基于人脂肪衍生水凝胶的表征在体外ASC的生物相容性和分化

摘要

水凝胶可以作为三维支架，其组成可以定制，使几种不同类型的细胞能够附着和增殖。细胞外基质衍生水凝胶被认为是组织微环境的紧密复制。它们可以作为支架在体外组织工程是研究细胞-支架相互作用的有效工具。本研究的目的是分析脂肪来源的基质/干细胞(ASCs)和脱细胞脂肪来源的水凝胶相互作用对ASC形态、增殖、分化和DAT水凝胶微观结构的影响。首先，采用流式细胞仪、成脂/成骨分化、成纤维细胞集落形成单位和倍增时间对ASCs进行了表征。结果表明，在不同浓度的DAT水凝胶中培养21天后，ASCs仍能保持活性并表现出良好的增殖能力。将ASCs接种于DAT水凝胶中，在基质、成脂或成骨培养基中培养14或28天。成脂分化分析显示成脂标记基因的上调和细胞内油滴的积累。成骨分化显示成骨标记基因的上调和矿物沉积在DAT水凝胶。对DAT水凝胶纤维指标的分析表明，ASC的播散和分化改变了纤维在基质中的直径和排列。通过测定基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)活性，探讨DAT水凝胶重塑的可能机制。MMP-2活性在所有ASC种子样品中都可以观察到，成骨样品中MMP-2活性最高。 These findings indicate that DAT hydrogel is a cytocompatible scaffold that supports the adipogenic and osteogenic differentiation of ASCs. Furthermore, the attachment of ASCs and differentiation along adipogenic and osteogenic lineages remodels the microstructure of DAT hydrogel.

1.介绍

人体脂肪衍生的基质细胞/干细胞（ASCs）从脂肪组织通过胶原酶消化提取[1]。ASCs是多能细胞，其特点是在特定培养基中培养时能够分化为间充质细胞系细胞，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞[2，3]。在体外传统的ASC培养实验是在二维培养板上培养单层细胞[4]。然而，二维细胞培养系统的简单性带来了一个固有的缺陷，即它们不能模拟复杂的情况在活的有机体内生理上的微环境(4，五]。在努力重演在活的有机体内条件，最近的研究努力在三维（3D）系统重点培养的ASC像球体和水凝胶[五-7]。

水凝胶是通用的3D支架，其刚性和组合物可被定制，以允许一个宽范围的细胞类型的[的附着和增殖8]。水凝胶可以由天然或合成聚合物和组织的细胞外基质ECM [制备五，9]。水凝胶是按重量计其确保营养素的所有细胞和除去的细胞废物[供应充足由至少30％的水的五，10]。ECM包含水凝胶的天然组织蛋白质，和生长因子是组织微环境的最接近重复[10]。几个ECM水凝胶已成为市售的，其中大部分是从肿瘤基底膜（TBM）[衍生10]。脱细胞脂肪组织水凝胶(DAT)可以作为研究的替代ECM，因为其来源组织丰富[11，12，并积累其细胞相容性的证据[13]。DAT水凝胶及其复合材料的支持在体外ASC扩散(14和成脂分化[15-17]，并已被证明是adipoinductive支架[9，18-20.]。此外，完整的DAT支架在伤口愈合方面显示出积极的效果[21和神经修复[22]。

基于ECM的水凝胶使细胞附着自然是由于胶原蛋白的存在[23]。细胞附着通过收缩和胶原纤维的重组改变了ECM的水凝胶结构。而且，由细胞释放的基质金属蛋白酶（MMP）消化ECM蛋白质和重塑的支架[23，24]。MMPs是一个酶家族，参与形态形成、组织修复、细胞迁移和血管生成[25]。MMP-2和MMP-9消化I型胶原、IV型胶原等ECM蛋白，导致细胞迁移和ECM重构[25-27]。MMP-2在大多数细胞类型中具有组成性活性，而MMP-9活性主要在白细胞中观察到[25，27]。MMP-2表达在的ASC被观察到，其上调已经发现与增加的ASC的迁移和软骨细胞分化[相关联27-29]。

