胰腺祖细胞和瀑样作为先决条件模型胰腺疾病和癌症

文摘

胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(万能)的特点是对任何特定的独特能力,逐步分化细胞在成年的器官。多能干细胞提供一个有益的平台发展模式遗传疾病,甚至癌症。而胰腺疾病,如糖尿病、胰腺炎的发病率正在增加,特定疾病的基本病机的认识仍然有限。只有几个最近的出版物促成了人类胎儿胰腺发展阶段的特征。因此,大多数的胰腺规范是基于小鼠胚胎学知识。优化和理解当前在体外协议为胰腺ESCs的分化和细胞则构成先决条件生成的胰岛细胞功能更好的疾病模型和药物发现。此外,人类胰腺癌瀑样来自多能干细胞,organ-restricted干细胞,肿瘤样本提供一个强大的技术模型致癌作用和遗传性疾病的转基因小鼠模型独立的。在此,我们总结一下最近的进步胰腺内分泌细胞组成的瀑样类型的定向分化。除此之外,我们积极进取的organoid-based平台中的应用作了说明。

1。介绍

在干细胞研究最新进展已经导致了许多新的工具优越疾病建模遗传性疾病和癌症发展。胰腺疾病,如糖尿病的发病率上升和胰腺炎和胰腺癌的预后很差1- - - - - -3),导致高对新技术的需求将推动知识和提高未来的治疗方法。尽管一些最近的研究利用基因表达研究人类胎儿胰腺大部分的知识关于复杂的信号相互作用在胰腺癌发展来源于小鼠模型(4- - - - - -6]。这揭示了未满足的需要优化在体外差异化协议发展的功能性人体内分泌和外分泌胰腺细胞基本疾病建模或药物开发7]。

诱导多能干细胞(iPSC)的引入先进技术代表着一个巨大的一步在体外建模和特定疾病遗传疾病的药物筛选。高桥等人,高桥和山中表明执行表达式OCT4、SOX2, Klf4,原癌基因在成纤维细胞可以重新编码细胞使之达到多能干细胞状态(8,9]。这些表现出关键特性的胚胎干细胞的细胞则从囊胚的内细胞团分离,例如,转录因子的表达(OCT4、SOX2 NANOG)和细胞表面标记(SSEA-3和SSEA-4) (8,9]。

ESCs缺失以及胚胎干细胞的细胞则()港多能性的标志,他们的特点是无限的自我更新能力和分化成体内任何细胞类型(10]。因此,他们可能作为来源在体外分化为不同的细胞类型的胰腺血统。协议旨在概括胚胎发育与stage-specific调制的信号包括Wnt,切口,声波刺猬(嘘)和骨形成蛋白(BMP)导致的序列诱导的内胚层(DE)、肠内胚层管(一种),胰腺内皮层(PE)和胰腺祖(PP)阶段(7,11- - - - - -15]。结合使用小分子和生长因子有效地生成多功能胰腺祖细胞(13- - - - - -17),随后分化为导管、腺泡和内分泌血统(18]。然而,信号网络主要规范和成熟的胰腺细胞类型还没有完全理解(19]。

瀑样代表功能的重要一步在体外胰腺组织的建模。3 d瀑样文化与成人胰腺的功能和结构属性可以来源于多能干细胞或organ-restricted干细胞(20.),因此可用于分析基本基因功能和细胞过程。此外,这种技术可能有助于遗传疾病的转化医学和建模和致癌作用以及在再生医学(20.,21]。

建立胰腺癌进展进行综述血统衍生品已经和概述瀑样的潜在应用的模型系统遗传性胰腺疾病,糖尿病和胰腺癌。

2。主要内容

胰腺是一个复合腺的外分泌腺泡和导管细胞组成的隔间和一个内分泌室包含α,β,γ,ε,PP在朗格汉斯组织细胞胰岛(22- - - - - -24]。缺陷引起的各种疾病影响胰腺不同的隔间。fda糖尿病(DM)是最常见的内分泌疾病伴随着越来越流行在所有的工业化国家25,26]。虽然不同亚型的DM显示extrapancreatic代谢失调的不同方面,他们都表现出内β细胞功能障碍作为一个关键组件。糖尿病1型的特点是产生胰岛素的丧失β肽由于自身免疫性破坏或功能障碍,而2型是由胰岛素抵抗和胰岛素分泌降低。此外,其他形式的DM可能是由于基因突变影响胰腺癌发展或函数。在体外分化已经增加我们的理解胰腺癌发展和疾病的潜在机制可以按时间顺序研究在一个高度的方式定义的。

