1。介绍
人类脂肪基质干细胞/(对asc)从脂肪组织中提取的胶原酶消化(
1 ]。对asc是多功能细胞,分化为间充质细胞谱系的能力,包括脂肪细胞,成骨细胞,软骨细胞在特定的媒体培养配方(
2 ,
3 ]。
在体外 ASC文化实验通常执行的单层细胞生长在二维(2 d)文化板块
4 ]。然而,简单的二维细胞培养系统提供了一个固有的缺陷,他们不模拟复杂
在活的有机体内 生理上的微环境(
4 ,
5 ]。以概括
在活的有机体内 条件下,最近的研究工作都集中在培养对asc在三维(3 d)系统,如球状体和水凝胶(
5 - - - - - -
7 ]。
水凝胶是通用的三维支架的刚度和组合可以定制允许附件和扩散范围广泛的细胞类型(
8 ]。水凝胶可以从天然或合成聚合物生产和组织细胞外基质(
5 ,
9 ]。水凝胶是由至少30%的水的重量,保证充足的营养供应所有细胞和清除细胞废物
5 ,
10 ]。ECM水凝胶组成的本地组织蛋白质和生长因子的最亲密的复制组织微环境(
10 ]。几个ECM水凝胶已成为商业上可用的,其中大多数是来自肿瘤基底膜(TBM) [
10 ]。水凝胶的脱细胞脂肪组织(DAT)可以作为一个替代ECM的研究,由于来源丰富的可用性组织(
11 ,
12 和越来越多的证据的cytocompatibility
13 ]。DAT水凝胶及其复合材料的支持
在体外 ASC扩散(
14 和脂肪形成的分化
15 - - - - - -
17 ),已被证明是adipoinductive支架(
9 ,
18 - - - - - -
20. ]。此外,完整的DAT支架已经显示出积极的结果在伤口愈合
21 和神经修复
22 ]。
ECM-based水凝胶允许附件的细胞自然由于胶原蛋白的存在
23 ]。细胞收缩附件改变ECM凝胶体系结构和重组胶原原纤维的。此外,基质金属蛋白酶(MMP)发布的细胞消化ECM蛋白质和改造支架(
23 ,
24 ]。基质金属蛋白酶是一个家族的酶参与形态发生,组织修复,细胞迁移和血管生成
25 ]。第四MMP-2 MMP-9消化我胶原蛋白,胶原蛋白,和其他ECM蛋白质,导致细胞迁移和ECM重塑
25 - - - - - -
27 ]。虽然MMP-2由活跃在大多数细胞类型,观察MMP-9活动主要是观察白细胞(
25 ,
27 ]。MMP-2表达对asc一直在观察,其upregulation被发现与移民的增加对asc和chondrogenic分化
27 - - - - - -
29日 ]。
本研究的目的是分析ASC-DAT水凝胶的影响相互作用对ASC形态、增殖、分化、和水凝胶的微观结构。我们假设对asc DAT水凝胶可以接受脂肪形成的和成骨分化,这有可能改变水凝胶的微观结构通过随后的MMP的表达。
2。材料和方法
2.1。试剂
所有试剂都是购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯或热费希尔科学(沃尔瑟姆,MA),除非另有说明。
2.2。脂肪基质干细胞特性
人类对asc (
n
=
3
捐助者)收到LaCell LLC(新奥尔良,洛杉矶)。对asc池(通道2)使用流式细胞仪的特点,分化(脂肪形成的和成骨的),克隆形成unit-fibroblast (CFU-F)试验,和倍增时间。
2.2.1。流式细胞术
对asc和fluorophore-conjugated标记抗体细胞标记包括CD3、CD14、CD31、CD45、CD73, CD90、CD105。对asc标记流式细胞术分析(不负责任的人,贝克曼库尔特;沥青,CA)根据公布的方法(
30. ]。Immunophenotypic标记选择基于国际联合会的共同推荐脂肪治疗和科学(IFATS)和国际社会的细胞治疗(ISCT)在2013年出版
3 ]。
2.2.2。分化
对asc种植在基质细胞培养板80%融合媒体。此后,他们培养的脂肪形成的媒体(AdipoQual™;LaCell有限责任公司;新奥尔良,洛杉矶;
n
=
3
),成骨的媒体(10 nM地塞米松,20毫米
β 甘油磷酸盐,50
μ M L-ascorbic酸;
n
=
3
28天),每2 - 3天媒体所取代。脂肪形成的和成骨分化重组评估油红O和茜素红染色,分别根据先前所描述的方法(
31日 ,
32 ]。
2.2.3。CFU-F化验
对asc (
n
=
3