本研究旨在分析ASC- dat水凝胶相互作用对ASC形态、增殖、分化和水凝胶微观结构的影响。我们假设ASCs可以在DAT水凝胶中发生成脂和成骨分化，这可能通过随后MMP的表达重塑水凝胶的微观结构。

2.材料和方法

2.1。试剂

除非另有说明，所有试剂均购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里)或Thermo Fisher Scientific(威豪，马)。

2.2。脂肪衍生的基质/干细胞的表征

人类对asc ( 来自LaCell有限责任公司(新奥尔良，洛杉矶)的捐赠)。采用流式细胞仪、分化(成脂和成骨)、集落形成单位成纤维细胞(CFU-F)和倍增时间对合并的ASCs进行了表征。

2.2.1。流式细胞术

使用针对细胞标记包括CD3、CD14、CD31、CD45、CD73、CD90和CD105的荧光标记抗体对ASCs进行标记。流式细胞术(Gallios, Beckman Coulter;Brea, CA)根据已公布的方法[30.]。免疫表型标记选择根据已公布的2013年国际联合会脂肪治疗和科学（IFATS）和细胞疗法国际协会（ISCT）的联合推荐[3]。

2.2.2。分化

ASCs生长在细胞培养板上，在基质中达到融合度的80%。然后，在成脂培养基(AdipoQual™;LaCell有限责任公司;新奥尔良,洛杉矶; ),成骨培养基(10nm地塞米松，20mm)β甘油磷酸盐,50μM L-ascorbic酸; ）28天，与媒体进行每2-3天更换。脂肪形成和成骨分化通过油红O和茜素红染色，分别评估，根据先前描述的方法[31，32]。

2.2.3。CFU-F化验

的ASC（ ）在10cm细胞培养板上，以每板100个细胞的播种密度进行培养。培养2周后，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤3次，3%结晶紫染色30分钟。用自来水冲洗平板，计数直径大于2毫米的ASC菌落(蓝色)。CFU-F数据表示为每100个细胞的菌落数[32]。

2.2.4。增殖倍增时间

的ASC接种在6孔板中于的接种密度接种 每孔的细胞和在基质培养基中培养。每隔24小时，的ASC是使用分离的0.25％胰蛋白酶/ EDTA，染色用台盼蓝，和计数活细胞。该过程每24小时重复5天。使用下列公式为[前描述的细胞倍增时间计算33，34]: 在哪里是倍增时间，是文化时间，最后的单元号码是，和为初始单元号。

2.3。脱细胞脂肪组织水凝胶制备

脂肪组织根据已批准的IRB方案(西部IRB研究# 1138160,Puyallup WA)从LaCell LLC获得，并得到供体的书面知情同意( ; ; ， ）择期腹壁整形术。使用前面描述的方法，将三个供体的聚集脂肪组织脱细胞并转化为50毫克/毫升的预水凝胶[35]。

2.4。DAT水凝胶中ASC的活性和增殖

将ASCs接种于DAT水凝胶中，先将细胞悬浮于浓度为 ， ， ，和 每毫升细胞数( 对于每个浓度）。随后，将悬浮液prehydrogel用移液管上的细胞培养板中并在37℃下温育30分钟以形成稳定的复合物水凝胶。然后，将水凝胶基质中的媒体淹没，ASC活力和增殖进行了评估在21天的期限。

对于活细胞成像，水凝胶用PBS洗涤两次，持续15分钟，然后在calcein AM中孵育(10)μM）30分钟，最后用PBS 1小时洗涤（在37℃下进行所有温育）。Viable cells were imaged using a Cytation 5 imaging reader (Calcein; 469/525 nm; BioTek Instruments Inc.; Winooski, VT). Alamar blue assay was used to quantitatively analyze cell viability at each time point based on the quantification of reduced alamar blue fluorescence intensity [36]。将水凝胶置于阿拉玛蓝溶液(新鲜基质1:10稀释)中，于37℃下浸泡过夜。上层清液(100μ然后使用Synergy HTX multimode reader (BioTek Instruments Inc.;Winooski, VT)在540/600纳米[37，38]。