2.1。监管的胰腺分化

ESCs港口一个复杂和严格监管的信号网络来维持增殖和未分化状态在活的有机体内。转录因子OCT4、SOX2 NANOG控制多能性因子和抑制lineage-specific基因的表达(27- - - - - -29日]。这些内在干细胞监管机构与高度交互的信号通路促进自我更新以响应FGF或TGF等外在因素β(30.,31日]。为了促进和维护这人为多能性状态在体外ESCs和馈线上培养的细胞的细胞则如小鼠或大鼠胚胎成纤维细胞为细胞提供一个矩阵附件和基本生存和增殖信号提示,需要额外补充基本FGF和血清血清(或更换)32,33]。另外,馈线细胞可以通过细胞外基质取代组件和支持多种生长因子培养基代替在体外细胞生长(34]。

为进一步在体外胚胎发育分化,已经可以概括产生胰腺细胞。在活的有机体内,多能细胞内细胞团形成的三个主要的胚芽层与endo -胚胎,中间,和外胚层35]。第一个分支对胰腺血统的承诺是规范到德来自最前原条调制Wnt区域,节点,BMP信号(36,37]。在体外,这个信号与GSK3 Wnt3A或模仿β抑制和TGFβ配体激活素A诱导的表达典型的细胞标记SOX17, FOXA2,趋化因子受体CXCR4和c - kit (11,38]。原肠胚形成后,德形成原肠管前后模式下导致机关规范,背侧和腹侧胰芽形成后的前肠域(36,37]。除了内在的内皮细胞信号,模式也由外在信号从周围的细胞外基质和中胚层细胞如胰腺间质、脊索、背主动脉(39]。在体外,这些过程重现FGF信号和后续治疗与视黄酸平行BMP信号抑制通过‘诺金’或LDN193189 [11,12,15,38,40]。此外,嘘信号阻塞PDX1 SANT-1导致细胞表达,PTF1A, HNF6 FOXA2,胰腺内胚层阶段达到[12,15,41]。在活的有机体内,多功能的胰芽由胰腺祖细胞,在随后的形态发生产生更多的胰腺细胞类型。进一步扩张的胰腺祖细胞池由FGF10-induced扩散PDX1表达式,NKX6.1, SOX9、CPA1, PTF1A, FOXA2胰腺祖细胞阶段(41- - - - - -43]。同时,Notch信号在多个阶段起着重要的作用;然而,精确的调节在人类胰腺癌发展并不完全理解。在老鼠中,微分Notch信号早期胰腺内胚层被认为作为一个看门人祖放大和差异化之间防止过早外分泌和内分泌细胞的分化和维护胰腺祖细胞(44,45]。此外,Notch信号似乎参与管道规范提供了一个广泛的提示在不同细胞类型的确定45]。

分析的更成熟的阶段在体外胰腺祖细胞可以进一步分化,获得β肽。然而,目前内分泌分化协议为单层/ 2 d文化非常有效和收益不仅仅是一个不成熟或混合人口polyhormonal内分泌细胞(41]。此外,在葡萄糖刺激胰岛素分泌,先决条件的β肽,不在40,41]。然而,这些细胞移植到免疫缺陷小鼠产生成熟β肽表明过早在体外表型(12,46]。图1描述了不同的分段阶段在体外胰腺内分泌分化人类ESC的典型图像行HUES8(图1(一))。对于这个细胞系,我们采用差异化协议从我方实验室(7,17(图)导致polyhormonal细胞1 (b))。

新在体外分化的协议包括一个3 d文化导致glucose-responsive步骤是有前途的β例如细胞。这三个目前的胰腺和最有前途的协议β细胞分化也进行比较(见表1):在协议改编自Pagliuca et al。13)和拉斯等。15)描述一个悬浮培养系统与转轮烧瓶和轨道振动器,分别Rezania et al。14]在单层细胞开始分化,改变胰腺癌内胚层的气液界面培养阶段。各种stage-specific分化方案的信号通路调节这些最近的协议(13- - - - - -15总结在图2也描述了各自的期间表达的转录因子和细胞标记在体外分化(5,47,48]。此外,图3给出了总结stage-specific生长因子、小分子和点在不同阶段的不同的术语胰腺内分泌分化。

