CD73表情间充质干细胞通过其抗炎活性决定赔偿的性质

文摘

间充质干细胞(MSC)并不普遍,可能会对当地的环境动态变化后体内和体外分离和培养。在这里,我们表明,MSC来源于小鼠心包脂肪组织(pMSC)构成两个群人口杰出CD73表达式(称为CD73水平^高和CD73^低pMSC)。两种类型的细胞移植到老鼠心脏心肌梗塞(MI)后CD73透露^高pMSC优先带来结构和功能修复PBS控制和CD73相比^低pMSC。此外,CD73^高pMSC显示明显的抗炎活动衰减CCR2⁺巨噬细胞浸润和移植一些抗炎基因体内移植后5天,与腹膜巨噬细胞体外共培养。免疫调节效应是在共培养实验中未见pMSC源自CD73基因敲除小鼠(CD73^{- / -}),但部分被A2b受体拮抗剂的预处理,PSB603。结果突出的异质性CD73表达可能与催化产品调制的局部免疫反应,从而提供一个可能的解释的不一致当不同来源供体细胞再生结果用于干细胞疗法。

1。介绍

心肌梗死(MI),通常被称为心脏病,导致的损失大约10亿心肌细胞和血管周围的破坏。成人心脏细胞一旦受损,不能取代通过自己的再生;因此,另一种形式的伤口愈合是由免疫系统(1,2]。炎症细胞迁移到受伤的心,确保有害细胞碎片的间隙和修复受损区域的纤维化瘢痕的形成(3]。虽然默认的免疫反应MI似乎确保心脏的一个快速修复,瘢痕导致病态心脏重构,随着时间的推移损害心脏功能。此外,如果最初的急性炎症反应成为慢性,宿主组织将受到持续伤害(4]。

有越来越多的证据支持的假设干细胞治疗可能通过paracrine-mediated监管工作在本地的免疫反应在受损的心脏5]。间充质干细胞(MSC)能够产生和分泌多种细胞因子,趋化因子,生长因子,可能调节过度炎症反应,心肌梗死后,构成炎性环境、细胞毒性,和随后的纤维化,扰乱了基本矩阵(6]。因此,MSC要么通过旁分泌的免疫调节特性因素,exosmotic囊泡,或其他功能上与他们的修复活动(5,7),并确定治疗体内潜在的(8]。然而,MSC之间的可变性在免疫调节方面从不同的解剖起源和生物属性往往是忽视,与MSC广泛被认为类似的抗原决定基身份和分化潜能,这意味着多个组织也同样合适的细胞来源多种组织的再生9]。

事实上,MSC池是一个异构的人口动态变化以应对当地的环境(10),可能会改变在生物体外隔离和扩张后功能(11]。此外,分离MSC甚至从同一来源显示一个异构转录心中概要文件链接到移动通信(12]。值得注意的是,MSC孤立的从不同的小鼠组织表现出不同的细胞外核苷酸代谢的能力,这一过程需要ecto-5的存在 - - - - - -核苷酸酶活性(eNT / CD73) (13]。鉴于CD73是经典的标志之一,专门定义MSC人口,因此我们假设的非均匀表达CD73 MSC可能与修缮的属性有关,细胞外腺苷酸催化的脱磷酸作用CD73活动已被证明的关键调节器局部免疫反应(14]。

在目前的研究中,我们证明了MSC源自心包脂肪组织(15),称为pMSC,贝尔的异构表达CD73, CD73-enriched pMSC有利于心脏通过抗炎修复活动。

2。材料和方法

2.1。动物实验

动物实验是实验动物保健和使用委员会批准在海军医科大学和执行按照动物保健机构的指导方针。共有52老鼠( 野生型和 ^{- / -}体重20 - 25 g和年龄8 - 12周 老鼠)在中央动物饲养设施海军医科大学和美联储的标准食物饮食/自来水随意。