2.5。ASCs在DAT水凝胶中的诱导成脂成骨作用

使用切片中描述的方法，将ASCs以每毫升200万个细胞的浓度接种于DAT水凝胶中2.4。ASC-seeded水凝胶( ）在基质培养基(对照)、成脂培养基和成骨培养基中培养14或28天。在诱导后的第14天或第28天收集标本，通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、组织化学、扫描电镜(SEM)和明胶酶谱分析。

2.6。定量逆转录酶聚合酶链反应

所述水凝胶用液氮冷冻，并使用研钵和杵研磨。（;，德国希尔登Qiagen公司）的总RNA使用来自冷冻Mini试剂盒的粉末状水凝胶中分离。随后，mRNA表达使用的iScript™cDNA合成试剂盒（BioRad公司，赫拉克勒斯，CA）中，随后使用IQ™SYBR®绿色超级混合物（BioRad公司，赫拉克勒斯，CA）通过qRT-PCR逆转录。所有的qRT-PCR数据表示为相对mRNA表达（倍数），将其从计算出的的正常化所确定的值样品与对照的差异值(在基质中培养)。人类引物购自Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA)。引物序列如下(5) -3 ):GAPDH forward: GGCCTCCAAGGAGTAAGACC, GAPDH reverse: TGGTACATGACAAGGTGCGG;脂联素正向:AACATGCCCATTCGCTTTAC，脂联素逆向:AGAGGCTGACCTTCACATCC;FABP4 forward: TGGGCCAGGAATTTGACGAA, FABP4 reverse: GCGAACTTCAGTCCAGGTCA;PPARγ转发：AGGCGAGGGCGATCTTG，PPARγ反向:CCCATCATTAAGGAATTCATGTCATA;perilipin forward: ACAAGTTCAGTGAGGTAGC, perilipin reverse: CCTTGGTTGAGGAGACAG;1A1胶原蛋白(COL1A1)正向:CATGTTCAGCTTTGTGGACCTC, COL1A1反向:AGGTGATTGGTGGGATGTCTT;RUNX2正向:TCTGACCGCCTCAGTGATTT, RUNX2反向:AAGGACTTGGTGCAGAGTTCA;碱性磷酸酶(ALP)正向:GCCGGAAATACATGTACCCCA，碱性磷酸酶逆向:GCTCTTCCAGGTGTCAACGA;前向:TCTTCTGGGCTCAGTCAGGAT，后向:CTGGGATAGACCACTGGGCA;MMP-2正向:CAAGGAGAGCTGCAACCTGT, MMP-2反向:CCGCATGGTCTCGATGGTAT。

2.7。组织化学

水凝胶固定在4％多聚甲醛（PFA）和包埋在O.C.T.复合。水凝胶部分（5 μm)对von Kossa (ScyTek Lab, Logan, UT)进行染色，以评估成骨样品中支架的矿化情况[39]。为了分析成脂分化，我们使用4% PFA固定水凝胶，然后使用BODIPY™(2)μM) and DAPI (300 nM) staining to visualize neutral lipid droplets and nuclei, respectively [40]。von kossa染色切片的图像采集使用Aperio ScanScope(徕卡生物系统;(Wetzlar，德国)，BODIPY™染色(469/525 nm)和dpi染色(377/447 nm)水凝胶使用Cytation 5成像reader (BioTek Instruments Inc;Winooski VT)。

2.8。扫描电子显微镜

将水凝胶固定在4%的PFA中过夜，然后在分级乙醇溶液中脱水，制备样品供扫描电镜观察。然后使用DCP1临界点干燥器(Denton Vacuum Inc.;和sputter(电子显微镜科学;PA)涂上铂金4分钟。样品采用FEI quanta 3D FEG FIB/SEM (5.0 KV)成像。使用ImageJ软件(diameter terj plugin)分析50000倍放大率下的SEM图像，以确定平均纤维直径、孔径和纤维交叉截面μ米²如先前所述[41，42]。在控制中，成骨，成脂和DAT水凝胶样品观察到纤维形态指标进行了比较，DAT水凝胶（无细胞）。