诱导的内胚层和原肠调制管的常用苯丙酸诺龙和Wnt信号随后FGF家族蛋白质FGF7受雇于这三个协议。此外,麻醉品协议应用维生素C在早期阶段(d3-10);嘘和BMP抑制剂,PKC激活(蛋白激酶C),和视黄酸后,原肠管阶段和补充甲状腺激素的媒体,表皮生长因子受体配体betacellulin,肝素,切口抑制剂在后期的生成功能β肽。梅尔顿实验室的差异化协议包括相似的生长因子和小分子如麻醉品协议所示。另外,切口抑制PP2阶段后使用。Hebrok实验室,德是诱导同样跟着FGF信号结合TGF的抑制β信号。此外,到达肠道后管阶段,视黄酸添加仅三天之后,表皮生长因子的刺激信号和FGF信号到细胞成为胰腺祖细胞。这个阶段是紧随其后的是BMP信号,抑制PKC激活,继续FGF信号对内分泌祖细胞分化。最后的成熟功能β肽在媒体上没有进行任何额外的生长因子。

为所有三个协议,分化条件的优化导致大量PDX1的一代⁺/ NKX6.1⁺double-positive胰腺祖细胞似乎有必要增加内分泌分化导致更多的功能β肽。而Hebrok提供了3周的短期协议,麻醉品和梅尔顿ESCs区分为4 - 5周的诱导功能β例如细胞。总的来说,所有协议导致NKX6.1比例高⁺/ PDX1⁺细胞,至少有25%的细胞双阳性PDX1胰岛素和c -肽。此外,β例如细胞分泌胰岛素后血糖的挑战在体外后,移植到老鼠,人类发现c -肽2周内支持的一个更成熟的阶段β——比在2 d细胞分化的文化。

这些新的胰腺差异化协议表明,三维培养条件促进成熟和完善的功能在体外生成的β肽。在体外胰腺的分化与尸体已经被提供了一个有前途的替代治疗糖尿病胰岛再生医学。例如,使用胰腺内胚层细胞来源于一个hESC 1型糖尿病治疗临床试验目前正在测试在美国(NCT02239354)[49]。虽然在体外胰腺分化似乎承诺模型胰腺疾病,需要克服限制用于再生医学。到目前为止,当前协议缺乏标准化仅供多个细胞系和导致过早β肽。此外,扩大以及维护过程β肽的文化将是有用的,以满足治疗的需要。然而,新技术的封装在microdiscs结合胰岛素生产细胞在体外生成的β肽将提前1型糖尿病患者的治疗50]。

2.2。已经被模型胰腺遗传性疾病和糖尿病

更好的协议不仅提供工具来生成β——细胞还提供一个有价值的平台,胰腺疾病和发展模式,描述stage-specific某些基因的作用。此外,基因组编辑CRISPR / Cas9-mediated淘汰赛,校正感兴趣的基因(51,52),或针对疾病的万能的生成9)结合瀑样技术是伴随着许多潜在的应用程序(53,54]。基于前面提到的差异化协议,β肽是由万能干细胞生成的1型糖尿病(近年来)患者学习功能以及抗糖尿病的药物反应(55]。虽然近年来β细胞功能类似于非糖尿病患者β肽,发达应力模型对药物筛选和发现可能有用的平台。最近的工作从史等人使用CRISPR / Cas9-edited hPSCs调查multigenic人类的特征与新生儿和成人型糖尿病(56]。失去一个GATA6等位基因被证明影响胰腺分化和glucose-responsive的形成β肽。此外,该模型揭示了一个复杂的基因与GATA4扩展应用程序的交互描述遗传修饰符等疾病T2D和确定新的治疗目标。同样,万能胰腺发育不全患者窝藏GATA6突变是分化探讨胰腺发育缺陷显示GATA6内胚层形成过程中扮演着重要的角色和功能β肽(57]。麦格拉思等人调查的角色neurogenin3 (NGN3)在人类胰腺内分泌发展(58]。在老鼠身上,NGN3内分泌细胞类型的发展是至关重要的;然而,据报道NGN3突变患者仍无条理的开发功能性胰腺。完整的淘汰赛的NGN3为导致对胰腺祖细胞分化但不是内分泌细胞。在为其siRNA-mediated击倒,其余NGN3足以满足一代的内分泌细胞表明突变患者导致减少NGN3蛋白功能性胰腺内分泌活动和发展。此外,发展中的新方法来区分hPSCs方向β肽在微流体设备将有助于提供自动化和高通量药物筛选系统和特定病人的治疗59]。