小鼠模型的心肌梗塞(MI, 60分钟缺血再灌注+)诱导(如前所述)(16]。总之,小鼠气管插管麻醉,机械通风和异氟烷(1.5% )在80%的氧气/氮气20%。动物置于仰卧位,侧切的胸部打开左侧胸骨。冠状动脉左前降枝(小伙子)是由一个缝合和结扎可视化用显微镜(8 - 0聚丙烯)用软,自制的容器保护垫上方的小伙子。闭塞的成功保证心电图st段抬高的录音和心肌灌注热烫的床上。结扎是维持长达60分钟完成透壁的MI直到缝合被释放,允许再灌注。在细胞移植组小鼠心肌内的收到20μl PBS包含悬架 要么CD73^低或CD73^高pMSC两个单独的地点在梗塞区域内使用胰岛素注射器(30 G, BD)释放结扎后不久。胸部随后关闭了一层通过肌肉和第二层皮肤,然后动物断奶的通风和放置在一个温暖而富氧环境,直到他们完全恢复。

动物们准备好牺牲在两个时间点:手术后5天,28天。为期5天的动物被用于分析炎症雕像的心和28天动物结构和功能修复后心脏损伤(MI)。

心脏功能评估使用高频超音波检查发现的,高分辨率的数码影像平台小动物与一个18 - 38 MHz换能器MS400 (Vevo 2100;VisualSonics、加拿大)。简单地说,异氟烷的动物被吸入麻醉(1.5% )使用自制的面膜,和短轴在M-mode midventricular部分被收购了。存储的数据和参数分析了心脏功能的脱机使用定制的软件(VisualSonics)。

功能参数的测量后,动物被牺牲和有限公司₂心被切除。在冰冷的PBS洗一次后,心中的位置很仔细,嵌入在Tissue-Tek®(德国徕卡)进行组织学分析。

2.2。隔离间充质干细胞的各种组织

心包和皮下脂肪间充质干细胞(MSC)分离根据修改后的协议之前报道10]。总之,C57BL / 6野生型(WT)或CD73淘汰赛(CD73^{- / -}使用公司)小鼠死亡₂窒息。在无菌条件下,胸部被打开和皮下和心包脂肪组织切除。收集到的心包组织切成小块,然后转移到一个2毫升消化解决方案包含0.4%胶原酶II (Biochrom、德国)和孵化在37°C和温和的旋转(20 rpm) 20分钟停止消化之前的2毫升的FCS(美国HyClone)。结果细胞悬液在1460 rpm 5分钟出来,和细胞颗粒与基础培养基resuspended含低糖DMEM和补充30% FCS,青霉素(100 U /毫升),链霉素(0.1毫克/毫升)和谷氨酰胺(2毫米)。孤立的细胞接种到10厘米培养皿和孵化37°C公司为5%₂。附着基质血管分数被称为pMSC。细胞数量统计在一个小整除,population-doubling时间计算。

骨髓MSC (bMSC)获得小鼠和人类脐血MSC (ucMSC) (17]。总之,ucMSC被聚蔗糖梯度离心分离单核细胞从人类捐助者、bMSC获得小鼠股骨和胫骨刷新DMEM培养基。细胞悬液的过滤和镀成6-well塑料细胞培养板的密度 相似的细胞培养条件如前所述CD73表达谱的分析。

分开的两个亚种群pMSC构成不同CD73表情,轻轻在分离培养的细胞(通道1)有0.05%胰蛋白酶EDTA (Sigma-Aldrich)。与冷PBS,洗一次后 细胞每100μl悬挂和Alexa孵化萤石®488 - (AF488)共轭抗体CD73(1: 100年,BD Pharmingen)在4°C无效光10分钟。游离抗体之后,被洗两次2毫升mac缓冲区,和细胞分离CD73染色强度(荧光)的帮助下流式细胞术的核心设施的海军使用fluorescence-activated医科大学细胞排序(流式细胞仪、Moflo XDP贝克曼库尔特)(图1(一))。因此,根据CD73的表达强度,两个pMSC人口,即CD73 (CD73高表达^高)和(CD73 CD73低表达^低),是细分。排序pMSC培养与30% FCS低糖DMEM和上面提到的其他组件在37°C公司5%₂为进一步的实验。

