体外培养的自体上皮干细胞在基团交联胶原蛋白支架

文摘

目的。探讨重组人胶原蛋白的功效I型(RHC I)和collagen-like肽(CLP)水凝胶作为替代载体基质栽培的缘的上皮干细胞xeno-free文化条件下(LESC)。方法。人类LESC种植在七个不同collagen-derived水凝胶:(1)修改的RHC我,(2)fibronectin-patterned RHC我,(3)carbodiimide-crosslinked CLP (CLP-12 EDC), (4) DMTMM - (4 - (4 6-dimethoxy-1 5-triazin-2-yl) 4-methyl-morpholinium)交联CLP (CLP-12), (5) fibronectin-patterned CLP-12, (6)“3 d缘的niche-mimicking”CLP-12,和(7)DMTMM-crosslinked CLP由CLP更高浓度的解决方案。细胞增殖、细胞形态和LESC标记的表达进行了分析。所有的数据相比,文化对人类羊膜(火腿)。结果。人类LESC被成功培养六个水凝胶配方,与原代细胞培养CLP-12 EDC以来被认为是不成功的结果的面积(即不符合质量标准。14天后,结果不一致和融合)的文化。的融合,主要LESC显示高表达干细胞标记ΔNp63,增殖标志物细胞角蛋白(KRT) 14日,附着力标记整合素-β4和钙粘蛋白,LESC-specific层粘连蛋白-细胞外基质蛋白α1,胶原IV型。细胞显示低表达分化标记KRT3 desmoglein 3 (DSG3)。的基因表达明显高于KRT3观察细胞培养在CLP水凝胶相比,RHC我和火腿。水凝胶表面模式的影响扩散的模式,但没有显著影响表型和基因型的文化。总的来说,RHC我和DMTMM-crosslinked CLP水凝胶的性能相当于火腿。结论。RHC我和DMTMM-crosslinked CLP水凝胶,无论表面改性,支持成功的培养主要人类使用xeno-free LESC培养协议。HAM-based文化再生上皮保持相似的特征。

1。介绍

位于角膜巩膜的异色边缘,缘的上皮干细胞(LESC)振兴中发挥关键作用的角膜上皮和保持角膜健康,透明,无血管的1,2]。LESC损伤或因“角膜缘干细胞缺损干细胞利基可能导致(LSCD)。这种情况的特点是conjunctivalization和角膜愈合,可能会导致视力下降,疼痛和畏光3]。从历史上看,手术治疗的患者患有LSCD包括结膜缘的移植或keratolimbal同种异体移植物。

自1997年推出以来[4),因“角膜缘上皮移植栽培(CLET)已经证明是一种有效的治疗LSCD,临床试验报告的平均成功率为70% (5]。CLET,小缘的活检是体外培养干细胞载体,之后培养细胞被移植到病人的眼病。这些试验的干细胞载体最常用是人类羊膜(火腿)。收获通过剖腹产手术,火腿已经使用多年来在眼部手术6,7]。它的优点是具有抗炎,抗菌,抗血管新生属性(7,8]。然而,作为生物膜,火腿的采购需要昂贵的捐赠者筛查潜在传染性病原体(9]。此外,火腿的标准化程序困难是因为国米,intradonor在膜厚度、机械性能、光学特性和生长因子释放(10- - - - - -13]。此外,在体外处理仍然是劳动密集型的,昂贵的,和具有挑战性的9]。这些局限性阻碍了火腿在眼部组织工程中的应用。其他干细胞运营商如纤维蛋白和硅氧烷水凝胶隐形眼镜已经用于人类临床试验(5]。2015年,Holoclar®(意大利基耶西),一个缘的技术在细胞在纤维蛋白支架上,扩大是有条件地批准了在欧洲发布第一个商用LSCD干细胞疗法。然而,使用这种药品仅限于自体干细胞移植后在单方面的情况下化学或热灼伤。此外,纤维蛋白水凝胶异种的文化要求应用程序协议涉及鼠3 t3支线层,使最终产品的安全问题。因此,一个安全的和标准化的治疗目标所有LSCD患者尚未被开发。

各种生物材料已经被提议作为替代航母的火腿和纤维蛋白在角膜组织工程5,14]。一个有前途的方法是胶原蛋白水凝胶的应用程序,因为这些特点是固有的生物相容性和成本效益15,16]。2009年,群Fagerholm等人是第一个报告的成功植入非细胞重组人胶原蛋白类型III (RHC III)水凝胶交联1-ethyl-3 - (3-dimethyl aminopropyl)碳化二亚胺/ N-hydroxysuccinimide (EDC / NHS),角膜基质替代品在人类17]。在随后的报道中,RHC III-based水凝胶植入20例,胶原蛋白是来自酵母在每种情况下(18- - - - - -20.]。手术后,植入支持完整的上皮再生,尽管缓慢reepithelialization利率可以指出,与完整的上皮再生占用一年(20.]。额外的探索RHC III-based水凝胶显示表面改性,通过纤连蛋白微触印刷(F -μCP),改善reepithelialization率在体外(21]。尽管F -μCP RHC三世植入还有待验证在活的有机体内这些结果表明在collagen-based角膜表面改性再生的潜力。