2.9。明胶Zymography

通过明胶酶谱分析MMP-2和MMP-9的活性，使用之前描述的方法的修改[29，43，44]。ASC-seeded水凝胶( ）在基质、成脂和成骨培养基中培养14或28天。收集水凝胶，在冰冷的NP-40裂解缓冲液中裂解20分钟，离心16000 g;20分钟;4°C)。收集上清液，用双软骨酸法测定蛋白浓度(Pierce™BCA蛋白检测试剂盒;23225)。样品被稀释到4μg with 4x Laemmli buffer (1610747; Bio-Rad Labs, Hercules, CA) and run on the gel (10% polyacrylamide, 1.7 mg/mL gelatin) at 130 V for 120 minutes. Fetal bovine serum (FBS) was used as the positive control for MMP-2 and MMP-9. Following electrophoresis, the gels were washed twice in renaturing buffer (2.5% Triton X-100) for 30 minutes and incubated in substrate buffer (50 mM Tris HCl, 0.07% calcium chloride, 0.02% sodium azide) overnight. The gels were then stained with 0.5% Coomassie brilliant blue (30% ethanol, 10% acetic acid) for 60 minutes, followed by destaining (30% ethanol, 10% acetic acid) for 60 minutes. Consequently, white bands appeared against blue background indicating MMP-2 and MMP-9 activities. The gels were imaged using ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare; Chicago, IL), and the band areas were quantified by densitometry using ImageJ software.

2.10。统计数据

使用Prism 5软件(GraphPad, San Diego, CA)进行统计分析。所有结果均表示为 (SD)。数据分析采用Mann-Whitney检验或Wilcoxon配对带符号秩次检验。的小于0.05为所有结果有统计学意义。

3.结果

3.1。基于免疫表型、分化、CFU-F分析和倍增时间的ASC表征

通过流式细胞术分析，ASC人群表型标记CD73、CD90、CD105呈阳性(图)图1（a）)， CD3、CD14、CD31和CD45呈阴性(图)图1（b）)，与ASC的免疫表型定义一致。油红O染色证实了诱导28天后ASCs的成脂分化，细胞内脂质空泡染色阳性(图)图1（c）)。诱导28天后，茜素红染色阳性，证实成骨分化，矿沉积(图)1 (d))。ASC增殖曲线显示，从0到96小时，细胞数量增加约10倍(图)1 (e))。采用细胞计数法计算48 ~ 96小时及24小时内ASC倍增时间;平均ASC倍增时间为 小时(表S1)。CFU-F检测表明， 的ASC出镀最初的100的能够形成集落（图1 (f))。

3.2。ASC浓度对DAT水凝胶活性和增殖的影响

将不同浓度的活细胞接种于DAT水凝胶中并培养21天后，使用Calcein AM染色进行可视化(图)2(一个))。定性观察到，从第1天到第21天，在所有细胞浓度下，calcein染色的细胞数量都有所增加(图)2(一个))。将第4天至第21天各时间点减少的阿拉玛蓝的荧光强度相对于第1天的荧光强度进行归一化，以确定ASC存活率的倍增，作为增殖曲线报告(图)2 (b))。在所有细胞浓度下，ASC增殖均呈时间依赖性，在第21天增殖倍数增加 ， ， ，和 为 ， ， ，和 细胞/ mL，分别。天1和4之间，观察到在所有除了细胞浓度最高的增殖增加 细胞/ mL，其保持一致的增殖，直到第14天的ASC的增殖接种在 细胞/mL明显高于 第7天和第21天的细胞/mL。在 细胞/mL ASCs的增殖能力低于其他浓度的细胞(图)2 (b))，但可存活的ASCs分布在整个水凝胶中(图)2(一个))。因此，所有随后的ASC分化实验在此细胞浓度进行。