镀)在10厘米细胞培养板上播种密度每盘100个细胞。的细胞培养2周后,盘子都洗3次磷酸盐(PBS)和沾3%结晶紫30分钟。板是用自来水洗净,ASC殖民地(蓝色)大于2毫米直径计算。CFU-F数据表示为殖民地的数量每100个细胞播种(
32 ]。
2.2.4。核扩散和倍增时间
对asc被播种在6-well播种密度板
1
×
10
4
在媒体间质细胞每口井和培养。每24小时,对asc分离用0.25%胰蛋白酶/ EDTA与锥虫蓝染色,活细胞数。这个过程是重复每24小时5天。细胞倍增时间像之前描述的那样使用以下方程计算(
33 ,
34 ]:
(1)
DT
=
CT
×
ln
2
ln
Nf
/
倪
,
在哪里
DT
倍增时间,
CT
是文化的时间,
Nf
是最后的手机号,然后呢
倪
是初始细胞数量。
2.3。水凝胶制备脱细胞脂肪组织
脂肪组织是来自LaCell LLC在IRB批准协议(西方IRB研究# 1138160,Puyallup WA)以书面知情同意从捐助者(
n
=
3
;
身体质量指数
=
24.56
±
2.52
;
年龄
=
50
±
5.7
,
的意思是
±
标准
偏差
)择期腹壁整形术。集中三个捐助者脱细胞的脂肪组织和转换到一个prehydrogel(50毫克/毫升)使用前面描述的方法(
35 ]。
2.4。ASC可行性和DAT水凝胶中扩散
对asc被播种在DAT水凝胶先暂停prehydrogel中的细胞的浓度
0.25
×
10
6
,
0.5
×
10
6
,
1
×
10
6
,
2
×
10
6
细胞每毫升(
n
=
4
每个浓度)。随后,prehydrogel悬浮液用移液器吸取在细胞培养板和孵化37°C 30分钟,形成一个稳定的复合水凝胶。水凝胶被淹没在基质媒体,ASC可行性和扩散是21天的时间进行评估。
对于活细胞成像,水凝胶与PBS 15分钟洗两次,其次是孵化在钙黄绿素(10
μ 米)30分钟,最后用PBS 1小时(孵化项目都在37°C)。可行的细胞成像使用Cytation 5成像阅读器(钙黄绿素;469/525 nm;BioTek仪器公司。Winooski VT)。Alamar蓝试验被用来定量分析细胞生存能力在每个时间点量化的基础上减少Alamar蓝色荧光强度(
36 ]。水凝胶被淹没在alamar蓝色的解决方案(1:10稀释的新基质媒体)一夜之间在37°C。上层清液(100
μ L)然后使用协同HTX分析多模读者(BioTek仪器公司。Winooski, VT)在540/600 nm (
37 ,
38 ]。
2.5。脂肪形成的对asc和成骨诱导DAT水凝胶
对asc被播种在DAT水凝胶的浓度为每毫升200万个细胞,使用部分中描述的方法
2。4 。ASC-seeded水凝胶(
n
=
6
)培养基质媒体(控制),脂肪形成的媒体,和成骨的媒体14或28天。样本收获14天或28 postinduction和分析定量逆转录酶聚合酶链反应(存在),组织化学,扫描电子显微镜(SEM),明胶zymography。
2.6。定量逆转录酶聚合酶链反应
水凝胶与液态氮冷冻,用研钵和研杵研磨。总RNA是孤立于水凝胶粉使用RNeasy®迷你包(试剂盒;希尔登,德国)。随后,信使rna是反向转录使用iScript™互补脱氧核糖核酸合成装备(BioRad大力神,CA),其次是中存在使用智商™SYBR®绿色超级混合(BioRad大力神,CA)。所有存在的数据表示为相对mRNA表达(褶皱),计算的
Δ
Δ
Ct
值取决于正常化
Δ
Ct
值区分样本的控制(在媒体基质培养)。人类底漆集购自集成DNA技术(美国IA珊瑚镇)。引物序列如下(5
′
3
′
):GAPDH转发:GGCCTCCAAGGAGTAAGACC GAPDH相反:TGGTACATGACAAGGTGCGG;脂联素转发:AACATGCCCATTCGCTTTAC,脂联素逆转:AGAGGCTGACCTTCACATCC;FABP4转发:TGGGCCAGGAATTTGACGAA, FABP4逆转:GCGAACTTCAGTCCAGGTCA;PPAR
γ 转发:AGGCGAGGGCGATCTTG, PPAR