近年来,选择胶原蛋白来源显示伟大的承诺在组织工程,包括完全合成collagen-like肽(CLP)和植物的RHC I型(RHC I) (22- - - - - -25]。中电控股(26]介绍了短和完全可定制的替代RHC三世肽。合成肽,CLP使准备好房间和扩大生产。当测试作为角膜构造在动物模型中,中电控股证明是功能与RHC三世,除了机械强度的CLP表现(27,28]。这些报告提供了一个概念验证,表明值得探索CLP的多功能性水凝胶为支架LESC种植。

另一种类型的胶原蛋白,最近成为可用的烟草植物的RHC我25]。尽管植物的RHC我表明承诺在实验皮肤工程和药物输送22,29日,30.),在眼部组织工程中的应用还有待验证。先前的研究比较了在体外和在活的有机体内性能yeast-extracted RHC我和第三RHC角膜的结构和得出结论,这两个材料执行相当类似,尽管RHC三世略微显示优越的机械性能(31日,32]。这些结果,结合胶原蛋白I型是最丰富的本地角膜基质蛋白(33),表明植物的RHC我可能在眼部组织工程提供更大的潜力。我们以前的研究表明,植物的RHC我水凝胶机械稳定,透明,nongenotoxic和展示良好的生物相容性在体外和在活的有机体内。尽管植物的RHC我和CLP水凝胶出现有前途的基质,这两个材料仍有待验证载体膜LESC种植。

因此,本研究的目的是调查在体外性能的4 - (4 6-dimethoxy-1 5-triazin-2-yl) 4-methyl-morpholinium氯(DMTMM)交联CLP水凝胶,EDC / NHS-crosslinked CLP水凝胶和EDC / NHS-crosslinked植物的RHC我水凝胶对永生的人类角膜上皮细胞(iHCEC)和主要人类缘的上皮细胞培养。表面形貌的影响以及水凝胶的模式进行了研究。所有数据比较火腿,当前在CLET黄金标准。

2。材料和方法

研究遵循赫尔辛基宣言的原则,通过安特卫普大学HospitalEthical委员会(EC: 14/30/319)。

2.1。材料

植物的RHC Collplant提供的我和聚乙二醇CLP(洛克锡安纳,以色列)和Ferentis(立陶宛维尔纽斯),分别。实验室塑料从VWR购买(美国宾夕法尼亚州,二),他一一Bio-One (Kremsmunster、奥地利),或PerkinElmer(美国沃尔瑟姆,MA)。除非另有规定,所有的无机盐,酶,基本的化学物质,特里同X, 4 ,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) N-hydroxysuccinimide (NHS), N - (3-dimethylaminopropyl) - N - - - - - -ethylcarbodiimide盐酸盐(EDC), 4 - (4 6-dimethoxy-1 5-triazin-2-yl) 4-methylmorpholinium氯(DMTMM)和CellCrown插入从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。材料从热费希尔科学(沃尔瑟姆)包括磷酸盐(PBS) PrestoBlue,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),角化细胞无血清培养基,生活/死染色设备,Alexa萤石®568酰肼钠盐,抗生素、甘油、超纯蒸馏水(DW)。最佳切削温度(10月)制定从樱花Finetek购买欧洲(Zoeterwoude、荷兰);硝基纸和过滤灭菌器来自默克密理博(达姆施塔特,德国);聚二甲基硅氧烷(PDMS)从道康宁(美国米德兰,MI);平衡盐溶液(BSS)从爱尔康(美国TX沃思堡);从CELLnTEC CnT-prime介质(CnT-PR)(瑞士伯尔尼);PBS /甘油Citifluor是从Citifluor有限公司(英国伦敦);和RNeasy迷你设备是从试剂盒(希尔登,德国)。人类血液纤连蛋白是通过哟蛋白质AB (Huddinge、瑞典)而牛纤连蛋白是由细胞骨架Inc .(美国科罗拉多州丹佛市)。 iScript™ Advanced cDNA Synthesis kit, SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix, and oligonucleotide primers were obtained from Bio-Rad (Hercules, CA, USA), unless stated otherwise. ΔNp63α底漆是购自Eurogentec(比利时列日)(表1)。抗体用于免疫组织化学和稀释补充表中列出S1。

2.2。细胞载体制备

2.2.1。人类羊膜

与伦理批准UZA伦理委员会(EC: EC: 14/30/319)并签署书面知情同意捐助者、羊膜获得女性接受剖腹产。火腿是低温贮藏和加工使用先前描述的方法(34]。总之,火腿剥蛋壳和清洗在BSS含有青霉素、链霉素和两性霉素b .当时夷为平地上消毒硝基滤纸和低温贮藏在1−80°C: 1解决方案包含DMEM和甘油。火腿是解冻前48小时使用盐水洗了三次,之后是50毫升嗜热菌蛋白酶处理解决方案(0.12毫克/毫升)8分钟去除羊膜上皮细胞。酶消化后,膜清洗后在0.01 PBS的取向膜进行了测试与前面描述的棉签技术(34]。de-epetheliazed表面被优越时,细胞膜是固定在一个interlockable戒指34]。原代细胞培养之前,火腿是沉浸在各自的文化中含有5%的人类AB血清藻种()至少24小时。