3.3。ASCs在DAT水凝胶中的成脂分化分析

采用qRT-PCR和BODIPY™/DAPI染色分析ASCs在3D培养中的成脂分化。qRT-PCR数据显示，在14天的样本中，脂联素、FABP4和PPAR等致脂基因被检测出来γ脂肪形成样品中显著上调（在脂肪细胞分化培养基中培养）相对于对照样品（在基质培养基中培养），而没有观察到围脂滴蛋白表达（图3(一个))。在该被脂肪生成诱导28天的样品中，脂联素的表达水平被认为是类似的对照样品，而FABP4，PPARγ，周髂素表达水平明显增高(图)3 (b))。BODIPY™/DAPI对28天asc接种的DAT水凝胶进行染色，在对照样品中显示BODIPY™信号为阴性，而在成脂样品中观察到阳性BODIPY™信号，从而确认了含有成脂细胞的中性油滴的存在(图)3 (c)和3 (d))。控制和28天培养脂肪细胞的样本的活力通过钙黄绿素AM染色确认。细胞出现在两种样品中可行的，但不同的形态，与生脂细胞转化成圆形的形态（图S1A B)。

3.4。在DAT水凝胶的ASC成骨分化的分析

采用qRT-PCR和von Kossa染色评价三维培养ASCs的成骨分化情况。分析成骨基因COL1A1、RUNX2、ALP、骨细胞素的表达。14天分化组COL1A1、RUNX2表达明显上调;相对于对照样本，碱性磷酸酶(ALP)没有显著上调，而骨细胞素(osteonectin)显著下调(图)4(一))。在28天时间点，RUNX2和ALP显著上调，与14天时间点一样，骨细胞素相对于对照组显著下调(图)4 (b))。von kossa染色切片(5μm)为28天样品提供了成骨样品中矿物沉积的证据，而在对照样品中未观察到矿床(图)4 (c)和图4（d）)。分化28天的成骨ASCs存活，与成脂样本相比具有明显的形态学特征(图)印地C)。

3.5。ASC和水凝胶纤维形态

通过SEM获得的图像被用于定性分析ASC形态（图五（一个）-五（d））和纤维形态度量的定量分析（图五（E） -五(g))。对SEM图像的分析显示，与对照和成骨标本相比，成脂ASCs呈现出明显的形态。成脂细胞呈圆形，而对照组和成骨细胞呈扁平状，覆盖面积更大(图)五(b) -五(d))。水凝胶纤维形态的（使用在50,000x放大率获取的图像）的分析显示在控制和成骨样品相对于水凝胶显著较低的平均纤维直径（图五(e))。成脂样品中纤维的平均直径与水凝胶没有显著差异;但明显高于成骨标本(图)五(e))。所有接种了asc的样品的平均孔径都低于单独使用水凝胶的样品，而成骨样品的平均孔径显著低于脂肪样品(图)五(f))。大量的纤维交叉μ米²在所有的asc种子样品中都观察到，成骨样品比成脂样品显示明显更多的纤维交叉(图五(g))。总的来说，成骨样本对水凝胶结构的改变比对照组和成脂样本要大得多。

3.6。MMP-2在正常细胞和分化细胞中的表达分析

明胶酶谱和q-RT-PCR检测MMP-2和MMP-9的表达。根据明胶酶谱的结果，在所有样品中均未检测到MMP-9的表达;然而，一个强大的Pro MMP-2和MMP-2信号被检测到(图S2A-D)。采用胎牛血清作为MMP-2和MMP-9表达的阳性对照。在FBS lane中观察到两个明显的条带，根据从lane 1的ladder中确定的蛋白大小，对应于MMP-2和MMP-9(图)S2A)。临MMP-2和MMP-2条带的光密度定量（图6（a）和6(b))显示，在28天的成骨样本中，MMP-2的表达明显高于成脂样本(图)6(c))。在14天时间点，成脂和成骨标本中MMP-2/Pro MMP-2的比值明显高于对照组，而在28天时间点成骨标本中MMP-2/Pro MMP-2的比值明显低于成脂标本(图)6(d))。MMP-2相对mRNA表达与MMP-2蛋白密度分析结果相似(图)6(e))。与对照组相比，在14天组中，成脂组中MMP-2表达明显降低，而在28天组中，成骨组中MMP-2表达明显高于成脂组(图)6(e))。