γ 反向:CCCATCATTAAGGAATTCATGTCATA;perilipin转发:ACAAGTTCAGTGAGGTAGC perilipin逆转:CCTTGGTTGAGGAGACAG;胶原蛋白1 a1 (COL1A1)转发:CATGTTCAGCTTTGTGGACCTC COL1A1相反:AGGTGATTGGTGGGATGTCTT;RUNX2转发:TCTGACCGCCTCAGTGATTT RUNX2逆转:AAGGACTTGGTGCAGAGTTCA;碱性磷酸酶(ALP)转发:GCCGGAAATACATGTACCCCA,高山相反:GCTCTTCCAGGTGTCAACGA;骨粘连蛋白转发:TCTTCTGGGCTCAGTCAGGAT,骨粘连蛋白逆转:CTGGGATAGACCACTGGGCA;MMP-2转发:CAAGGAGAGCTGCAACCTGT MMP-2逆转:CCGCATGGTCTCGATGGTAT。
2.7。组织化学
水凝胶是固定在4%多聚甲醛(PFA)和嵌入O.C.T.化合物。水凝胶部分(5
μ m)是冯Kossa (ScyTek实验室,洛根,UT)染色,评价矿化成骨的支架的样品(
39 ]。脂肪形成的差异化分析,水凝胶固定在4% PFA,其次是BODIPY™(2
μ 米)和DAPI染色(300海里)可视化中性脂滴和核,分别为(
40 ]。图像采集的冯Kossa-stained幻灯片是由Aperio ScanScope(徕卡生物系统;位于德国),而BODIPY™染色(469/525 nm)和DAPI-stained (377/447 nm)水凝胶成像使用Cytation 5成像阅读器(BioTek仪器公司。Winooski VT)。
2.8。扫描电子显微镜
样本准备SEM修复水凝胶在4% PFA一夜之间,其次是在分级脱水乙醇的解决方案。样本然后使用DCP1临界点干燥器干燥(丹顿真空有限公司;Moorestown NJ)和溅射(电子显微镜科学;哈特菲尔德,PA)镀白金4分钟。范样本成像与广达电脑3 d FEG FIB / SEM (5.0 KV)。SEM图像50000 x放大进行了分析使用ImageJ软件(DiameterJ插件)来确定平均纤维直径、孔隙大小和纤维十字路口/
μ 米2 如前所述(
41 ,
42 ]。纤维形态指标在控制、成骨、脂肪形成的DAT水凝胶样品相比DAT水凝胶(没有细胞)。
2.9。明胶Zymography
MMP-2 MMP-9活动分析明胶zymography使用前面描述的修改方法(
29日 ,
43 ,
44 ]。ASC-seeded水凝胶(
n
=
3
)在培养基质、脂肪形成的和成骨的媒体14或28天。水凝胶是收获,然后在冰冷的细胞溶解NP-40裂解缓冲20分钟和离心机(16000克;20分钟;4°C)。上层清液收集,使用bicinchoninic酸和蛋白质浓度测定试验(皮尔斯™BCA蛋白质化验设备;23225)。样本稀释4
μ g 4 x Laemmli缓冲区(1610747;Bio-Rad实验室,大力神,CA)和运行在凝胶(10%聚丙烯酰胺,1.7毫克/毫升明胶)在130 V 120分钟。胎牛血清(的边后卫)用作MMP-2积极控制和MMP-9。在复性电泳后,凝胶是洗两次缓冲区(2.5% Triton x - 100) 30分钟和孵化基质缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液0.07%氯化钙,叠氮化钠0.02%)。凝胶被沾0.5%考马斯亮蓝(30%乙醇、10%乙酸)60分钟,其次是使脱色(30%乙醇、10%乙酸)60分钟。因此,白人乐队出现在蓝色背景下指示MMP-2和MMP-9活动。凝胶成像是使用ImageQuant拉斯维加斯4000(通用电气医疗集团;芝加哥,IL),乐队被测密度术量化使用ImageJ软件领域。
2.10。统计数据
统计分析与棱镜5软件(GraphPad,圣地亚哥,CA)。所有的结果都表示为
的意思是
±
标准
偏差
(SD)。数据分析使用Mann-Whitney测试或Wilcoxon配对签署等级测试。的
p
值小于0.05被指定为统计上显著的结果。
3所示。结果
3.1。基于Immunophenotype ASC表征,分化,CFU-F化验,倍增时间
基于流式细胞术分析,ASC人口被发现阳性表型标记CD73 CD90、CD105(图
1(一) ),而不利于CD3、CD14 CD31、CD45(图
1 (b) ),与immunophenotype为ASC定义一致。脂肪形成的对asc分化后28天的感应油红O染色,证实了在细胞染色阳性细胞内脂质空泡(图