2.2.2。重组人胶原蛋白水凝胶

植物的RHC我获得了在10毫米盐酸作为解决方案。3:7纯溶液(100%)乙醇/胶原蛋白搅拌30分钟25°C,之后fibrillogenesis缓冲区(160毫米Na₂HPO₄和100毫米氢氧化钠pH值7.5)的比率增加了1:10 原collagen-HCl体积和搅拌2小时。Water-diluted EDC, NHS添加最后一个EDC 50毫米和100毫米NHS的浓度和搅拌24小时在4°C。所有使用电磁搅拌器进行搅拌在200 rpm。24小时后,多余的EDC与DW / NHS冲毁6周期。一个周期是由离心全速(10分钟,5.000 rpm),丢弃上层清液和resuspending 40毫升DW的胶原蛋白。在周期6,胶原蛋白悬挂被转移到一个聚四氟乙烯模具无菌罩下,空气干燥。当完全干,胶原蛋白凝胶收集并存储在100%的乙醇,直到进一步的使用。补液的凝胶是由5个人洗PBS,持续2小时。细胞培养,水凝胶三次浸泡2小时在各自的培养基和固定化CellCrown或interlockable戒指。

2.2.3。Collagen-Like多肽水凝胶

CLP多肽合成,结合挂钩马来酰亚胺,CLP-PEG水凝胶制备中所描述的研究伊斯兰教et al。21]。简而言之,500毫克的18%或12%的水溶液( )CLP-PEG在2毫升玻璃注射器,分发和EDC / NHS或DMTMM添加到注射器混合系统。摩尔CLP-PEG-NH的等价物₂:EDC 1: 2和EDC的摩尔比率:NHS是1:1。对于CLP-PEG-NH₂:DMTMM,摩尔比率为1:2。所有试剂都彻底铸造前混合水凝胶成薄的薄片。或者,水凝胶在PDMS成型模具表面形貌的50μ米宽,20μ米深的凹槽。CLP-PEG水凝胶的床单都切成15毫米直径圆盘用环钻和保存在PBS缓冲。水凝胶板厚度和沟地形测量使用奥林巴斯BX51直立显微镜配有Peltier-cooled Fview II CCD相机(奥林巴斯、东京、日本)。

细胞培养之前,CLP水凝胶浸泡在各自的培养基为96小时(4天)。CLP水凝胶不需要固定,允许细胞培养。

2.2.4。表面固化等

RCH我水凝胶水化在PBS和切成大约 大小的块。微触印刷(μCP)到RHC我和CLP水凝胶表面进行了如前所述[21]。短暂,本机表面羧基组RHC我和CLP-PEG水凝胶被激活通过应用EDC 10毫米和2.5毫米的NHS 0.1 PBS (pH值5.7)15分钟。然后洗水凝胶和新鲜PBS (pH值5.7)。每个样品的表面是干在N₂流,保持材料的大量水分。邮票的PDMS,矩形邮票( )用于RHC我和12毫米直径磁盘CLP-PEG印刷。突出30的邮票包含表面形貌μ与60米宽条纹μm之间的空间。他们签署了通过应用0.1毫克/毫升人类血液纤连蛋白的解决方案5分钟。模式可视化,油墨含有0.01毫克/毫升的HiLyte488 dye-marked纤连蛋白。签署后,PDMS压模被带进接触激活和干水凝胶表面为5分钟。随后,剩余的未反应的水凝胶表面钝化通过应用10毫米₃NH₂美国博尔德(分子生物科学有限公司)。样本用新鲜PBS (pH值8.0)缓冲储存在4°C,直到进一步的使用。

研究F -的再现性μCP图案,图案的水凝胶成像显微镜使用奥林巴斯BX51直立。荧光fibronectin-HiLyte488模式图像,使用流运动和分析软件(奥林巴斯)。纤连蛋白手动模式质量评估,使用缝合荧光显微镜拍摄的图像在整个印刷水凝胶表面。然后计算出的实际印刷面积减去任何缺陷的面积被地表地貌PDMS压模。

概述水凝胶组成及各自的缩写表提供2。火腿作为控制。水凝胶是(1)修改的RHC我,(2)RHC F -我μCP (RHC我F -μCP), (3) EDC / NHS-crosslinked CLP (CLP-12 EDC), (4) DMTMM-crosslinked CLP (CLP-12), (5) CLP-12表面F -μCP (CLP-12F -μCP),(6)与3 d-grooved CLP-12表面形貌(CLP-12 3 d),(7)和DMTMM-crosslinked CLP CLP股票(CLP-18)浓度的18%。

2.3。细胞培养

2.3.1。不灭的角膜上皮细胞培养

为在体外生物相容性测试,永生的人类角膜上皮细胞(iHCECs) [35)被播种到膜上,在无血清培养系统角化细胞培养。细胞培养在湿润37°C(5%股份有限公司₂孵化器。进行活细胞成像,绿色荧光蛋白(GFP),转导iHCECs (GFP-iHCECs) [21)都使用相同的培养培养协议。

2.3.2。主要缘的上皮细胞培养

收集的尸体供体眼睛角膜组织的安特卫普大学医院。供者年龄范围从49 - 90年的平均74年。所有捐赠的眼睛在32小时后期处理。简单地说,眼睛是无核的,在0.9%氯化钠,传输和存储在4°C。眼睛在0.5%聚维酮碘消毒1分钟,之后,他们在PBS漂洗4次。活检≤2毫米²来自上级伪劣keratolimbal地区和洗吗 在CnT-PR (CELLnTEC)在4°C。活检被放置上皮侧测试载体材料(表2)和培养14天在37°C, 5%的公司₂,95%的湿度。居住舱火腿和RHC我查看,1%是添加到培养基中。培养基是改变了每隔一天。第一个3天,细胞在气液界面培养,让活组织检查附件。起,介质的体积增加到淹没的文化。14天(如果支流或更早),细胞特征通过免疫组织化学和逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)分析。

