人类PTX3分泌水平在体外在炎症条件下,LPS-stimulated NR8383细胞与UCB-MSCs cocultured(图6(一))。MSC5, MSC6, MSC7很多准备和用于治疗严重的鼠氧肺损伤模型的P5随后分析治疗效果。一天9细胞注射后,桶组的生存率分别为53.6%,60% MSC5集团MSC6集团的86.6%和72.2% MSC7组,如图6 (b)。分析了水平alveolarization)染色,通过测量多层互连。高氧肺损伤明显由多层互连两MSC6减少和控制MSC7但不是MSC5组(图6 (c))。对巨噬细胞极化,肺组织是沾染了M1标记(CD11b)或M2标记(CD163),然后量化通过计算阳性细胞的数量。CD11b桶组中被激活,显著减少了治疗的三个很多msc,在注入MSC6或MSC7有效减少CD11b水平(图6 (d))。CD163表达显著激活后治疗MSC6或MSC 7;然而,这些影响没有观察到与MSC5注射后(图6 (e))。此外,细胞接受MSC6或MSC7 Dectin-1水平显著高于细胞接受MSC5(图6 (f))。接下来,我们分析了促炎细胞因子(鼠il - 6,老鼠引发)和抗炎细胞因子(鼠il - 10)在大鼠肺BALF。老鼠分泌的促炎细胞因子升高的桶;然而,这些影响是显著地抑制注射3很多msc。详细,鼠il - 6显示MSC6效果要明显高于MSC5或MSC7。老鼠引发的结果表明MSC7效应明显大于MSC5 MSC6。抗炎细胞因子的分泌明显增加了MSC6和MSC7但不是MSC5(图6 (g))。这些结果表明,PTX3分泌的水平决定了治疗的肺损伤模型的结果。总的来说,这些发现表明,PTX3蛋白提高了msc治疗的治疗效力桶。

4所示。讨论

在这项研究中,UCB-MSCs抑制炎症和增强抗炎的行为通过PTX3蛋白质和巨噬细胞极化的影响,在这两种在体外和在活的有机体内炎症模型。

当UCB-MSCs cocultured LPS-stimulated巨噬细胞,显著减少炎症细胞因子和抗炎细胞因子的显著增加。CD11b,同样,M1指标显著降低,M2标记,CD163激活。根据最近的一份报告,由msc分泌的蛋白质参与诱导巨噬细胞极化,抑制炎症,和增强抗炎(24]。检查参与组成分泌腺我们分析了507个数组使用细胞培养基的基础上,预测蛋白质分泌UCB-MSCs在炎症条件下诱导巨噬细胞极化。UCB-MSCs媒介,相比192年的水平的蛋白质增加了2倍的媒介UCB-MSCs cocultured LPS-stimulated巨噬细胞。这些蛋白质被归类为参与生物工艺通过激素,神经发生、迁移、生长因子、分化、抗氧化、抗炎、抗凋亡、血管生成和附着力。十个蛋白质参与抗炎被选为候选人(PTX3、TIMP-2 Decorin, Frizzled-1, VEGF, FGF5, FGF-11, ANG-1, TSP-1,和Gal3)。TSG6,经常检查在先前的研究22,23,34)被排除在外,因为它增加了不到2倍。PTX3表现出最大的增加,因此被选为一个潜在的标记。分析的四个很多确认PTX3水平明显增加所有coculture媒体尽管增长率的差异。其他蛋白质的候选人需要进一步分析。VEGF、TSP-1 Gal3分泌UCB-MSCs已知治疗效果在各种疾病的动物模型35- - - - - -37]。因此,额外的标记可能在进一步的研究确定。此外,旁分泌因子由MSC分泌也受介质努克和Rap1控制促炎细胞因子(38- - - - - -40]。旁分泌的调节效果和msc分泌因素是重要的决定msc的治疗效率。

PTX3报道诱导巨噬细胞的极化消炎平方米,同时刺激他们分泌免疫抑制细胞因子如TGF -β和il - 1041,42]。例如,当PTX3-silenced巨噬细胞凋亡与人为PTX3水平降低与重组PTX3治疗,炎症细胞因子水平显著降低和抗炎细胞因子被激活(43]。这些报告表明PTX3抑制炎症和增强抗炎的关键因素。在此基础上,PTX3击倒UCB-MSCs与巨噬细胞验证cocultured UCB-MSCs PTX3分泌的炎症的抗炎作用。结果表明,炎性细胞因子和抗炎细胞因子的增加而减少在低利率,降低停滞不前CD11b CD163和增加。相比之下,治疗与重组PTX3 LPS-stimulated巨噬细胞促进巨噬细胞极化,导致抑制炎症和增强抗炎。结果表明,PTX3分泌UCB-MSCs在巨噬细胞极化中起着举足轻重的作用。