2.3。诱导肌原性的、脂肪形成的和成骨分化

比较分化潜力,CD73^低和CD73^高pMSC通道2被播种密度 细胞/厘米²在基础培养基。脂肪形成的感应被高葡萄糖诱导脂肪形成的诱导培养基(Gibco),补充10% FCS, L-glut 1%, 1% Pen-Strep, 1μM地塞米松,1μ吲哚美辛,500μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)和10μg / ml重组人胰岛素如前所报道(15]。成骨分化诱导的成骨诱导介质(Cyagen),含10% FCS, Pen-Strep 1%, 1μ50 M地塞米松,μM抗坏血酸盐,10μ米β甘油磷酸盐。感应是维持2周之前油红O(脂肪生成)和茜素红(骨)染色。

CD73为肌原性的分化^低和CD73^高pMSC被播种密度 细胞/厘米²成eight-chamber幻灯片(Nunc)并在DMEM培养基培养。一旦subconfluence达成,肌原性的分化诱导通过改变培养基DMEM补充只有5% FCS, 5%马血清的0.1毫米5-azacytidine (Sigma-Aldrich)和0.1μM地塞米松(Sigma-Aldrich)和验证了染色的心肌肌钙蛋白T (cTnT热费希尔科学)。导出了计算百分比cTnT-positive细胞数量和细胞总数(DAPI积极)。

2.4。孤立心脏免疫细胞和流量仪的分析

五天后,老鼠被腹腔注射戊巴比妥麻醉(40 - 50毫克/公斤),和心中迅速切除和安装到Langendorff装置建立逆行灌注(100毫米汞柱,灌注压力37°C)与一个含氧介质(5分钟氯化钾氯化钠Krebs-Henseleit缓冲区:116.02毫米,4.63毫米,1.10毫米MgSO₄h·7₂啊,1.21毫米K₂HPO₄,2.52毫米CaCl₂h·2₂啊,24.88毫米NaHCO₃2.0毫米、8.30毫米葡萄糖、丙酮酸钠,含有95% O₂和5%的公司₂输液)改变消化解决方案包含胶原酶II (1400 U /毫升,Biochrom AG),柏林,德国)在磷酸盐25分钟37°C。collagenase-treated心从套管中删除和重,心房被移除。心脏剁碎,然后用移液器吸取单细胞悬液。通过100年第一次网状细胞悬液μm细胞过滤器(BD猎鹰)和离心机在55 g一分钟从noncardiomyocytes分离心肌细胞。包含noncardiomyocyte分数的上层清液再次经过40μm细胞过滤器(BD猎鹰)。最后收集细胞在mac resuspended缓冲区(2% EDTA的边后卫在PBS 1毫米)和多个fluorescence-conjugated抗体染色流式细胞术(FACSCanto II;BD FlowJo 7.6生物科学)和分析的软件。

下面的抗体被用于目前的实验:AF488或PE APC-conjugated anti-CD73 (BD Pharmingen) PE-Cy7-conjugated anti-CD45 (BioLegend) APC-Cy7-conjugated anti-B220 (BD Pharmingen) APC-conjugated anti-CD11b (BD Pharmingen) FITC-conjugated anti-CD11c (BD Pharmingen) PE-conjugated anti-CD3 (BioLegend) PerCP-Cy5.5-conjugated anti-Ly6G (BD Pharmingen) APC-Cy7-conjugated anti-Ly6C (BD Pharmingen)和FITC-conjugated anti-CCR2 (BioLegend)。

2.5。pMSC与腹膜巨噬细胞的共培养

大鼠腹膜巨噬细胞(pMϕ)是用于coculture实验以确保PCR检测。孤立的点ϕ,大鼠腹腔注射4%巯乙酸介质(20毫升)和腹膜灌洗收集注射后3天。细胞在350 g离心5分钟和resuspended DMEM培养基补充10% FCS,青霉素(100 U /毫升),链霉素(0.1毫克/毫升)和谷氨酰胺(2毫米)。为期3天的在培养皿中培养后,细胞被确认为点ϕ通过流式细胞术CD11b⁺CD11c^{- - - - - -}染色,表明超过90%的细胞CD11b⁺CD11c^{- - - - - -}细胞(数据未显示)。在对coculture实验中,0.4μm细胞插入(12-well板大小,Sigma-Aldrich)和应用 孤立的点ϕ被种植在每个12-well板块。pMSC coculture是通过添加到培养皿的比率1:2。在一些实验中,药物抑制由PSB603 A2b受体(100海里)进行了15分钟的预孵化前pMSC。细胞共培养之前保持24小时收集定量逆转录PCR(存在)。