2.4。体外生物相容性测试

评估在体外collagen-based水凝胶的生物相容性,6毫米直径的样本被穿孔的膜,放入96 -孔板。iHCECs被播种到每膜材料的密度5000个细胞( )和培养4天(96小时)。细胞培养在火腿作为控制。在24小时、48小时、72小时和96小时的培养、PrestoBlue细胞代谢活动分析是根据制造商的协议执行。总之,PrestoBlue添加(1:10 )文化和孵化的35分钟。上层清液被转移到一个不透明的96孔板,和荧光和维克多在590海里³。补充生活/死染色进行培养48小时,在细胞双沾钙黄绿素acetoxymethyl(钙黄绿素点)和ethidium homodimer-1 (EthD-1)。细胞培养的组织培养塑料(TCP)和0.1%处理皂素为20分钟37°C被用作EthD-1积极控制。对于PrestoBlue分析,独立的非参数 - - - - - -测试都使用了SPSS 24克鲁斯卡尔-沃利斯检验(美国IBM公司,纽约)和五棱镜(美国CA GraphPad软件)。 被认为是显著的。

评估的模式扩散,活细胞成像GFP-iHCECs [21]。15毫米直径的水凝胶样品放入12-well盘子。RHC我水凝胶与CellCrown插入固定。GFP-iHCECs被播种到材料的密度10.000细胞/膜。活细胞成像在孵化器执行安装在共焦激光扫描显微镜(Eclipse Ti显微镜,尼康、东京、日本;UltraVIEW VoX PerkinElmer)。显微镜图像记录在90分钟的时间间隔为3天(72小时)。获得的图像在72小时的文化进行了分析与ImageJ(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)来计算面积比例融合。每个文化的条件下,6个不同站点的图像进行了分析。检测统计意义,独立的非参数 - - - - - -使用Mann-Whitney执行测试测试在棱镜5(美国CA GraphPad软件)。活细胞成像并不表现为火腿复合移植不兼容显微镜设置。

经过72小时的成像、细胞保存在文化,直到第四天,当样本固定在2.5%戊二醛溶液在0.1钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4),处理和扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)。

2.5。电子显微镜

2.5.1。扫描电子显微镜

SEM、固定样本冲洗在7.5%蔗糖0.1甲次砷酸盐缓冲,pH值7.4,然后通过一个提升乙醇梯度脱水(50%乙醇10分钟;70% - 90% - 95%乙醇15分钟;100%的乙醇 )。临界点干燥后,样品被安装在扫描电镜网格和快门涂有20 nm黄金。图像记录SEM 515显微镜(飞利浦、埃因霍温、荷兰)。

2.5.2。透射电子显微镜法

样本后缀OsO在1%₄解决方案和脱水乙醇梯度(50% - 70% - 90% - 95%乙醇为15分钟,100%的乙醇 )。样本嵌入在嵌入812(电子显微镜科学,哈特菲尔德,宾夕法尼亚州),分段,沾染了柠檬酸铅。使用Tecnai G2精神BioTWIN显微镜检查幻灯片(范,埃因霍温,荷兰)在120千伏。

2.6。描述基本LESC文化

2.6.1。免疫组织化学

免疫组织化学,文化被固定在100%乙醇10分钟在-20°C和冲洗三次在PBS 10分钟。样本嵌入在10月化合物和存储在-80°C。5(13低温恒温器部分μ米厚的)每个样本都安装在poly-L-lysine-coated显微镜载玻片,在37°C干2小时,为荧光immunolabeling处理。部分被permeabilized Triton X 1% 25分钟。一夜之间,主要的抗体被孵化在4°C。Anti-ΔNp63 anti-cytokeratin 3 (KRT3)、anti-laminin anti-KRT14, anti-collagen IV型(Coll-IV) anti-integrin -β4 (INTB4) anti-desmoglein 3 (DSG3), anti-E-cadherin (E-cad)担任初级抗体(补充表S1)。荧光二、三级抗体标记孵化2小时在4°C。核复染色用DAPI,部分与Citifluor安装。用共焦显微镜图像记录。

2.6.2。RNA提取、逆转录聚合酶链反应

RNA提取之前,文化与0.1 PBS,冲洗一次预热在37°C。与RNA裂解缓冲细胞培养,细胞总RNA提取,之后RNeasy迷你Kit-enclosed指南。总RNA被稀释在14μL水,纯度是评估260/280比例的吸光度(1.80 - -2.00)使用NanoDrop™分光光度计(热费希尔科学)。10的互补脱氧核糖核酸合成μ总RNA的L使用iScript™先进的互补脱氧核糖核酸合成装备和CFX96™thermocycler (Bio-Rad),根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸是稀释10 ng /μL浓度和冷冻(-20°C),直到进一步使用。PCR检测进行从10 ng cDNA SsoAdvanced普遍SYBR绿色Supermix CFX96™thermocycler使用以下设置:30秒的激活步骤95°C和40放大周期的变性(5秒95°C)和退火/扩展(30秒60°C)。用表中列出的寡核苷酸引物1。所有的样品都在重复运行。确认他们的扩增特异性PCR产品受到融化曲线分析。nontemplate控制包含在所有实验,GAPDH基因作为内生控制规范化。比较循环阈值(Ct)方法,目标 ,被用来分析结果(36]。主要LESC培养在TCP 12-well盘子担任校准器控制和分配的值为1。结果报告为折叠upregulation或折叠时差别褶皱对这些变化是大于或小于1,分别。文化从四个不同的供体角膜为每个类型的水凝胶进行了分析。文化在水凝胶对火腿,donor-matched文化6捐助者包括火腿分析。