更多的功能分析、瀑样已经被允许生物过程的研究和组织反应。最近,万能囊性纤维化患者(CF)是用来描述囊性纤维化跨膜电导调节的影响(雌性生殖道)在胰腺的承诺和模型胰腺方面的疾病54]。CF患者诱导已经显示没有改变胰腺癌发展;然而,CF胰腺瀑样反映这些患者典型的CFTR缺陷检测功能。概念证明,这些CF CFTR瀑样被用来屏幕检测校正技术和催化剂提供一本小说平台PSC-based治疗的药物筛选和测试程序。

2.3。胰腺导管腺癌

胰腺导管腺癌(PDAC)代表一个最致命的恶性肿瘤(60]。胰腺前体病变如胰腺上皮内瘤(PanIN)由慢性胰腺炎引起PDAC发展(61年]。高死亡率和发病率增加PDAC需要更有效的治疗方法,更好地了解病理学。然而,合适的体外模型胰腺的失踪。由于转化细胞系不能概括本机器官和发育的复杂性,遗传和生理差异在动物模型中表现出其局限性[53,62年),已经被疾病建模提供一个有价值的工具进一步阐明疾病的细胞和分子机制。

2.4。在PDAC Tumor-Derived瀑样研究

开创性工作建立肠道瀑样系统是由群赫希等人,Yui et al。63年,64年]。在最初确定的肠道干细胞标记(Lgr5就),该组织对胰腺转移这一发现:在生理条件下,Lgr5就不是表达胰腺,但条件下造成的机械损伤,表现为阳性细胞Lgr5就再生的摇篮。亦然,Huch等人能够证明Wnt-agonistic R-spondins不仅诱导表达Lgr5就从初级小鼠胰腺组织细胞培养也有助于维持胰腺瀑样增长从成年小鼠导管细胞三维矩阵(65年,66年]。

PDAC,各种模型系统,要么基于不同肿瘤细胞系转基因小鼠模型(GEMMs)或异种移植模型,建立了在过去几年。研究在这些平台上增加我们的理解基本的肿瘤发生的基因,肿瘤进展和转移的形成。然而,所有这些暗示相关限制对特定病人的疾病建模精度的程度,治疗药物筛选。任何事先肿瘤模型无法模拟肿瘤异质性,而且也缺乏肿瘤和特定病人的治疗反应的微环境,代表了一个主要障碍。因此,模型系统的低复杂度无法预测给每位患者治疗反应,而更复杂的系统,如patient-derived异种移植需要12个月直到达到足够成熟67年- - - - - -69年]。PDAC,相关比例的患者才会生存个体治疗筛选平台建立。另一方面,GEMMs能够模仿人类PDAC的关键特性,尤其是肿瘤起源复合物PanIN病变(70年]。尽管GEMMs导致放大我们的理解的PDAC的关键特性,针对疾病的特点在药物输送,这种疾病的方法建模不合并方面的个性化医疗。