2.6。实时定量rt - pcr

执行实时rt - pcr分析样品的细胞因子表达谱的心脏组织(5天后MI)或点ϕ共培养后。从组织和细胞总RNA分离使用RNeasy Midi设备(试剂盒)和RNeasy微工具包(试剂盒),并使用QuantiTect互补脱氧核糖核酸合成逆转录工具包(试剂盒)根据制造商的指示。所有商业引物(见下文)是购自热费希尔科学和正常工作,显示的放大图。基因分析是使用StepOnePlus进行实时PCR系统制造商的协议后,和PCR检测都是在重复执行。相对基因表达规范化GAPDH和计算使用2^Δ方法Ct值。以下引物被用于目前的实验:CD73, Mm00501910_m1;NOS2 Rn00561646_m1;il - 4, Rn01456866_m1;Arg-1 Rn00691090_m1;TGM-2 Rn00571440_m1;il - 10, Rn01483988_g1;肿瘤坏死因子-αRn01525860_g1;正,γRn00594078_m1;和GAPDH Rn01775763_g1(老鼠)和Mm99999915_g1(鼠标)。

2.7。表示细胞和Histostaining

的cytostaining CD73 pMSC,新鲜孤立pMSC被播种到室幻灯片4天直到细胞confluency达到90%。细胞被洗了,用1%多聚甲醛固定10分钟。1 h阻塞后5%正常山羊血清(门店),细胞培养2小时与主要抗体(多克隆anti-CD73)。洗后三次1% NGS-PBS缓冲区,二级FITC-conjugated抗体(山羊免疫球蛋白g, 1: 100年,圣克鲁斯生物技术)添加和孵化了60分钟。核与DAPI复染色(DAKO)和美国商会幻灯片与延长密封黄金®(生命科学)。

天狼星红染色,心脏样本嵌入Tissue-Tek切成10μ部分在midventricular级别。幻灯片在midventricular部分与苏木精染色5分钟,用自来水洗15分钟,沾1%曙红的解决方案一个额外的1分钟。经过几个步骤与75%到100%的乙醇脱水,幻灯片可以覆盖DPX安装介质。所有图片都是获得和分析使用光学显微镜(奥林巴斯BX51)。梗塞大小是源自collagen-stained心室壁的比例与总周长。

2.8。统计分析

数据了 偏差(SD)。一个学生 - - - - - -测试与韦尔奇的校正应用细胞因子表达谱比较仪数据处理CD73^低和CD73^高pMSC。结构(壁厚)和功能(回波参数)和抑制性数据(PSB603)与单向方差分析(方差分析)。差异被认为是重要的 。棱镜软件包(7.0版)是用于统计分析。

3所示。结果

3.1。非均匀的表达CD73 MSC

尽管CD73通常被认为是作为一个古典定义多功能间充质干细胞表面标记,我们发现CD73蛋白质不是同样表达新孤立的心包MSC。流式细胞仪显示CD73^高表达pMSC构成的一个子集,32.1%的耕地pMSC通道1(图1(一))。系统分析表明,异构CD73表达式还发现不仅在MSC pMSC也从其他来源:骨髓MSC (bMSC)承担19.2%,皮下脂肪MSC(超导公司)51.8%,脐带MSC (ucMSC) CD73的84.2%^高表达MSC(图2 (b)),暗示无处不在的不均匀现象CD73表达式MSC池内。免疫染色表明,不同族群的pMSC表现出强烈CD73表达式,而其余显示相对较弱的表达,不同的荧光强度(图5倍1 (c))。使用流式细胞仪分离的控制策略,我们细分pMSC分成两组细胞的人口:表达CD73在高级别上,称为CD73^高pMSC, CD73在低水平表达,称为CD73^低pMSC(图1 (c))。CD73表达的多样性进一步证实了qPCR分析(图1(d))。两个子集pMSC显示典型的鹅卵石形态和文化条件下的扩散同样具有类似population-doubling时间( vs。 天, - - - - - -9,图1 (e))。此外,这两种类型的pMSC表现出几乎相同的表面抗原表位(增刊。表1对肌原性的)和分化潜能,脂肪形成的,和成骨的血统(图1 (f))。因此,两个亚种群,分类根据CD73表达水平,在孤立的存在,培养pMSC。