统计分析,线性混合模型之间安装占nonindependence观察在相同的水凝胶(即。interdonor变异)。在这个模型中,基因表达作为因变量,水凝胶组作为一个独立变量,随机拦截和供体角膜。固定效应的意义,测试零假设,结局是一样的在不同的文化基板在一个捐赠者,使用一个测试 - - - - - -测试与Kenward-Roger校正自由度。意义的固定效果观察的时候,进行事后分析和多重比较的图基校正。

3所示。结果

3.1。水凝胶生产和表面改性

所有水凝胶制造协议导致成功生产的水凝胶机械强劲。厚度值的胶原蛋白水凝胶不同团体之间的如下: RHC我, 对于CLP-12 EDC, CLP-12(包括CLP-12 F -μCP), CLP-12 3 d, CLP-18水凝胶。我们现在可以确认薄RHC我和CLP-12膜能够成功进行F -μCP(图S1与表面质量的模式),高CLP ( )比RHC我( )水凝胶。表面形貌在CLP水凝胶被认为是成功的水凝胶完好无损并显示槽宽度接近 亮视场显微镜。

物理特征(表3;补充数据”membranes-Fig载体的物理特性。S2”)表明,胶原蛋白水凝胶的含水量(%)变化在88%和93%之间,说明胶原蛋白的类型,类型的交联剂,中电控股的比例并没有多大的区别。胶原水凝胶的透光率远远高于火腿,值是与本地眼角膜。透明的CLP水凝胶(≥91%)高于RHC我水凝胶( )。胶原水凝胶的折射率(1.34 - 1.35)接近的人类角膜(1.37 - -1.38)相比,火腿(1.33)。水凝胶的渗透性相当的火腿,当前使用的黄金标准。

3.2。在体外水凝胶的生物相容性测试

在第一组实验中,iHCECs培养在不同的基质和细胞代谢活动的监控。PrestoBlue试验(图1)显示,细胞代谢活动相当的基质。补充生活/死染色在48小时postculture证实胶原水凝胶的生物相容性细胞表现出最小的细胞死亡细胞死亡在水凝胶和类似或低于火腿(图S3)。

活细胞成像证实RHC我和CLP水凝胶,无论表面改性,支持附件和增殖的细胞(图2)。细胞被发现连接到各自的水凝胶播种后3小时,水凝胶组之间比较。F -μCLP水凝胶CP似乎影响细胞增殖,与RHC我水凝胶不同,作为细胞表面上的第一附加到纤连蛋白条纹之前填充其余的CLP水凝胶(图2 (b))。CLP-12 3 d细胞显示优先生长第一凹槽,在水凝胶的隆起(图蔓延2 (b))。在72小时的文化、细胞培养在CLP DMTMM水凝胶显示细胞的融合≥80%平均融合 CLP-12, 对于CLP-12 F -μCP, CLP-12 3 d, 对于CLP-18(图2 (c))。的平均融合RHC我和RHC F -μCP是 和 ,分别与RHC我显示相比大大减少融合CLP DMTMM水凝胶和RHC我F -μCP不汇合的CLP-12, CLP-12 3 d, CLP-18(图2 (c))。最低的平均观察融合CLP-12 EDC ( ),2网站显示一个融合的< 10%(数据没有显示)。

经过4天的培养,SEM成像(图3)进行区域已经达到完全融合。培养细胞表现出典型的鹅卵石外观;然而,在RHC我水凝胶,一些孤立的细胞显示一个细长的形态。细胞在一个地区没有达到完全融合CLP-12 3 d水凝胶,细胞主要是观察到的凹槽,而不是水凝胶的山脊上。TEM影像(图4文化)证实,单层细胞已经形成的所有基质和细胞显示顶端微绒毛。此外,它指出,细胞培养在胶原蛋白水凝胶没有开始分化,而细胞培养火腿缝隙连接在缺乏分层表达,表明早期分化。

3.3。培养和初级LESC文化的特征

共41 22捐助者眼里,平均捐赠的时代 年(范围49 - 90年),被用于这项研究。分析了培养的上皮细胞与相差显微镜(图每2天5)。第三天的文化,从83%上皮细胞出现的缘的活检。外植体,并不能证明成功的第三天以后不显示细胞产物。无显著差异,成功启动外植体培养观察不同基质(数据没有显示)。在第一周的培养,细胞培养表面改性CLP水凝胶独特的扩散模式(图显示5(一个))。按照观察活细胞成像,先驱细胞纤连蛋白模式,殖民的中间区域在接下来的几个小时和几天。同样,细胞在三维水凝胶增长第一沟槽扩张脊。文化(图14天5 (b)),结果在所有基质包含小和立方epithelial-like细胞不同细胞的大小。细胞培养的火腿保持较小的圆形细胞培养相比,水凝胶。相比之下,细胞培养RHC我和RHC F -μCP显示更多的异构与奇异细长的细胞形态学观察之间的简单的鳞状上皮细胞生长。第14天,所有文化CLP DMTMM附近水凝胶已融合在15毫米直径凝胶。相比之下,没有一个CLP-12 EDC水凝胶达到融合;此外,3的9文化生成细胞收益率太低作进一步鉴定,5个9的文化不符合最低8毫米直径的产物,被认为是一个在我们中心质量标准。在第14天,RHC我和RHC F -μCP文化显示平均细胞产物> 15毫米,而火腿文化达到了subconfluence在14日至15日毫米直径。