1 (c) )。成骨分化28天postinduction证实了积极茜素红染色,这说明矿物沉积(图
1 (d) )。ASC扩散曲线显示了大约十倍增加细胞数量从0到96小时(图
1 (e) )。ASC翻倍计算使用细胞计数在每个时间点从48到96小时相对于24小时;ASC倍增时间被发现
38.98
±
1.48
小时(表
S1 )。CFU-F试验表明,
35.5
±
7.7
对asc 100镀最初殖民地(图形式
1 (f) )。
图1
基于immunophenotype ASC表征,分化,倍增时间,CFU-F化验。 (a - b)直方图显示检测表面抗原标记;(一)阳性标记CD73、CD90、CD105;(b)负面标记CD3、CD14、CD31、CD45。(c)代表形象,油红O染色细胞;细胞内油滴(红色)是可见的在对asc培养脂肪形成的媒体28天(比例尺100
μ 米)。(d)代表的形象茜素红染色细胞;矿物沉积(红色)是可见的在对asc培养成骨的媒体28天(比例尺200
μ 米)。(e)增殖曲线从0 - 96小时也意味着倍增时间;
38.98
±
1.48
个小时。(f)结晶紫染色ASC殖民地的代表形象;
35.5
±
7.7
每100个细胞cfu观察种子细胞培养板和培养基质媒体14天。显示所有数据来源于3-donor-pooled;通过对asc 2。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
3.2。ASC浓度对生存能力的影响和DAT水凝胶中扩散
钙黄绿素是染色用于可视化播种时可行的细胞在不同浓度DAT水凝胶和培养(图21天期间
2(一个) )。增加calcein-stained细胞定性观察细胞浓度从1天21(图
2(一个) )。荧光强度的降低alamar蓝色在每个时间点从第四天到21天是归一化相对荧光强度在第一天来确定ASC生存能力的成倍增加,报告为一个扩散曲线(图
2 (b) )。观察时间ASC增殖细胞浓度,与在21天成倍增加
2.21
±
0.47
,
1.94
±
0.22
,
1.76
±
0.027
,
1.516
±
0.044
为
0.25
×
10
6
,
0.5
×
10
6
,
1
×
10
6
,
2
×
10
6
细胞/毫升,分别。最高的扩散增加观察天1和4之间除了细胞浓度
0.5
×
10
6
细胞/毫升保持一致的扩散到第14天。扩散对asc播种
0.25
×
10
6
细胞/ mL被发现明显高于
2
×
10
6
细胞/毫升天7和21。在
2
×
10
6
细胞对asc /毫升浓度低于其他细胞增殖(图显示
2 (b) ),但对asc可行的是分布在整个水凝胶(图
2(一个) )。因此,所有后续ASC分化实验细胞浓度。
图2
ASC浓度对生存能力的影响和DAT水凝胶中扩散。 对asc被播种在水凝胶的浓度
0.25
×
10
6
,
0.5
×
10
6
,
1
×
10
6
,
2
×
10
6
在媒体间质细胞/毫升和培养。可行性分析进行第一天(播种后1天),4天,7天,14天,21天。(一)代表钙黄绿素的图像是彩色可行的细胞(绿色);(b) ASC扩散决定从荧光强度(减少alamar蓝色)为每个时间点相对于第一天(折叠)。数据表示为的意思(
n
=
4
)±SD;水平的意义:
∗
)
p
<
0.05
;规模1000酒吧
μ m。
(一)
![]()
(b)
![]()
3.3。脂肪形成的差异化分析对asc DAT水凝胶
去分析了3 d对asc文化的存在和BODIPY™/ DAPI染色。中存在的数据显示,14日样本,脂肪形成的基因包括脂联素,FABP4, PPAR
γ 被显著调节脂肪形成的样本(在媒体去培养)相对于控制样品(培养基质媒体),虽然没有perilipin表达式观察(图
3(一个) )。在样品adipogenically诱导为28天,脂联素表达水平被发现类似于控制样本,而FABP4, PPAR
γ (图,perilipin表达水平显著高于
3 (b) )。BODIPY™/ DAPI染色的28天ASC-seeded DAT水凝胶显示负BODIPY™信号控制样本,而积极的BODIPY™信号观察脂肪形成的样品确认的存在中性油滴含脂肪形成的细胞(数字
3 (c) 和