3.2。增强在CD73修缮的房产^高表达pMSC

我们进一步赔偿的财产相比两个亚种群的pMSC小鼠心肌梗死模型。证明了他和小天狼星红染色midventricular部分(图2(一个)和5。图1),60分钟缺血心肌细胞造成巨大损失,随后胶原沉积,通常导致左心室的壁厚一样薄 mm在控制动物(MI-CON ,图2 (c))。注入CD73^低pMSC带来20%的改善壁厚后28天注入( 毫米, , ,图2 (c))。注入CD73相同数量的^高pMSC钢筋前壁厚度增加一倍( 毫米, , ,图2 (c)),尽管这两个细胞治疗没有改变心中的梗塞大小(增刊。图1)。值得注意的是,梗塞面积被众多可行的心肌细胞(图所取代2(一个)红色在他染色)。在这种背景下,注入CD73结构修复^高比由CD73 pMSC显然更加明显^低pMSC,进一步证实了超声心动图,健壮的前壁的增厚(星号图所示2 (b))。此外,结构性修复pMSC移植后容易转化为功能改善缺血性损伤(增刊。表2)。心脏射血分数(EF)和部分缩短(FS),作为全球收缩功能指标,在MI-CON老鼠(减毒 %, %, )并与CD73稍微提高了治疗^低pMSC ( %, %, , )。值得注意的是,老鼠接受CD73^高pMSC注入了重要的恢复EF和FS相比控制和CD73^低pMSC-treated动物( %, %, , ,图2 (d))。因此,只有CD73^高pMSC支持结构和功能效益,防止心脏功能恶化,支撑在MI心中CD73-dependent有益的影响。

3.3。由CD73抗炎作用产生^高pMSC

鉴于CD73能够保持酶的AMP转化为功能活跃的细胞外腺苷能形状的免疫反应心脏修复(18),我们检查心脏的炎症状态与pMSC治疗后5天。一个心脏免疫细胞(CD45总额⁺)是几乎一样的心对待两种pMSC ( % vs。 %, ,图3(一个))。在所有免疫细胞渗透,只有数量的粒细胞(Ly6G)显示CD73倾向于增加^高pMSC-treated心( %对 %, ,图3(一个));否则,其他免疫细胞包括T细胞(CD3人口⁺),B细胞(B220⁺),APC (MHC II⁺)和巨噬细胞(CD11b⁺)显示一个类似的两组动物要么CD73对待^低或CD73^高pMSC,表明免疫细胞成分不是pMSC治疗两种类型的改变。有趣的是,我们发现CCR2的数量⁺巨噬细胞(CD11b⁺/ CCR2⁺CD73)显著降低^高pMSC-treated心( ,图3 (b))。值得注意的是,CD73^高pMSC-treated心演示了一个增强的表达白介素4 (il - 4, ),白介素10 (il - 10, ),arginase-1 (Arg-1 ),和TGM-2 ( ),而TNF的表达α和NOS2减少。这些结果表明,尽管CD73^高pMSC治疗不会影响免疫细胞数量、渗透的比例调节本地移植免疫反应的几个重要的抗炎细胞因子的表达,抑制促炎细胞因子,这可能为一个proregenerative朝着心脏修复。

3.4。CD73调节巨噬细胞的分泌概要文件

分析CD73对免疫细胞的影响,我们进行了体外coculture实验,关注CD73活动巨噬细胞之间的相互作用。为此,我们也使用pMSC隔绝CD73基因敲除小鼠,基因缺乏CD73表达式(CD73^{- / -})作为消极的控制。如图4(一),当cocultivated CD73^高pMSC,腹膜巨噬细胞(pMϕ)明显调节一些抗炎细胞因子,包括il - 10(3倍, ),Arg-1(九倍, ),和VEGF(3.5倍, ),和表达下调促炎细胞因子,包括TNF -α(78%, )和干扰素-γ(58%, )相比安慰剂对照,而点ϕ与CD73 cocultivated^{- / -}pMSC没有显著改变细胞因子(图4(一))。结果显示每一个角色的高水平CD73表达产生抗炎巨噬细胞的表型,还可能出现一个场景可能在当CD73体内条件^高pMSC被移植到受伤的心。这个概念是由药理实验预处理的点ϕ的选择性拮抗剂A2b腺苷受体,PSB603,部分阻塞引起的il - 10的upregulation CD73 pMSC (32%, ,图4 (b)),恢复了对肿瘤坏死因子-抑制的影响α表达式(27%, ,图4 (c))。因此,我们在体外结果表明,细胞外腺苷,催化CD73的产物,作为一个中间调节器,大师免疫反应部分通过A2b受体的激活。