3.3.1。免疫组织化学特征

(1)干细胞标记物的表达。培养细胞的具备干细胞与ΔNp63和KRT14(图验证6)。标记都归因于祖上皮细胞的基底和suprabasal层异色边缘(38- - - - - -40]。细胞培养基质的任何显示核染色ΔNp63 KRT14细胞质染色。没有直接观察表达模式的差异不同的基质。

(2)表达分化标记。KRT3和DSG3用作角膜上皮细胞分化标记。KRT3细胞质角质,已被证明是特定于角膜上皮(41],DSG3细胞桥粒的糖蛋白组成部分[42,43];这两个标记显示differentiation-related表达式。培养细胞显示低表达的标记,只有一些孤立KRT3或DSG3阳性细胞。双重染色ΔNp63证实DSG3-positive细胞缺乏干细胞标记(图的表达式6火腿)。的表达模式测试支架之间的可比性。

(3)细胞外基质蛋白的表达和细胞粘附标记。层粘连蛋白和Coll-IV被描述为人类角膜的细胞外基质和基底膜组件和异色边缘42,44]。发现细胞外表达的标记,表明沉积的层粘连蛋白和Coll-IV培养细胞在各自的衬底(图6)。Coll-IV火腿(也是一个关键的组成部分45Coll-IV-positive染色),所示的火腿基质(图6)。INTB4和E-cad提出调解细胞基底上皮细胞的锚定,INTB4表达式是局限于LESC [43,46)和钙粘蛋白表达更具体的基底和suprabasal角膜上皮细胞(47]。这两个标记显示阳性膜培养细胞中表达。INTB4表情似乎局限于基底的一面,而E-cad表达式更加分散,细胞质中表达和基底和顶端。没有明显的差异表达的模式指出之间的基板进行测试。

3.3.2。缘的上皮基因表达和角膜上皮细胞制造商

与众议院保持基因,GAPDH,作为内部控制和细胞培养在TCP校准器,RT-qPCRΔNp63显示积极的表达α,DSG3 KRT3 INTB1, INTA6(图7)。整合素-β1、整合素-α6,祖特异性粘附蛋白(43]。团体之间的统计上的显著差异只是观察KRT3表达式(图7)、RHC我RHC我F -μCP和火腿CLP水凝胶相比,表达水平明显降低。更具体地说,显著降低KRT3表达闻名RHC相比我任何CLP水凝胶,而低表达指出RHC我F -μCP CLP-12相比,F -μCP、CLP-12 3 d和CLP-18和火腿CLP-18相比。此外,这一趋势( )观察低KRT3火腿的表达比CLP-12 F -μCP和RHC CLP-12 3 d和F -μ比CLP-12 CP。相对折叠基因表达的变化(表被列为补充数据S2)。

4所示。讨论

CLET一直是一个重大突破治疗患有LSCD [4,5,14]。然而,协议LESC种植需要进一步优化和标准化,因为他们通常涉及动物补充剂,如生长因子、血清和/或纤维母细胞支线层(48),所有这些都可能引起人畜共患病,过敏等副作用(49]。在GMP法规,干细胞载体和文化协议都应该满足严格的质量方针。尝试了从文化协议[删除异种的产品5,50,51为了实现标准化。标准化火腿、载体材料最常用在CLET,仍然是具有挑战性的,因为它的特点是物理化学性质有很大的差别(10- - - - - -13]。

中电控股和RHC我都源自xeno-free源和光学透明,机械稳定,生物相容性在活的有机体内(27,28]。CLP-12 EDC水凝胶显示伟大的承诺作为一个非细胞角膜构建在活的有机体内(27,28]。然而,EDC / NHS交联是太快,让成功的铸造生产薄水凝胶(< 300μ(厚)52]。生成一个灵活和薄支架,我们使用DMTMM是一种另类的交联剂。其他组已经证明的效率DMTMM EDC / NHS的交联肽和葡糖氨基葡聚糖DMTMM导致较慢的交联时间,因此更多的同质水凝胶(53]。类似于EDC / NHS, DMTMM是一个长度为零的交联剂,这意味着它不纳入脚手架。DMTMM的优点是不需要酸碱控制或导致转移反应通过EDC / NHS期间,确保产量和生物相容性好的反应(53,54]。在这项研究中,我们使用DMTMM交联胶原蛋白衍生品(55和测试它在体外的性能。RHC我没有交联与DMTMM因为我们先前的研究表明,EDC / NHS-crosslinked RHC我凝胶所需的厚度(< 150μ米厚)和灵活性。