3 (d) )。控制的可行性和脂肪形成的样品培养证实了28天钙黄绿素染色。细胞出现可行的在这两个样品但是形态不同,脂肪形成的细胞转变成一个圆形的形态(图
S1A B )。
图3
脂肪形成的差异化分析对asc DAT水凝胶。 ASC播种DAT水凝胶(2×106 细胞/毫升)中培养基质或脂肪形成的媒体14或28天,分析中存在(a, b)和BODIPY染色(c, d)。(a, b)脂肪形成的基因的表达在adipogenically诱导ASC样品后14 (a)或(b) 28天的文化是显示为褶皱变化相对于控制ASC样本。(c, d)代表图像的BODIPY / DAPI染色28天控制ASC (c)和脂肪形成的ASC (d)播种DAT水凝胶。数据表示为的意思(
n
=
6
)±SD;水平的意义:
∗
)
p
<
0.05
;规模200酒吧
μ m。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.4。分析对asc成骨分化的DAT水凝胶
对asc成骨分化的3 d文化评估中存在和冯Kossa染色。RUNX2成骨COL1A1基因的表达,高山,骨粘连蛋白进行了分析。14天分化样本显示的重要upregulation COL1A1 RUNX2;高山没有明显调节,而骨粘连蛋白被发现显著下调相对于控制样品(图
4(一) )。在28天的时间点,RUNX2和高山明显调节,如14天时间点,骨粘连蛋白被发现显著下调相对于控制样品(图
4 (b) )。冯Kossa-stained部分(5
μ 米)的28天样品提供成骨的样品中矿物沉积的证据,虽然没有矿藏控制样本(数据的观察
4 (c) 和
4 (d) )。对asc成骨分化(28天)被发现是可行的和提出不同的形态学特征相比,脂肪形成的样品(图
印地C )。
图4
分析对asc成骨分化的DAT水凝胶。 ASC播种DAT水凝胶(2×106 细胞/毫升)中培养基质或成骨的媒体14或28天,分析中存在(a, b)和冯Kossa染色(c, d)。(a, b)的表达成骨基因osteoegnically诱导ASC样品后14 (a)或(b) 28天的文化是显示为褶皱变化相对于控制ASC样本。(c, d)代表图像的冯Kossa染色组织学部分控制ASC (c)和成骨的ASC (d)的水凝胶。(d)矿床(布朗)箭头所示。数据表示为的意思(
n
=
6
)±SD;水平的意义:
∗
)
p
<
0.05
;规模200酒吧
μ m。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.5。ASC和水凝胶纤维形态
通过SEM图像被用来定性分析ASC形态(数字
5 (一)-
5 (d))和纤维形态指标(数据的定量分析
5 (e) -
5 (g))。SEM图像的分析显示,显示的对asc脂肪形成的一个独特的形态比控制和成骨的样本。脂肪形成的细胞出现圆形,而相比之下的控制和对asc成骨的出现被夷为平地,覆盖更大的表面积(数字
5 (b) -
5 (d))。水凝胶纤维形态的分析(使用图像获得50000 x放大)表现出显著降低平均纤维直径控制和成骨的样本相对于水凝胶(图
5 (e))。平均纤维直径脂肪形成的样品中没有发现明显不同于水凝胶;然而,这是明显高于成骨的样品(图
5 (e))。所有ASC-seeded样品表现出较低的平均仅比水凝胶的孔隙大小,而孔隙大小的成骨的样本均值显著低于脂肪形成的样本(图
5 (f))。纤维数量明显高于十字路口/
μ 米2 在所有ASC-seeded样品观察,成骨的样本显示纤维路口明显多于脂肪形成的样本(图
5 (g))。总的来说,成骨的样本似乎已经改变了水凝胶结构在更大程度上比控制和脂肪形成的样本。
图5
ASC和DAT水凝胶纤维形态分析使用通过SEM图像。 (模拟)代表的SEM图像DAT水凝胶(无电池)(a),控制ASC (b),脂肪形成的ASC (c)和成骨的ASC (d)播种DAT水凝胶显示在3倍的放大;1000 x(箭头表示细胞;规模50条
μ 米),2000 x(放大显示细胞形态;比例尺20
μ 米),50000 x(放大显示纤维形态;比例尺1
μ 从50000米)。纤维形态指标测定x图像使用ImageJ软件(diamterJ插件)来确定平均纤维直径(e)平均孔隙大小(f)和纤维十字路口/
μ 米2 (g)。数据表达的意思(
n
=
6
)±SD;水平的意义:
∗