4所示。讨论

目前的实验揭示了非均匀CD73表达模式MSC与多样化的修缮的属性相关联,尽管CD73分子通常被认为是一个经典的定义间充质干细胞的表面标记。此外,我们的数据表明,CD73通过其催化细胞外腺苷的产物,形状局部免疫反应,可能是重要的在proregenerative铺平道路心脏修复。

4.1。CD73-Dependent免疫调节和心脏修复

虽然没有专门表面标记识别MSC人口在人类和小鼠,CD90、CD73和CD105是公认为积极的身份的隔离和扩张MSC (19]。然而,重要的是要注意,许多标记的细胞表面表达的差异可能是影响因素由副分泌细胞最初的文章,和一些标记的体外表达MSC并不总是与他们的体内表达模式9]。在这种情况下,我们发现CD73表达式,而异构MSC来自各种来源:从人类脐血MSC在最高和骨骨髓来源MSC在最低(图1 (b)),这表明非均匀表达CD73 MSC池中是一个普遍的现象。CD73表达式的异质性与其他表面没有联系制造商定义MSC人口(增刊。表1(图)或血统规范1 (f))。鉴于CD73表情免疫细胞损伤后局部免疫反应的关键调制器(20.),我们检查的意义CD73水平人群分类pMSC分成两组,即CD 73^低和CD73^高pMSC。我们体内的结果证明了CD73-enriched pMSC港口更加明显修复房地产CD73-weak-expressing细胞(CD73相比^低pMSC),功能链接到细胞外核苷的代谢能力,严格规范当地免疫反应(21]。因此,尽管MSC可能使用细胞因子释放,液,和其他手段来调节局部免疫反应,CD73-dependent purinergic信号也是很重要的授予修复受损心脏的房地产(图2)。

CD73,也称为ecto-5 - - - - - -核苷酸酶,是一种重要的细胞外膜蛋白,脱去磷酸腺苷酸生物活性腺苷酸导致从一个ATP-driven炎性环境转向抗炎环境(3]。心肌缺血发起一个时间序列的免疫反应,和不受控制的过度炎症往往阻碍了组织修复(22]。CD73发现交付^高pMSC收益良好的结构和功能效益CD73-mediated腺苷生产说明了一个重要角色在编排心脏炎症的一些抗炎基因调节,而炎性基因抑制(图3 (c))。这个结果符合的心等人最近的数据表明,CD73-enriched MSC封装在水凝胶的车辆增加了细胞外腺苷的生物利用度,减少心脏移植后的免疫反应在受损心肌(14]。因此,purinergic代谢可能工作与其他描述机制如旁分泌因子(6),线粒体/细胞器转移,和细胞外囊泡的形成23培养一种抗炎,proregenerative微环境(5),虽然这些机制之间的相对重要性和交互仍未解决的(2]。这一发现可能提供一个机械的解释不一致的公布的数据在使用不同的细胞捐赠者可能与CD73表达的强度(8),因此,MSC-mediated的一般术语“免疫调节”不同的表达水平CD73 MSC来自不同来源(14]。