我们的数据表明,RHC我和CLP水凝胶,无论类型的交联剂,支持iHCECs和初级缘的上皮细胞的培养。CLP-12 EDC,然而,测试是唯一的载体材料主要缘的上皮文化不符合质量标准由于细胞产量较低。有趣的是,我们之前的数据显示,CLP-12 EDC可能是一个合适的非细胞替代传统角膜探讨(27]。工作的Jangamreddy et al .,我们指出,次优增长iHCECs天1和2在CLP-12 EDC水凝胶不一定转化为劣势在活的有机体内性能(27]。毕竟,非细胞CLP-12 EDC眼角膜支持功能reepithelialization当植入猪。此外,CLP植入表现同样RHC III-based水凝胶,其中后者已经成功被植入人类[18,20.]。尽管如此,我们已经表明CLP-12 EDC不太适合标准化在体外培养初级缘的上皮。相反,RHC我水凝胶达到质量标准的细胞为主要缘的文化产物,尽管相比显著降低iHCEC文化融合观察CLP DMTMM水凝胶后3天的培养。这种差异可能是由于这一事实iHCECs显示显著改变基因组资料主要缘的上皮细胞(56]。这个结论时必须仔细考虑通过使用获得的数据。

在我们的实验中,表面改性的RHC我不影响细胞增殖的模式,这可能归因于RHC[固有的生物相容性18- - - - - -21,27,31日,32,57,58]。即使表面改性的CLP DMTMM水凝胶的影响细胞增殖的模式,结果和培养细胞的基因型和表现型没有显著改变。因此可以认为表面图案RHC我和CLP DMTMM水凝胶可能不必要的达到成功LESC-enriched文化在体外。我们的结果证实这项发现Hogerheyde et al。59),纤连蛋白涂层的丝素蛋白膜没有显著提高细胞基本LESC iHCECs或产物。相反,我们的结果是矛盾的先前的研究显示的好处纤连蛋白模式的载体膜细胞增殖iHCECs [21,60]。研究伊斯兰教的et al .,类似的纤连蛋白模式协议被用来在我们的研究中;然而,感兴趣的膜RHC III-MPC anti-Ki67, anti-focal黏附激酶,anti-integrin -β1被用作抗体在免疫组织化学特征21]。

2013年,万象集团等人介绍了筏(真正的3 d组织架构)水凝胶、胶原蛋白构造通过塑料压缩牛I型胶原蛋白的产生,作为一个在体外模型的人类角膜(61年]。模仿缘的隐窝,3 d槽了水凝胶的表面(筏TE)。筏TE成功支持缘的上皮细胞培养;然而,有限的临床影响,因为筏缺乏化学交联,从而导致异构水凝胶与次优的光学和机械性能(61年- - - - - -63年]。此外,生物相容性筏凝胶还有待验证体内。

相比我们的研究中,提到的报告(21,59- - - - - -62年)缺乏(i)广泛的表现型和基因分型培养的主要细胞,(ii)相比,火腿,CLET载体的选择,和/或(iii)实现xeno-free标准化种植协议;所有这一切表明optimization-described技术的进一步需求。

我们所知,我们是第一个培养主要人类缘的上皮细胞在胶原蛋白水凝胶使用xeno-free和完全标准化的文化协议。CnT-PR介质是GMP-grade培养基被有选择地开发目标的祖细胞上皮血统和抑制增殖的细胞间质血统(50,64年]。通过使用GMP-grade培养基,提出培养协议可以相对轻松地转化为临床设置。在我们的设置中,14天内主要细胞逐渐融合的文化,除了CLP-12 EDC,没有添加3 t3支线层或外源性物质。RHC我水凝胶只能成功支持主要细胞居住舱1%时添加到培养基中。CLP水凝胶,无血清培养基获得,但水凝胶必须浸泡在培养基至少4天持续展示外植体结果(数据没有显示)。

疣状显示,培养细胞低表达分化标记KRT3 DSG3和高表达的祖ΔNp63标志,标记KRT14扩散,附着力标记INTB4 E-cad。此外,细胞细胞外基质和基底膜蛋白层粘连蛋白沉积和Coll-IV。这种模式的蛋白质表达强烈表明,细胞培养的运营商可以确定为LESC [38- - - - - -43,46,65年]。E-cad表达式仍然主要是胞质,与细胞膜定位在一定程度上。这种模式的染色显示E-cad表达式并没有达到最大,表明细胞在一个相对未分化状态。在体外补充与CaCl₂(图S4)表明,E-cad表达主要位于细胞膜,细胞开始分化。尽管非特异性ΔNp63抗体被用于免疫组织化学,目标是所有三个ΔNp63亚型(α,β,γ),以前的工作从Di人工et al。39]表明LESC严格控制α同种型而不是β-或γ亚型。角膜上皮分化而另一方面不包含任何的亚型。在PCR分析中,一个特定的ΔNp63α使用底漆。

除了KRT3以外,其他标记目标与rt - pcr显示类似的不同群体之间的表达式。一般来说,一个重要的差异之间的相对表达KRT3 CLP RHC我观察水凝胶,RHC组显示低表达。KRT3 CLP水凝胶的表达水平大大低于观察角膜上皮(> 2500;数据未显示)在体外分化缘的上皮细胞(图S4)。将基因表达模式的角度分化细胞表明水凝胶都表现得非常好,RHC我略优于CLP DMTMM。目前尚不清楚是否降低KRT3表达式是固有RHC我水凝胶或必须归因于调整文化hAB补充协议涉及到1%。我们的结果和冈萨雷斯等人的数据表明居住舱的浓度,超过载体材料,可能会影响分化的水平(51]。最后,应该注意的是,KRT3 mRNA表达相对较低(Cq值:27-38)比其他调查标记(Cq: -)。因此,mRNA表达可能不会出现在足够的数量来促进蛋白表达,因此,KRT3-negative LESC文化包含IHC染色。数据通过在体外分化证实这一理论,mRNA的表达KRT3导致KRT3蛋白质检测(图S4)。