4.讨论

目前的研究表明，DAT水凝胶可以支持不同浓度下接种的ASCs的附着和增殖。在每一种测试浓度下，活的ASCs分布在水凝胶中;但在第21天时，所有样本的增殖均趋于平稳。DAT水凝胶中ASC的增殖与初播浓度呈负相关;即。，at higher concentrations, the proliferation plateaued earlier, possibly due to earlier attainment of high confluence. As hypothesized, the ASCs were successfully induced to undergo adipogenic and osteogenic differentiation. Adipogenic differentiation was characterized by robust upregulation of adipogenic marker genes and a rounded cell morphology which closely resembled the morphology of adipocytes in their physiological form. Osteogenic ASCs displayed upregulation of osteogenic marker genes along with the deposition of minerals in DAT hydrogel, a phenomenon associated with active osteoblasts. Additionally, SEM-based evaluation revealed that all ASC-seeded DAT hydrogels had lower mean fiber diameter and pore size, while a higher number of fiber intersections perμ米²与未种子的DAT水凝胶进行比较。这些数据验证了ASCs可以重构DAT水凝胶微观结构的假设。

目前的研究结果与之前的几项研究一致，这些研究表明，ASCs在DAT水凝胶中仍可存活并增殖[9，14，15，17，45]。同样，早期文献报道的ASCs在DAT水凝胶中也观察到了成脂分化。Tan等和Zhao等报道DAT水凝胶可以作为adipoinductive scaffold [16，18]。此外，data -composite水凝胶还显示出生物相容性和增脂能力。Kayabolen等人的研究表明，dato -silk丝素蛋白水凝胶在接种adipoinducduced ASCs和前内皮细胞时支持血管形成和脂肪形成[46]。张等和Brown等报道，dati -甲基丙烯酸硫酸软骨素复合物支持ASCs的成脂分化[15，17]。

PPARγ是在脂肪细胞分化的早期阶段的关键转录激活[47，48]，其被发现在两个时间点postadipogenic感应中被上调。此外，PPAR的下游目标γ包括FABP4、脂联素、周利平[47]在不同的时间点上调。然而，与已经找到DAT水凝胶早期的研究是adipoinductive为的ASC [16，18，我们没有观察到仅在基质培养基中培养的ASCs的自发成脂分化。此外，与Wu等报道的结果相反，成脂性ASCs的脂质呈多房性[。45]，其中观察到单室脂质小滴。

ASCs在DAT水凝胶中的成骨分化是一个较新的发现。虽然ASCs在细胞培养板上的成骨培养基中培养时已被证明具有成骨分化的能力[1，很少有研究关注ASCs在DAT水凝胶或其他组织来源支架中的成骨分化。然而，研究表明，植入合成水凝胶中的ASCs和骨髓间充质干细胞(BMSCs)可以发生成骨分化，从而在3D基质中沉积矿物质[49-51]。同样，我们观察到了ASCs的成骨分化，成骨标记基因的上调和矿物沉积在DAT水凝胶中。RUNX2、COL1A1和ALP mRNA表达上调与之前的研究结果一致，表明它们是成骨分化的早期至中期标志物[52]。在两个时间点，其与以前的研究结果[对比度观察到骨粘连蛋白的下调53]。然而，一些研究表明，接种在胶原支架上的未分化ASCs在第14天至28天表达的成骨细胞素水平与成骨诱导的ASCs相当[54，55]。这可能是在目前的研究骨结合相对较低的表达水平的观察潜在的原因。

通过对SEM图像的分析，我们发现ASCs的附着、增殖和分化改变了DAT水凝胶的微观结构。有人推测，水凝胶纤维结构的重塑可能是细胞附着、迁移、蛋白水解活性和/或ECM产生的结果[23]。DAT水凝胶在所有接种了asc的样品中都被观察到，因为它们比未接种的DAT水凝胶表现出更小的平均孔径和更多的纤维交叉。这些改变在DAT水凝胶纤维指标可能是ASCs的附着和迁移的结果。在植入asc的DAT水凝胶中，成骨诱导样品的纤维结构与未植入的DAT水凝胶最为明显。成骨ASCs诱导的DAT水凝胶重塑的潜在机制包括矿物沉积(von Kossa染色和SEM图像显示)和高蛋白水解活性(MMP-2诱导)。