4.2。CD73表达和抗炎活性

Ischemia-induced心肌细胞死亡发起一个在三个不同的炎症,但重叠,阶段,和个人的子集免疫细胞可能与相应的(3]。交付一个高水平的CD73确实出奇的没有影响免疫细胞的总量和单个细胞类型的细胞成分渗透到梗塞的心脏,这反映了免疫细胞的损伤的招聘是高度动态的,不能整体可视化由单个时间点(5天后MI)。然而,我们发现,浸润的巨噬细胞的一个子集(CD11b⁺/ CCR2⁺)减少。主要为CC趋化因子受体CCR2 CCL2 / MCP-1 Ly-6c表示^高单核细胞显示突出的促炎和实验功能在第一波的免疫细胞浸润(24]。因此,CD73的存在^高活动产生抗炎的环境优先衰减的招募巨噬细胞炎性表型。这个场景被进一步证实了PCR分析,显示抗炎upregulation基因和抑制促炎基因(图3 (c))。因此,交付CD73活动提示免疫反应的平衡,有利于proregenerative活动(20.,25]。

虽然细胞外腺苷的抗炎作用局部免疫反应已经深入调查(18,25,26),尚不清楚是否腺苷由CD73 MSC功能调节巨噬细胞的表型。因此,我们进行了一系列的coculture实验,证明CD73的存在^高pMSC造成一个健壮的一组抗炎基因的表达和腹膜巨噬细胞减少促炎基因的表达。值得注意的是,监管活动完全消失(CD73 cocultivated pMSC时缺乏CD73表达式^{- / -}pMSC),支撑CD73活动教育的义务的作用与特点类似极化M2巨噬细胞表型(27]。此外,我们表明,抗炎作用,在一定程度上由A2b受体(图的激活4 (b))。因此,我们在体外模拟体内的情况的数据表明,CD73活动仅需要创建一个抗炎环境可能为proregenerative心脏修复之路(2]。尽管分子基础为巨噬细胞在心脏修复的行为仍然了解甚少的(28),细胞因子和生长因子的分泌,调节成纤维细胞和血管细胞表型可能涉及(26]。

5。限制

我们知道一些限制在目前的实验。首先,只有选择面板的细胞因子测试到目前为止,并在不久的将来,全球转录分析需要屏幕在心脏组织分泌的细节和coculture样本。其次,腺苷可以刺激A1、负责和A3受体,只有A2b受体拮抗剂用于coculture实验。因为每个腺苷受体有不同的亲和力和激活不同的受体可能创建一个意义深远的细胞功能,预测个体腺苷受体激活的影响是复杂的,尤其是在高CD73活动的条件。在未来的研究中,使用缺乏表达的转基因小鼠巨噬细胞来源于个人的受体是可取的。

6。结论

我们的数据显示,CD73 pMSC的人群中不平等的表达,非均匀表达导致功能多样性:的一个子集CD73-enriched pMSC有利于心脏移植后赔偿的财产通过CD73-mediated监管当地的免疫反应。这一发现提供了一种可能的解释不一致的再生结果当不同来源供体细胞被用于细胞疗法,这可能与MSC CD73表达的强度。

数据可用性

原始数据和必要的细节可以提供相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

XL和XD构想概念,设计了实验,和解释数据。生理改变参与实验的pMSC隔离和表征CD73表达式通过流式细胞术和CD73的分离^高和CD73^低亚种。赫兹和生理改变进行动物实验,动物负责处理和超声心动图心脏功能评估。我们、JT和YZ获得所有的图像从体外和体内实验和执行所有的实验数据的统计分析。KT和LQ coculture试验和rt - pcr分析细胞因子的概要文件。ZD了概念性的建议和写的手稿。所有作者都阅读和批准了最终版本的手稿。张Kezhe Tan Hongtao朱,交流了同样的工作。

确认

作者要感谢教授尤尔根•施克拉德博士对他的建设性建议和批评在这个手稿。这项研究是由国家自然科学基金委的资助81570244中国FZ2017010社会发展基金会和SHW2015020镇江科技。

补充材料

增刊。表1:比较CD73表面抗原表位的^低和CD73^高pMSC。增刊。表2:超声心动图评估心肌梗死小鼠心脏功能的控制与CD73 (MI-CON)和治疗^低和CD73^高pMSC。 MI-CON相比; 和 CD73相比^低pMSC组。增刊。图1:梗塞大小的比较控制老鼠与CD73 (MI-CON)和治疗^低和CD73^高pMSC。Midventricular部分代表心脏与天狼星红染色胶原沉积(相关心肌损害)和量化的比例的总周长左心室壁。结果显示一个类似的梗塞大小的三组。(补充材料)

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