接下来,PTX3激活巨噬细胞极化的机制在炎症条件下进行了研究。虽然同源受体PTX3是未知的,一项研究报道,PTX3施加调理素的作用,介导的内化酵母聚糖通过Dectin-1受体的巨噬细胞在炎症32]。因此,基于预测PTX3与Dectin-1巨噬细胞,Dectin-1受体被检查的依赖。Dectin-1 cocultured巨噬细胞表达水平进行了分析,发现显著的高于cocultured UCB-MSCs LPS-stimulated巨噬细胞。此外,Dectin-1表达减少UCB-MSCs PTX3 siRNA对待。这表明PTX3与巨噬细胞的Dectin-1受体。此外,我们检查是否Dectin-1激活PTX3参与促进巨噬细胞极化。核被用来抑制Dectin-1巨噬细胞表达,与UCB-MSCs coculture紧随其后。监测水平的巨噬细胞极化的结果显示,在巨噬细胞极化降低Dectin-1被抑制。据报道,Dectin-1巨噬细胞减少炎性细胞因子,诱导抗炎细胞因子通过MSK1和MSK2磷酸化(33]。因此,MSK1的水平和MSK2激活后测量coculture UCB-MSCs在炎症条件。结果显示增加蛋白质含量由UCB-MSCs:(1)抑制PTX3分泌UCB-MSCs导致减少MSK1和MSK2表达在巨噬细胞和巨噬细胞(2)抑制Dectin-1导致减少MSK1和MSK2表达式。进一步验证协会MSK1和MSK2 SA747651A的巨噬细胞治疗,MSK1和MSK2的抑制剂。结果证实,减少炎症的抑制和增强巨噬细胞的抗炎。这些结果表明,PTX3分泌USB-MSCs激活巨噬细胞炎症条件下Dectin-1受体,表明MSK1/2积极信号调节巨噬细胞极化。大量研究报道,Dectin-1 p38磷酸化α巨噬细胞MAPK或ERK1/2级联,导致MSK的激活(33,44- - - - - -47]。MSK1/2也是诱发著名的转录因子的磷酸化分子减少炎性细胞因子水平,同时调节抗炎细胞因子的激活33,46- - - - - -49]。

验证的潜在使用PTX3功效标记,一个著名的炎性疾病模型桶的使用。桶是一个代表炎性疾病(50),临床研究已经证实注射msc的治疗效果28,29日,51,52),目前正在评估在朝鲜和美国正在进行的临床研究[53- - - - - -55]。首先,PTX3-silenced msc被注入这个疾病模型大鼠和疗效监测。老鼠的存活率是监控直到出生后第14天,其次是分析多层互连,M1和M2标记表达式,Dectin-1表达式在巨噬细胞,肺组织和残余msc。炎症和抗炎细胞因子的分泌也以肺BALF。结果显示显著降低治疗效果在PTX3-silenced UCB-MSCs, Dectin-1表达和最低的残余msc的肺部组织。接下来,疗效比较通过测量分泌PTX3的浓度。下在体外炎症条件下,3很多UCB-MSCs (MSC5、MSC6 MSC7)根据自己的能力选择诱导PTX3分泌和各参数之间的比较。PTX3 MSC5显示最低的能力减少分泌,不导致疗效与对照组相比对肺泡损害复苏,抗炎细胞因子分泌,和Dectin-1表达式。相比之下,MSC6和MSC7诱导高水平的PTX3分泌并显示显著的疗效与对照组相比在所有评估项目。这表明UCB-MSCs PTX3分泌的炎症水平的条件是一个重要的标准判断疗效。

上述动物模型实验表明,PTX3 UCB-MSCs分泌的水平在炎症条件下是一个潜在的预测疗效的标志。截止值PTX3水平也可能是有用的在筛选高效的干细胞。同意这个,最近的研究报道,PTX3在msc导致治疗效果。在一项由Cappuzzello et al .,注入msc与减少PTX3在皮肤缺损模型对照组相比延迟伤口愈合(56]。公园等人发现,注射后的msc在缺血性脑损伤动物模型,组织再生被提升,减少炎症反应,与高水平的PTX3发现分泌UCB-MSCs [57]。毛里等人注射msc在急性肺损伤的小鼠模型,观察了细胞纤维化和改善肺功能,而组注射msc与减少PTX3显示肺氧合能力降低,肺损伤不恢复(58]。这些发现表明,PTX3 msc参与各种治疗效果。

5。结论

总之,UCB-MSCs炎症条件下被证实由分泌抑制炎症而加强抗炎PTX3 Dectin-1受体的激活巨噬细胞和诱导MSK1/2信号,从而促进巨噬细胞极化。此外,PTX3是一个潜在的标记筛选高效的干细胞。这些发现表明,干细胞疗法的效果可以最大化当治疗棘手的炎性疾病。

数据可用性

生成的数据集在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者没有竞争的经济利益要申报的东西。

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(NRF - 2017 r1d1a1b03035906)。

补充材料

补充图1:实验方案在高氧大鼠MSC行政模式。补充图2:在UCB-MSCs PTX3表达的沉默。补充图3:巨噬细胞极化效应下的重组PTX3 LPS-induced炎症状态。补充图4:NR8383 Dectin-1击倒效果。补充图5:Dectin-1促进抗炎效应在炎症条件下通过NR8383 MSK1/2信号。补充图6:沉默UCB-MSCs PTX3表达式。补充表1:基本信息关于UCB-MSCs用于这项研究。补充表2:数组映射人类细胞因子抗体阵列图2(一个)。补充表3:使用的引物序列的测序表明目标基因。补充表4:体内实验设计。(补充材料)

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