基质金属蛋白酶降解ECM蛋白使细胞能够重塑周围的微环境[23]。在本研究中，我们主要通过MMP-2的表达来分析ASCs的蛋白水解活性，主要有两个原因:(1)前期研究发现ASCs表达MMP-2 [27，29]，和（2）MMP-2消化胶原I和IV [23，26]，是DAT的两个主要结构部件[11，12，14，56]。

总之，从研究中获得的新发现包括（a）中DAT的水凝胶支持物的ASC的成骨分化，（b）中ASC附着和分化改造的DAT的水凝胶，和（c）MMP-2是DAT水凝胶重塑的电位调节器。

本研究提供的初步数据表明，ASCs和DAT水凝胶在不同培养条件下的相互作用会导致独特的支架重构，需要进一步的研究来扩展这些初步观察。尽管MMP-2表达谱提供了支架重塑的可能机制的指示，但需要对MMP的整体活性进行更详细的描述。此外，随着ECM的降解，新的ECM的沉积是支架重塑的一个重要方面。由于目前的研究将其分析局限于矿物沉积，对ECM合成、重塑和修饰的额外评价是必要的。最后，之前的研究表明，在更硬的支架上可以观察到更好的成骨和成骨细胞活性[57，58]。因此，提高DAT水凝胶硬度和随后的骨传导潜力的化学交联策略值得评价。

5.结论

本研究表明，DAT水凝胶是一种细胞相容性支架，支持ASCs的成脂和成骨分化。此外，ASCs的附着和沿成脂系和成骨系的分化改变了DAT水凝胶的原纤维结构。虽然DAT水凝胶的脂化和脂导性质在文献中已经被证实，但其成骨特性相对较新。需要对DAT水凝胶进行进一步的研究，以区分支架的可能的骨诱导和/或骨传导特性。总之，目前的发现证实了DAT水凝胶可以作为一个有用的三维模型进行研究在体外细胞支架相互作用和组织工程应用。

数据可用性

这些调查结果所需的原始/经处理的数据可通过与Omair A. Mohiuddin (omohiudd@tulane.edu，omair.anwar@yahoo.com)。

的利益冲突

Jeffrey M. Gimble博士是LaCell LLC、Obatala Sciences Inc.和Talaria antibody Inc.的共同所有者和联合创始人。他是LaCell LLC和Obatala Sciences Inc.的首席科学官，也是国际脂肪治疗与科学联合会的董事会成员。他是脂肪细胞和组织临床转化相关专利的发明人。

致谢

为研究经费是由肌肉骨骼移植基金会提供。我们要谢天谢地感谢艾伦·塔克在杜兰大学的流式细胞仪核心实验室，他与流式细胞分析的帮助;萨拉铝加德班博士在杜兰大学的中心干细胞研究和再生医学为她的酶谱分析的帮助;和冬梅曹博士和英西澳在路易斯安那州立大学的共享仪器设备对他们与SEM样品制备和成像的帮助。

补充材料

表S1：ASC倍增时间;基于从24到96小时细胞培养物中的活细胞计数。图S1：活力和接种在DAT水凝胶的ASC的形态。（A-C）之后在基质介质（A），脂肪形成培养基（B）培养28天对DAT水凝胶接种钙黄绿素AM染色的ASC，和成骨培养基中（C）的代表性图像。比例尺1000 μ米图S2：检测MMP-2使用明胶酶谱的。（A）含有标准蛋白质梯，阳性对照为MMP-2和MMP-9，第14天的控制，和脂肪形成样品明胶酶谱的图像。（A-d）频带为Pro MMP-2和MMP-2在基质，成脂，及成骨样品培养14位和28天的样品进行检测。（补充材料）

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