)
p
<
0.05
;(
∗
∗
)
p
<
0.01
;(
∗
∗
∗
)
p
<
0.001
。
![]()
3.6。MMP-2表达式的分析控制和分化细胞
明胶zymography和q-RT-PCR执行分析MMP-2 MMP-9表达式。从凝胶zymography根据获得的结果,没有MMP-9表达式中发现任何的样品;然而,一个强大的职业MMP-2 MMP-2信号检测(图
S2A-D )。的边后卫是用作MMP-2积极控制和MMP-9表达式。两个截然不同的乐队中观察到的边后卫,对应MMP-2和MMP-9基于蛋白质的大小决定从梯子上巷1(图
S2A )。光密度量化Pro MMP-2和MMP-2乐队(数字
6 (一)和
6 (b))显示成骨的样本显示的表达显著高于MMP-2相对于脂肪形成的样本(图28天样品
6 (c))。MMP-2 / Pro MMP-2的比率明显高于脂肪形成的和成骨的样本相对于控制样品在14天的时间点,而比例显著低于成骨的样本相对于脂肪形成的样本(图28天样品
6 (d))。相对的mRNA表达MMP-2 MMP-2蛋白质的光密度分析显示相似的结果(图
6 (e))。显著降低表达MMP-2观察脂肪形成的样本相对于控制在14天的样品,在28天样品明显更高层次的观察MMP-2表达成骨的样本相对于脂肪形成的样品(图
6 (e))。
图6
分析由明胶zymography MMP-2表达和存在。 (a, b)代表图像的Pro MMP-2和MMP-2乐队凝胶电泳后观察到的(a)和(b) 28日14天样品。(c) Pro MMP-2和MMP-2乐队区是由使用ImageJ densitomteric分析软件、数据呈现褶皱变化相对于控制样本。(d)的比值MMP-2乐队区Pro MMP-2乐队区由光密度分析。(e)中存在的分析MMP2 mRNA表达控制脂肪形成的,和成骨的样本显示为褶皱变化相对于控制样本。数据表示为的意思(
n
=
6
)±SD;水平的意义:
∗
)
p
<
0.05
。
![]()
4所示。讨论
目前的研究表明,DAT水凝胶支持附件和扩散对asc播种在范围广泛的浓度。在每个浓度测试,可行的对asc是分布在水凝胶;然而,扩散达到平衡白天21在所有样本。DAT的ASC扩散水凝胶被发现最初播种浓度成反比;即。,at higher concentrations, the proliferation plateaued earlier, possibly due to earlier attainment of high confluence. As hypothesized, the ASCs were successfully induced to undergo adipogenic and osteogenic differentiation. Adipogenic differentiation was characterized by robust upregulation of adipogenic marker genes and a rounded cell morphology which closely resembled the morphology of adipocytes in their physiological form. Osteogenic ASCs displayed upregulation of osteogenic marker genes along with the deposition of minerals in DAT hydrogel, a phenomenon associated with active osteoblasts. Additionally, SEM-based evaluation revealed that all ASC-seeded DAT hydrogels had lower mean fiber diameter and pore size, while a higher number of fiber intersections per
μ 米2 观察而不结果实的DAT水凝胶。这些数据验证的假设对asc可以改造DAT水凝胶的微观结构。
当前的研究结果是一致的和几个以前的研究已经表明对asc继续生存和增殖DAT水凝胶(
9 ,
14 ,
15 ,