主细胞和iHCECs都缺乏空运和CaCl培养₂补充,因此没有启动分化和分层(66年- - - - - -68年]。这可能被视为一个限制我们的研究,因为大多数方法用于建立缘的上皮文化支持终端具备干细胞分化在保护(69年- - - - - -71年]。然而,对于长期恢复受损的眼部表面,保护LESC人口文化过程中可能需要和postgrafting [4,39,51,66年- - - - - -68年,72年- - - - - -74年]。之前的研究使用一个在体外筏TE模型得出的结论是,空运是不需要维护一个功能性上皮细胞在胶原蛋白水凝胶和ΔNp63更高的收益率α阳性细胞获得nonairlifted文化(74年]。在我们的研究中,我们提供的证据表明,细胞在其未分化LESC CnT-PR成功持续培养状态,不仅在火腿51),但同样在collagen-based水凝胶。此外,细胞培养CnT-PR维持他们开始分化的能力,简单的通过增加1.1毫米CaCl₂培养基(图S4)。

最后,它应该强调collagen-based水凝胶是高度可调,从前在CLET创造了机会。首先,胶原蛋白水凝胶的厚度可以调整解决深层角膜疾病,从而降低二次角膜移植post-CLET的必要性。这将是一个相当大的优势其他载体材料,如火腿、蚕丝蛋白、硅氧烷水凝胶,fibrin-coated隐形眼镜(4,5,75年,76年]。其次,支持小众缘的msc和黑色素细胞等细胞可以被纳入允许coculture niche-related细胞的胶原蛋白水凝胶。Cocultures可能发挥重要作用在维护一个巨大LESC人口通过改进拟态的原生干细胞利基(74年,77年]。然而,长期生存支持小细胞和可能的临床效益仍有待验证在活的有机体内。第三,胶原蛋白水凝胶表面模式提供更多机会,这是一个完全可定制的过程。虽然我们的研究结果并不表明短期利益在体外培养LESC、表面模式可能导致理想的微环境长期LESC增殖和保护。除了F -μCP和3 d制造、其他团体提出表面拘束和批量整合层粘连蛋白,胶原蛋白类型III, Coll-IV, IKVAV, YIGSR, RGD, vitronectin [46,59,78年,79年]。所有这些可能性都支持的承诺胶原水凝胶在组织工程中,不仅在眼科还骨科等其他学科(80年,皮肤81年),和心脏病82年]。

5。结论

根据我们的研究,我们得出结论,RHC我和CLP水凝胶成功的支持在体外iHCECs和初级LESC修养。相比,火腿、原代细胞培养RHC我和CLP DMTMM水凝胶显示可比性(I)细胞和(2)ΔNp63产物α阳性细胞率。我们提供的证据表明,表面图案,通过3 d造型或F -μCP,影响细胞连接和细胞增殖CLP DMTMM水凝胶但我不是RHC水凝胶。我们的研究结果表明,表面模式不会影响细胞表型和基因型,但它可能是表面模式的临床意义可能只在一个变得明显在活的有机体内设置。最后,原因未知,CLP-12 EDC水凝胶导致次优的原代细胞培养和表现相比其他运营商进行测试。总之,RHC我和CLP DMTMM保证LESC的培养和促进文化的发展协议载体材料和培养技术xeno-free并完全标准化。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

房车和MG是创始人,多数和少数股东UAB Ferentis分别。UAB Ferentis CLP-PEG水凝胶技术专利,WO2016/165788A1。

作者的贡献

娜扎卡里亚,伊莎贝尔Pintelon,玛丽-何塞Tassignon同样导致了这项工作。

确认

我们感激地承认研究基金会的资助弗兰德斯(FWO - 11 zb315n), EuroNanoMed2(再生),欧洲科学技术合作(EU-COST BM1302),泰克(芬兰资助机构的创新),坦佩雷大学研究生院医学和生命科学研究基金在眼科,立陶宛和研究委员会(格兰特EuroNanoMed2-01/2015)。作者感谢Nezahat Bostan和莎拉阿克采购的人羊膜和尸体供体的眼睛。我们感谢苏菲塞斯,Elien南通,Carine舞姿最美的贡献在电子显微镜和彼得Verstraelen和德维尔潘(Dominique De Rijck协助共焦显微镜。Erik Fransen承认qPCR执行统计分析的数据。从Ferentis AgnėVailionytė和GintarėGarbenčiūtė感谢CLP水凝胶和执行F -的生产μ分别CP。Tsvika Shtein和阿米特Yaari希伯来大学的雷承认生产RHC我水凝胶。

补充材料

补充1。图S1:表面改性RHC我和DMTMM-crosslinked CLP-12水凝胶。荧光显微照片RHC我(a)和CLP (b)水凝胶表面改性与488纳米荧光纤连蛋白。SEM图像(c) CLP-12 3 d水凝胶的凹槽50μ米宽,20μ米深。

补充2。“membranes-Fig载体的物理特性。S2:物理特性的测试方法和结果的载体材料。图S2是累积的插图的渗透性检测胶原水凝胶和火腿。

补充3。图S3:生活/死染色iHCECs培养在各种载体膜。

补充4。图S4:描述主要缘的体外分化的上皮细胞。

补充5。表S1:抗体免疫组织化学分析中使用。

补充6。表S2:相对折缘的上皮细胞培养的基因表达变化在不同的载体材料。

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