为了克服这些限制,瀑样从人类PDAC肿瘤组织生成成功。瀑样可以来源于成熟、健康的组织类型,如肠,前列腺,肝脏和胰腺(65年,66年,71年,72年)以及改变癌组织(73年- - - - - -75年]。瀑样文化中一个关键特性是他们定义增长的陷害下附件unphysiological表面导致三维文化包括cell-driven干细胞自我更新和自我组织。瀑样甚至可以包含不同的细胞类型,从而呈现一个复杂的器官结构76年]。瀑样来自成熟的主要组织不包含结缔组织类型(基质或间充质细胞类型)。因此,这个赤字必须补偿的细胞外膜状般的地下室矩阵包含层粘连蛋白,胶原和蛋白聚糖。瀑样来自健康组织相比,这些来自PDAC样本(人类tumor-derived瀑样,hTOs,见图4)主要是像PanIN病变3 d文化条件下甚至瀑样开始的时候(75年]。为了生成的胰腺肿瘤3 d瀑样,或健康组织瓦解机械和/或胶原蛋白与胶原酶随后嵌入或人工基底膜矩阵。持续增长,瀑样必须补充生长因子和调节器如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子,‘诺金’,Wnt3A,胃泌激素、烟酰胺、n -乙酰半胱氨酸常R-spondin,筛选抑制剂(75年]。其他协议包括胰岛素、氢化可的松,抗坏血酸,视黄酸,纤维母细胞生长因子2,岩瀑样抑制剂的培养基(20.]。

有针对性的DNA测序显示重要的肿瘤相关基因的突变喀斯特,TP53,SMAD,CKDN2A,别人在hTOs而不是从健康的病人(hNOs)[瀑样75年]。一旦移植到裸体(ν/ν老鼠,人类tumor-derived瀑样将形成浸润性癌在短短几个月内,诱导强烈多反应与stroma-rich微环境(77年]。此外,进步的关键基因调节PDAC也可以在这些肿瘤中发现,强调与hTOs疾病建模的能力。为了预测临床行为,PDAC分为古典和quasi-mesenchymal (QM)亚型基于基因表达数据的肿瘤样本(78年]。自hTOs达到肿瘤高纯度文化(79年],转录组和功能分析可以细化分类。Seino等人发现了三个新功能亚型根据hTOs依赖干细胞利基因素Wnt和R-spondin可以帮助预测临床行为或治疗方案(80年]。同时,古典亚型并不代表在PDAC细胞系模型,hTOs允许文化两种亚型(78年]。此外,Tiriac等人发现了两个特定分子亚型与古典和QM亚型但描述独特的基因表达程序强调的好处hTOs PDAC亚型的识别签名。

有趣的是,只有胰管细胞而不是内分泌或腺泡的细胞能够形成瀑样(65年,75年]。hNOs, hTOs专门表达导管细胞的标记,而不是其他的胰腺癌细胞系。此外,再生β在胰岛新生肽发生自复制的剩余β肽(81年]或α细胞转化(82年),这表明胰腺干细胞位于导管组织。这也反映在的增殖潜力Doublecortin-like激酶1 (Dclk1)⁺小鼠胰腺细胞中发现的。这些静止细胞主要居住在胰腺导管上皮细胞在一个健康和损伤和炎症期间可以促进组织再生。此外,Dclk1⁺细胞形成瀑样瀑样的持续增长和可能发挥作用的癌症干细胞或肿瘤起源细胞(83年]。在成人胰腺组织,一个族群醛脱氢酶的活动显示了潜在的高瀑样扩张更有限的再生能力相比瀑样来自小鼠胰腺组织(84年]。更好的理解特定的因素和维持干细胞的信号人口文化将有助于从人体组织产生长寿瀑样。

Tumor-derived瀑样与持续保持给定的肿瘤表型的能力进步到局部侵袭性和转移性癌原位移植(75年]。目前,hTOs的价值在预测一个特定的反应截然不同的治疗机制也有待确定;然而,目前的工作在其他胃肠道癌症是有前途的85年]。最近的出版物已经实现hTOs作为筛选平台的评价新的治疗策略在胰腺癌:Kumar等人,都不能显示噪音瀑样增长有限的hTOs化学MAPK-interacting蛋白激酶的抑制诱导后的逆转EMT (epithelial-mesenchymal产品化)(86年]。Seino等人指出干细胞利基因素的损失(Wnt)依赖瀑样源自进步肿瘤亚型,允许一个新颖的见解利基/基质癌症相声[80年]。

随后的临床应用,可以生成hTOs小病人样本的细针吸活组织必须获得大多数患者在常规诊断胰腺癌的87年]。瀑样模型更高的复杂性涉及coculture瀑样基质和肿瘤病人的免疫细胞组件为了模拟肿瘤微环境(88年]。这个模型部分地解决癌症相关的成纤维细胞和免疫之间的相互作用与肿瘤细胞浸润。因此,它可能会提供一个更准确的patient-derived瀑样模型测试的药物反应和允许PDAC评价免疫治疗的效果。