17 ,
45 ]。同样,去观察对asc的DAT水凝胶在早期报道出版物。棕褐色等人,赵等人报道,DAT水凝胶作为adipoinductive支架(
16 ,
18 ]。此外,DAT-composite水凝胶也显示生物相容性和adipoinductive功能。Kayabolen等人表明DAT-silk蚕丝蛋白水凝胶支持血管化和脂肪生成与adipoinduced播种时对asc和preendothelial细胞(
46 ]。张等人和布朗等人报道,DAT-methacrylated硫酸软骨素对asc复合支持去(
15 ,
17 ]。
PPAR
γ 是一个关键的转录激活因子在脂肪形成的分化的早期阶段
47 ,
48 )在两个时间点被发现调节postadipogenic归纳。另外,下游PPAR的目标
γ 包括FABP4、脂联素和perilipin [
47 在不同的时间点)是调节。但是,与先前的研究已经发现DAT水凝胶为对asc adipoinductive [
16 ,
18 ),我们没有观察到自发的脂肪形成的媒体只对asc分化培养基质。此外,脂质在对asc脂肪形成的多腔的对比研究结果报道吴et al。
45 观察),单室的脂质滴。
成骨分化对asc的DAT水凝胶是一个相对新颖的发现。虽然对asc有能力进行成骨分化成骨的媒体在细胞培养板培养(
1 ),很少有研究关注对asc的成骨分化DAT水凝胶或其他tissue-derived支架。然而,对asc和骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)播种在合成水凝胶已被证明进行成骨分化,因此沉积矿产的3 d矩阵(
49 - - - - - -
51 ]。同样,我们观察到对asc的成骨分化成骨的标记基因和矿物沉积的upregulation DAT水凝胶。RUNX2的upregulation COL1A1,高山mRNA表达与先前的研究相符,他们早期midstage成骨分化的标志(
52 ]。Downregulation骨粘连蛋白被发现在两个时间点是与先前的研究相比
53 ]。然而,一些研究表明,未分化对asc播种在胶原蛋白支架表达高骨粘连蛋白水平是与对asc osteogenically诱导从14至28天(天
54 ,
55 ]。这可能是潜在的原因观察骨粘连蛋白的表达水平相对较低,在当前的研究中。
基于SEM图像的分析,我们的数据表明,依恋,增殖,分化对asc改建DAT水凝胶的微观结构。假定,水凝胶纤维结构的重构可以导致细胞依附,迁移,蛋白水解活性,和/或ECM生产(
23 ]。DAT水凝胶重构在所有ASC-seeded样品观察,因为他们表现出较小的孔隙大小和纤维路口数量高于非种子的DAT水凝胶。这些改变DAT水凝胶纤维指标有可能对asc的依恋和迁移的结果。在ASC-seeded DAT水凝胶,osteogenically诱导的纤维结构样本被发现是最独特的相比不结果实的DAT水凝胶。DAT水凝胶的潜在机制重构引起成骨的对asc包括矿物沉积(证明了冯Kossa染色和扫描电镜图像)和较高的蛋白水解活性(MMP-2引起的)。
ECM的降解蛋白质基质金属蛋白酶允许细胞改造周围的微环境(
23 ]。在目前的研究中,我们关注MMP-2表达式分析对asc蛋白水解活性的两个主要原因:(1)对asc众所周知通过之前的研究表达MMP-2 [
27 ,
29日 ),(2)MMP-2摘要胶原蛋白我和四世
23 ,
26 ),这是两个主要的结构部件的DAT [
11 ,
12 ,
14 ,
56 ]。
总之,这部小说研究获得的发现包括(a) DAT水凝胶支持对ASC成骨分化,(b) ASC依恋和分化改造DAT水凝胶,和(c) MMP-2 DAT水凝胶的潜在调节器改造。
目前的研究提供了初步数据表明之间的相互作用对asc和DAT水凝胶在不同文化条件下导致独特的改造的支架,进一步检查有必要扩展这些最初的观察。虽然MMP-2表达谱提供的支架改造的可能机制,更详细的整体MMP的活动需要。此外,随着ECM降解,沉积新ECM支架改造的一个重要方面。从当前的研究有限的矿物沉积的分析,额外的评估ECM合成、重构,和修改是必要的。最后,以前的研究已经表明更好的骨与成骨细胞活动观察硬支架(
57 ,
58 ]。因此,化学交联策略来提高DAT水凝胶的硬度和随后的综合分析潜在的价值评估。