尽管瀑样提供的有前途的希望文化,仍存在若干局限性:首先,大部分的研究,特别是在胰腺,无法集成免疫和基质组件,而这些因素都是药物反应和药物清除的关键调节器(88年]。这些组件的任何公司在临床大规模筛选仍然代表了一个技术挑战。第二,临床预测在活的有机体内药物浓度的基础上在体外瀑样文化中使用药物的浓度仍然不精确:执行IC50每个药物和每个病人测量绝对是不切实际的细胞在临床环境中主要是由于有限的可用性和时间限制引起的早期临床决策的必要性。此外,参考曲线确定一定的IC50将预测病人反应尚未公布。令人惊讶的是,尽管十年瀑样的“重生”的故事,他们在临床前研究中,使用以下基本技术、机械的问题还没有回答或标准化:什么是最有代表性的瀑样的适当大小的肿瘤药物反应?多久瀑样必须暴露于药物来模拟drug-tumor反应?最后,一个需要解决的核心问题是肿瘤本身的进化和收购治疗期间产生耐药性。当前设置的瀑样药物筛查只允许瀑样分析来自以前的疾病状态。的确,在临床看来,病人总是接收第一行化疗(例如PDAC FOLFORINOX或吉西他滨+ PACTITAXEL)前瀑样文化将达到用于药物筛选。因此,可能的药物引起的耐药机制仍将无法访问瀑样屏幕从单一活检。一个新颖的方法来解决这些限制是最近发布的Tiriac et al。organoid-based基因表达特征的系统分析与临床应对不同的治疗机制79年]。此外,瀑样抗临床化疗改善反应调查和靶向制剂提供替代治疗方案在一个合理的时间表。这种方法使一个更精确的PDAC亚型分类相结合。同时,足够瀑样和病人反应之间的相关性还有待改进。重复肿瘤活检在一个病人可能更充分的因素肿瘤病程中的演变,并结合治疗,基因组和转录组organoid-based剖析可能提高目前个性化医疗的策略。另一项研究使用液体活检显示,一些突变出现迅速在对治疗的反应89年]。已经提出一些附加的方法解决这个问题:首先,使用“最小”中选择最积极和利基factor-independent瀑样肿瘤(80年]。第二,建立瀑样可能是直接从执行循环肿瘤细胞(ctc) [90年,91年),即使ctc的隔离仍然是具有挑战性的。

综上所述,最新数据表明,瀑样代表的一个最有前途的工具取得重大进展预测病人的药物反应和更好的描述肿瘤恶化的潜在机制。针对病人的筛选平台个性化的机会与一个潜在的治疗策略,评估治疗选项在肿瘤恶化的后阶段代表了这种方法的一个重要优势与有限的侵袭性有关。然而,很多程序上的改进要求达到最优使用在临床方法。

3所示。结论

关于iPSC / ESC-based瀑样技术,取得了显著的进展在最近的过去。胰腺瀑样生物学的飞速发展的技术进步是实现通过一个复杂的优化胰腺差异化协议。在这一过程中,在体外差异化协议ESCs的人类适应了知识获得鼠标发展生成各种功能性胰腺细胞类型在一个瀑样的文化。然而,尽管优化使用不同的小分子和生长因子以及ESC悬浮培养提高β细胞分化、协议发现,而独家为特定细胞系。

建立tumor-derived瀑样显示了新方法的巨大希望在肿瘤发生的解剖和特定的优化治疗方案。但是,模拟特定肿瘤——(微)环境交互代表一个悬而未决的努力在这个领域。

总之,瀑样系统已经被证明促进胰腺癌研究主要进展领域特别是在糖尿病和PDAC(图5)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Meike Hohwieler和马丁•穆勒的贡献同样工作。

确认

我们要感谢哈里森·m·彭罗斯,杜兰大学的关键输入手稿。这项工作的部分资金支持来自德意志Krebshilfe (M.H.), Bundesministerium毛皮陶冶和大幅减退(BMBF;P.O.F.),勃林格殷格翰集团乌尔姆大学BioCenter(国际障碍;萨达姆政权)。

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